神經元型一氧化氮合酶在腦功能性疾病中的研究進展

【摘要】 神經元型一氧化氮合酶（nNOS）是神經系統中一種新近被認識的關鍵調控酶，與多種腦功能性疾病密切相關，其自身活性的平衡在腦功能性疾病的發生發展過程中起到了重要作用。因此，外源性nNOS的干預治療可以在一定程度上改善某些腦功能性疾病。未來的研究將基于新的化合物，深入研究nNOS選擇性抑制劑，以期改善腦功能性疾病的治療效果。本文重點綜述了nNOS在神經系統中的作用及最新進展。

【關鍵詞】 神經元型一氧化氮合酶；腦功能性疾病；抑制劑

【中圖分類號】 R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2024）04-0448-04

Research progress of neuronal nitric oxide synthase in brain functional disorders GAN Xiaokui， SONG Xiaowei， MENG Fan， ZHANG Ming， FANG Yiming， ZHOU Qigang， HUANG Baosheng. Department of Neurosurgery， Sir Run Run Hospital， Nanjing Medical University， 211112 Nanjing， China

Corresponding author： HUANG Baosheng

Abstract： Neuronal nitric oxide synthase（nNOS） is a recently known key regulatory enzyme in the nervous system， which is closely related to a variety of brain functional disorders. The balance of nNOS activity plays an important role in the occurrence and development of brain functional disorders. Therefore， the intervention of exogenous nNOS can improve some brain functional disorders to a certain extent. Future studies， based on new compounds， will further investigate selective nNOS inhibitors with a view to improving the therapeutic effect of brain functional disorders. This review clarifies the role and latest progress of nNOS in the nervous system.

Key words： neuronal nitric oxide synthase; brain functional disorder; inhibitor

基金項目：江蘇省自然科學基金項目（BK20171064）；南京市醫學科學技術發展基金項目（YKK19167）

作者單位：211112 南京，南京醫科大學附屬逸夫醫院神經外科（甘小葵，張明，方一鳴，黃保勝）；南通市第一人民醫院神經外科（宋校偉）；南京醫科大學藥學院臨床藥理學系（孟帆，周其岡）

通信作者：黃保勝

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種雙原子、短壽命的神經遞質，作為信號分子參與心腦系統、炎癥、血管舒張和血管通透性等諸多生理病理的調控^[1]。盡管在人體內多個器官中適量的NO被證明是有益的，但在神經系統中，過量的NO產生可能引發神經元毒性和死亡，從而導致諸多神經系統疾病^[1]。因此，調控NO的生成對治療部分神經系統疾病具有重要意義。

一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）以L-精氨酸為底物，輔以分子氧、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸和四氫生物蝶呤等，最終產生NO^[2]。在哺乳動物細胞中，存在著三種截然不同的異構體NOS，包括神經元型NOS（neuronal nitric-oxide synthase， nNOS）、誘導型NOS（inducible NOS，iNOS）和內皮型NOS （endothelial NOS，eNOS），nNOS亞型在中樞及外周神經細胞中被首次發現并占據主要分布，iNOS在多種細胞和組織中存在，eNOS則是在血管內皮細胞中表達^[2]。盡管iNOS在神經系統中也有表達，但是nNOS存在于大腦的多個腦區中，如海馬、小腦和大腦皮質等區域^[3]，是NO在神經系統中發揮作用的主要前體酶。NO的異常產生是導致部分神經系統疾病發生的潛在因素，而nNOS則是解決這個問題的重要一環，因此本文對nNOS在目前相關腦功能性疾病中的作用進行綜述，希望有助于后續進一步研究其在相應腦功能性疾病中的詳細機制以及治療。

1 nNOS的結構與功能

nNOS在體內分別以單體和二聚體的形式存在，只有后者具有活性。無活性的nNOS單體（分子量為160.8 kDa，含有1 434個氨基酸）包含一個氧合酶結構域（催化或N端）和一個還原酶結構域（C端），N端結構域可以與四氫生物蝶呤巰基連接的血紅素（氧化還原輔因子）、L-精氨酸和鋅離子結合；C端結構域包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸的結合位點^[3]。活性nNOS酶是同型二聚體，兩個單體通過二聚體活化將各自N端氧合酶結構域和鈣調蛋白結合序列連接在一起，形成具有活性的酶^[4]。nNOS在多個腦區中均有表達，主要定位于神經元的細胞質中，也偶有分布于神經元和膠質細胞的胞核中^[5]。對nNOS的結構深入了解才能夠對藥物的設計具有參考意義，因此相當一部分抑制劑的設計都充分考慮了nNOS的結構。

近年來，越來越多的報道證實了nNOS在神經系統中的重要性。在中樞神經系統中，nNOS參與學習、記憶、神經發生以及血壓中樞等調控功能^[6]；而在外周神經系統中，nNOS則主要與平滑肌活動的調節有關。nNOS的功能異常所導致的下游異常NO信號可能導致多種功能性神經疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇等^[7]。作為NO在神經系統中的主要來源，nNOS的調節作用值得重視。

