高產果糖基轉移酶的黑曲霉全細胞固定化條件優化

摘 要：采用包埋法固定化高產果糖基轉移酶的黑曲霉全細胞，以海藻酸鈉－殼聚糖為載體，分別通過單因素和正交試驗優化，獲得最佳固定化條件。單因素優化試驗結果表明：海藻酸鈉最適濃度為2%，菌體包埋量最適為150g·L?1，殼聚糖和CaCl2最適濃度均為4%。正交試驗結果表明：海藻酸鈉濃度為3%，菌體包埋量為200g·L?1，殼聚糖濃度5%，CaCl2濃度為3%時，酶活回收率可達到最佳的74.7%。驗證試驗表明該固定化細胞連續進行7個批次合成低聚果糖的催化，仍有96.85%的殘余活力，具備很好的應用潛力，為合成低聚果糖提供了新的技術路線。

關鍵詞：果糖基轉移酶；低聚果糖；黑曲霉；固定化細胞

中圖分類號：TQ925 文獻標志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）06?0024?05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.06.005

收稿日期：2024?05?04

作者簡介：余超凡，男，2000年生，碩士研究生，主要從事酶工程、分子動力學模擬方面研究。

＊通信作者：鄭毅，男，1970年生，博士，副教授，主要從事微生物工程方面研究（E-mail：eyizheng@fjnu.edu.cn）。

基金項目：國家現代農業（糖料）產業技術體系建設專項（CARS-170501）；校大學生創新訓練計劃項目（cxxl-2024271）。

Optimization of the Conditions for Whole-cell Immobilization of Aspergillus niger with High Yield of Fructosyltransferase

YU Chao-fan，ZHOU Ming-yang，TANG Shu-ling，WU Ying-zi，LI Jun-peng，Lü Zi-jian，HE Wen-jin，ZHENG Yi＊

（College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou，Fujian350117，China）

Abstract：The whole cells of Aspergillus niger with high yield of fructosyltransferase were immobilized by using the embedding method.Then，the sodium alginate-chitosan was used as the carrier，and the optimum immobilization conditions were obtained by using the single factor and orthogonal experiment optimization，respectively.The single-factor optimization test results showed that：the optimal concentration of sodium alginate was2%，the optimal quantity of bacteria embedded was150g·L?1，and the optimal concentrations of chitosan and CaCl2were both4%.The results of orthogonal test showed that when the concentration of sodium alginate was3%，the quantity of bacteria embedded was200g·L?1，the concentration of chitosan was5%，and the concentration of CaCl2was3%，the recovery of enzyme activity could reach the optimal74.7%.The validation test showed that the immobilized cells were catalyzed for the synthesis of fructooligosaccharides in seven consecutive batches，and still had96.85%residual activity，which had good potential for application and provided anew technical route for the synthesis of fructooligosaccharides.

Key words：Fructosyltransferase；Fructooligosaccharides；Aspergillus niger；Immobilized cells

低聚果糖（Fructo-oligosaccharides，簡稱FOS）是一種重要的功能性低聚糖，隨著健康飲食觀念的普及，FOS憑借其多種優良的生理特性（如益生元功效、低熱值、促進礦物質吸收、抗癌等），近年來逐漸引起了人們的高度關注[1]。

FOS的生產是以蔗糖為底物通過果糖基轉移酶催化合成，果糖基轉移酶主要通過微生物發酵獲得，黑曲霉是該酶重要的生產菌株。由于果糖基轉移酶是一種典型胞內酶，酶的提取制備成本高，而且游離酶無法重復利用，嚴重影響了終端產品制造的用酶成本，束縛的產業了發展[2]。利用固定化細胞技術制備催化劑，采用物理或化學方法進行全細胞酶的固定化，不僅省略酶制備的提取工序，降低生產成本，同時可實現酶的重復與連續使用，降低了終端產品生產的用酶成本，保障該工藝的可持續性。固定化細胞有助于穩定細胞內環境，維持酶的原始活性，并增強對復雜外部環境的抵御能力[3?4]。例如，高放等[5]以PVA-海藻酸鈣為載體包埋黑曲霉細胞，發現通過固定化細胞催化，可實現了低聚果糖的高效生產，同時簡化產物分離過程，為低聚果糖生產帶來便利和效率提升。總體上，固定化細胞生產低聚果糖的相關研究報道較少，本研究基于成功獲得果糖基轉移酶高產菌株黑曲霉（Asper-gillus niger）FS054的前期工作基礎上，擬采用海藻酸鈉-殼聚糖為載體包埋法固定黑曲霉細胞，優化固定化工藝參數，制備全細胞固定化催化劑，為低聚果糖生產提供新技術方案。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1微生物菌種 本實驗室保藏的黑曲霉（Aspergillus niger）FS054。

