抗生素復合纖維膜用于抗菌藥物敏感性檢測

摘要 高效、快速的藥物敏感性檢測方法可以更精準地指導臨床用藥和提高新型抗菌藥物的研發效率。傳統的抗菌藥物敏感性實驗（Antimicrobial susceptibility testing， AST）操作簡單、結果可靠、特異性強，但存在耗時長的缺點。CCK8 法是基于2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2， 4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽可被細菌細胞的脫氫酶還原形成水溶性橙黃色甲臜，而活菌濃度與甲臜在450 nm 處的吸光度成正比的原理實現活菌數量的檢測。本研究以抗生素/培養基復合纖維膜為培養基質，采用CCK8 法檢測細菌在此基質上繁殖生長過程中活菌數量的差異，實現了簡單、快速、高通量的抗菌藥物敏感性檢測，總檢測時間在8 h 之內。以創口模擬液中的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和人工尿液中的大腸埃希菌為模擬實際樣本，評估了本方法在臨床應用上的可行性。結果表明，本方法對藥物敏感性的評價結果與傳統紙片擴散法具有良好的一致性。本方法為藥物敏感性檢測提供了新的思路，有助于指導臨床用藥和新型抗菌藥物的研發。

關鍵詞 抗生素復合纖維膜；比色法；抗菌藥物；敏感性檢測；快速檢測

抗生素可以通過破壞細菌細胞的完整性或抑制其生長和分裂過程（如細胞壁、蛋白質和核酸的合成）降低細菌的活力，達到抑制細菌活性或殺死細菌的目的，從而抑制細菌感染。抗生素在人類疾病、動物養殖和農業生產的細菌感染控制過程中發揮了重要作用[1]。但是，抗生素的不合理使用以及過量使用將導致“超級細菌”[2]的出現，引發嚴重的公共衛生問題[3]。據世界貿易組織（WTO）預測，到2050 年，將會有1000 萬人死于細菌抗生素耐藥性，并且會造成約100 萬億美元的損失[4]。目前，有很多抗菌方法和策略可以控制細菌的感染，包括消毒劑[5]、激光和光動力療法[6]、金屬納米材料和水凝膠抗菌表面涂層等[7-9]。體外抗菌藥物敏感性試驗簡稱藥敏試驗（Antimicrobial susceptibility testing， AST），是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能力的試驗[10]。藥敏試驗結果對精準制定感染控制策略、防止藥物濫用以及藥物開發和研究都具有重要的意義。

傳統藥物敏感性檢測方法包括紙片擴散法、肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法等[11]。這些傳統方法具有良好的準確性和可靠性，能夠用于確定抑制細菌繁殖的最低藥物濃度，即抗生素的最低抑菌濃度（Minimuminhibitory concentration， MIC），但是耗時較長（一般需要20～72 h）、靈敏性較低[12]。為了解決上述問題，多種新型藥物敏感性檢測方法相繼被開發出來，如聚合酶鏈式反應（PCR）[13]、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）[14]、微流控技術[15]、表面增強拉曼光譜（SERS）技術[16]和環介導等溫擴增（LAMP）[17]等，相比之下，這些方法檢測的靈敏度和效率高，檢測時間顯著縮短，但是所需要的設備比較昂貴，需要專業技術人員操作[18-19]，并且尚未見相關方法在臨床治療應用中的報道。因此，建立一種低成本、操作簡單、快速的藥物敏感性檢測方法至關重要。

CCK8 法檢測活菌數量是基于其中的2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2， 4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（WST-8）可被細菌細胞中的脫氫酶還原形成水溶性橙黃色甲臜，而活菌濃度與甲臜在450 nm 處的吸光度值成正比[20]，基于此實現活菌數量的檢測。CCK8 比色法在檢測材料抗菌性能和細胞活性[21-22]等方面應用廣泛。本研究組[20]曾報道了一種CCK8 顯色檢測活菌濃度的方法，該方法具有操作簡單、顯色時間短和靈敏度高等優點，檢出限為102 CFU/mL。

本研究基于CCK8 法比色原理，以抗生素/培養基復合纖維膜為培養基質，通過細菌繁殖生長過程中活菌數量的差異即吸光度的差值，建立了一種檢測抗菌藥物敏感性的方法，用于快速確定細菌對抗菌藥物的敏感性。以抗生素/培養基復合纖維膜為培養基質，滴加細菌懸浮液于培養基質上，于37 ℃培養6 h后，加入CCK8 溶液繼續孵育2 h， 使用酶標儀測量甲臜在450 nm 處的吸光度，通過吸光度的差值檢測細菌對藥物的敏感性。本方法具有設備成本低、操作簡單、快速（細菌增殖時間6 h，顯色時間2 h，總檢測時間包含細菌增殖時間和顯色時間不超過8 h）等優點。本方法對藥物敏感性的評價結果與傳統紙片擴散法結果具有良好的一致性，在指導臨床用藥和新型抗菌藥物研發方面具有潛在的應用價值。