1.1.2培養基 （1）斜面活化培養基：蛋白胨5g·L?1，酵母提取粉2g·L?1，葡萄糖20g·L?1，K2HPO41g·L?1，MgSO4·7H2O0.5g·L?1，瓊脂粉14g·L?1，pH6.4，115℃滅菌30min。（2）種子培養基：蔗糖156.65g·L?1，酵母浸膏42g·L?1，NH4Cl1.68g·L?1，NaH2PO41g·L?1，NaCl0.5g·L?1，pH5.5。（3）發酵培養基：蔗糖156.65g·L?1，酵母浸膏42g·L?1，NH4Cl1.68g·L?1，NaH2PO41g·L?1，NaCl0.5g·L?1，pH5.5。

1.2試驗方法

1.2.1黑曲霉全細胞固定化單因素試驗 將2%海藻酸鈉與菌絲體細胞按照1：9比例震蕩混合均勻，使用1mL無菌注射器將混合液以恒定速率滴入CaCl2-殼聚糖混合液（2%CaCl2溶液+1%殼聚糖溶液）中，待形成光滑小球后于4℃固定2h，取出固定化細胞小顆粒后，用去離子水洗滌至pH中性，放置4℃保存備用。單因素試驗：（1）海藻酸鈉濃度對全細胞固定化的影響。初始制備條件的基礎上，選擇海藻酸鈉不同濃度（1%、2%、3%、4%、5%），制備固定化細胞，根據固定化細胞的單位酶活，確定最適濃度。（2）CaCl2濃度對全細胞固定化的影響。海藻酸鈉濃度最佳選擇的基礎上，選擇CaCl2不同濃度（1%、2%、3%、4%、5%），制備固定化細胞，根據固定化細胞的單位酶活，確定最適濃度。（3）殼聚糖濃度對全細胞固定化的影響。海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度最佳選擇的基礎上，選擇殼聚糖不同濃度（1%、2%、3%、4%、5%），制備固定化細胞，根據固定化細胞的單位酶活，確定最適濃度。（4）菌體包埋量對全細胞固定化的影響。海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度及殼聚糖濃度最佳選擇的基礎上，選擇不同細胞包埋量（50、100、150、200、250g·L?1），制備固定化細胞，根據固定化細胞的單位酶活，確定最適濃度。

1.2.2黑曲霉全細胞固定化條件正交試驗 在單因素試驗的基礎之上，對海藻酸鈉、菌體包埋量、殼聚糖濃度、CaCl2濃度進行4因素3水平正交試驗設計，以獲得最佳的固定化條件，試驗因素水平設計見表1。

1.2.3固定化黑曲霉細胞重復使用對酶活性影響試驗 將在最佳工藝條件下制備的黑曲霉固定化細胞連續進行7個批次催化合成FOS，每次反應結束后，測定殘余酶活，并用相對酶法表示。

1.3指標測定

1.3.1低聚果糖檢測 采用HPLC法，參考國家標準GB/T23528-2009《低聚果糖》[6]。

1.3.2果糖基轉移酶的酶活測定 在裝有20mL的100g·L?1蔗糖溶液（0.05mol·L?1pH5.0醋酸磷酸鈉緩沖液）的三角瓶，經55℃恒溫水浴預熱10min后，加入定量固定化酶，于200r·min?1的恒溫水浴振蕩器反應1h。反應結束后沸水浴滅酶10min終止反應，用HPLC法檢測上清液蔗果三糖含量，計算酶活力。酶活力定義：在pH5.0、55℃條件下，每分鐘生成1μmol蔗果三糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.4數據分析利用Excel2016對數據進行統計分析和作圖。

2結果與分析

2.1黑曲霉全細胞固定化單因素結果

2.1.1海藻酸鈉濃度 由圖1可知，海藻酸鈉濃度1%～2%時，單位酶活逐漸上升，在濃度2%時單位酶活高達58.24U·g?1，顯著高于其他濃度組。

之后隨著海藻酸鈉濃度的增加，單位酶活開始下降。海藻酸鈉分子可與鈣離子交聯形成固態顆粒，其濃度是固定化小球結構致密性的關鍵。低濃度下，固定化膜強度不足，導致小球在水中穩定性降低，易于解體；濃度過高則增加溶液黏度，使載體與菌體細胞混合困難，更不易成型；此外，過高的致密性可能導致包埋的菌體細胞與底物接觸效率降低，從而影響酶的催化活力。因此，為確保固定化小球結構的穩定性和效能，必須謹慎選擇適當的海藻酸鈉濃度，此外海藻酸鈉濃度也會影響到固定化細胞的酶活[7]。綜上，最終選擇海藻酸鈉濃度為2%。

2.1.2CaCl2濃度 海藻酸鈉分子與鈣離子交聯反應是形成固定化小球的關鍵，張菡等[8]研究了CaCl2濃度對固定化酵母發酵的影響發現，CaCl2濃度適當提高可以增強固定化酵母顆粒的強度，但過高的濃度會降低其通透性，影響發酵性能。由圖2可知，CaCl2濃度從1%增加到5%時，固定化小球單位酶活先增后減，當CaCl2濃度為4%時，單位酶活最高達到80.28U·g?1，顯著高于其他濃度組。綜上，最終選擇CaCl2濃度為4%。

2.1.3殼聚糖濃度 殼聚糖作為固定化酶載體，濃度對固定化酶活性及穩定性有重要影響。適當濃度的殼聚糖能提高細胞或酶的固定化效率，濃度過低可能效果不佳，過高則增加成本并影響底物和產物的擴散。適宜的殼聚糖濃度能增強酶的熱穩定性和操作穩定性[9?10]。由圖3可知，殼聚糖濃度為4%時單位酶活可達107.24U·g?1，顯著高于其他濃度。綜上，最終選擇殼聚糖濃度為4%。

2.1.4菌體包埋量濃度 由圖4可知，菌體包埋量為150g·L?1時，單位酶活可達109.98U·g?1，顯著高于其他試驗組。當菌量濃度過高時，由于固定化載體的包裹空間有限，過量的菌體細胞會影響酶與底物的接觸面積，并降低底物和產物的擴散速率，反而會導致酶催化效率的下降[11]。綜上，最終選擇菌體包埋量為150g·L?1。

2.2黑曲霉全細胞固定化條件正交試驗結果

由表2可知，對黑曲霉全細胞固定化的酶活回收率的影響因子重要性排序為：菌體包埋量＞海藻酸鈉濃度＞殼聚糖濃度＞氯化鈣濃度，最佳組合為A3B3C3D1，即海藻酸鈉濃度3%，菌體包埋量200g·L?1，殼聚糖濃度5%，CaCl2濃度3%，此時效果最佳。

2.3固定化細胞多批次催化對酶活性的影響

由圖5可知，隨著反應批次的遞增，固定化細胞的相對酶活力逐漸呈現下降趨勢，但總體變化不大，連續使用7次后仍保持有96.85%殘余活力，同時固定化細胞小球均保持了完好的形態，未出現明顯的破損或破裂現象。結果說明所制備的固定化細胞小球具有較高的機械強度，可以多次重復使用，仍然保持相當的催化活性。

3結論

本研究采用海藻酸鈉－殼聚糖為載體進行黑曲霉果糖基轉移酶全細胞固定化，通過單因素優化和正交試驗設計，確定了最佳固定化條件。單因素試驗顯示，海藻酸鈉最適濃度為2%，菌體包埋量最適為150g·L?1，殼聚糖和CaCl2最適濃度均為4%。正交試驗表明，酶回收率受各因素影響排序為：海藻酸鈉濃度＞菌體包埋量＞殼聚糖濃度＞CaCl2濃度。當海藻酸鈉濃度為3%，菌體包埋量增至200g·L?1，殼聚糖濃度為5%，氯化鈉濃度為3%時，酶回收率最優為74.7%。將制得的固定化細胞連續進行7批次催化FOS合成，仍有96.85%的殘余酶活，表現該固定化細胞小球具有很好酶穩定性，可重復使用，本研究為酶法合成低聚果糖提供一條具備工業前景的技術方案。

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（責任編輯：柯文輝）