2 nNOS與腦功能性疾病

在神經系統中，nNOS產生的NO可以作用于許多靶酶和蛋白質，適當的NO生成才能發揮正常的生理功能。如果這種穩定的狀態被打破，則會造成一系列神經系統的病變，從而使得nNOS參與到中樞系統的一些腦功能性疾病的病理中。

2.1 nNOS與癲癇 癲癇是一種危害了十分之一世界人口的神經系統疾病，它能夠影響大腦的多個分區。目前受廣泛認可的癲癇發生機制是中樞興奮與抑制的失衡，理論上nNOS陽性的抑制性中間神經元缺失會打破這個平衡從而導致神經元的過度興奮，最終誘發癲癇^[8]。已有相關證據表明，nNOS參與了癲癇發生，在電刺激誘導的癲癇小鼠模型和紅藻氨酸誘導的癲癇大鼠模型中，海馬中nNOS的表達水平均明顯升高^[9-10]。同樣的，在人腦皮質的致癇灶中也檢測到神經元表達nNOS明顯高于對照正常人腦組織^[11]。由此推測，癲癇發作早期抑制性中間神經元可能會代償性地上調nNOS來抑制癲癇，但在癲癇的長期致病中可能就涉及nNOS產生過量NO導致神經毒性。以上研究提示了nNOS在癲癇中的重要作用，但是目前對于nNOS在癲癇中的確切作用和潛在機制尚不清楚。Méndez-Armenta等^[12]發現，在癲癇海馬中nNOS的功能失調會引起活性氧和活性氮的過量產生，導致過度氧化應激破壞線粒體的正常功能，最終致使神經元死亡，證明氧化應激是導致癲癇的可能機制之一。Zhu等^[13]發現，在戊四氮誘導的癲癇模型中，nNOS產生的NO與超氧陰離子快速反應生成大量具有神經毒性的過氧亞硝酸鹽，引起海馬體內質網應激導致神經元損傷，進一步證明了內質網應激和癲癇之間的關聯。這兩種機制都參與到癲癇所導致的進行性神經退行性病變過程中，因此現階段的抗癲癇治療策略也可以根據nNOS與癲癇致病之間的關系來設計新的藥物。

2.2 nNOS與帕金森病（Parkinson’s disease，PD） PD是一種以黑質多巴胺能神經元進行性死亡為特征的神經系統變性疾病。正常情況下，在成年大鼠腦內尾狀核、殼核、伏隔核的多巴胺能神經元末梢觀察到nNOS的中等表達，而黑質區nNOS陽性神經元的表達水平則明顯低于以上腦區^[14]。在PD患者的腦組織中進一步發現，丘腦底核、黑質紋狀體這些腦區中的nNOS呈現出高表達趨勢，提示了nNOS在PD黑質紋狀體多巴胺能通路的上調中起到重要作用^[15]。以上研究說明，nNOS的表達及功能與PD的發病機制相關。黑質區神經元具有N-甲基-D-天冬氨酸受體，接受來自大腦皮質和丘腦底核的谷氨酸輸入，當興奮性氨基酸受體被激活后引起Ca²⁺內流，繼而激活nNOS生成NO，導致具有神經毒性的過氧亞硝酸鹽的產生，最終導致PD黑質區神經元的損傷和凋亡^[16]。具體nNOS在PD中的致病機制還需要進一步研究，考慮到過度激活的nNOS和隨后過量產生的NO可能推動PD的病理，選擇性抑制nNOS可能為PD的治療提供了新的思路。

2.3 nNOS與阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） AD是一種以認知功能下降為特征的神經退行性疾病，其特征性改變為神經元變性丟失和淀粉樣斑塊形成。大量研究發現，AD患者大腦中β-淀粉樣蛋白的產生和過度堆積導致了AD特征性纏結神經元的形成以及炎癥變化、神經退行性變等一系列病理改變，證實了β-淀粉樣蛋白在AD形成和發展中的重要角色^[17]。Thorns等^[18]發現，在AD患者的纏結神經元中，nNOS的表達顯著增加，這表明nNOS可能涉及在AD病理過程中大腦皮質和海馬神經元的死亡和突觸丟失。而在關于β-淀粉樣蛋白局部輸注的相關研究中，β-淀粉樣蛋白的沉積可誘導Ca²⁺內流到細胞內基質，從而增強nNOS活性，導致NO過度產生，并伴有相關的神經毒性、認知障礙和空間記憶損害^[19]，這提示著nNOS與β-淀粉樣蛋白共同作用可能參與到AD的病理過程中。已經有研究證實了一種存在于腦組織中的細胞周期蛋白依賴性激酶-5的失調和β-淀粉樣蛋白協同作用促使AD發生^[20]。而nNOS的二聚化會促使細胞周期蛋白依賴性激酶-5磷酸化^[21]，因此當nNOS二聚化被破壞，可能導致CDK5的異常激活，最終促進AD的進展。此外，nNOS二聚體的破壞也會產生活性氧引起氧化應激反應以及過氧亞硝酸鹽生成引起的神經元死亡^[2]，在AD中起著重要的病理作用。由于nNOS產生的NO能夠調節血管張力，nNOS功能失調導致NO合成障礙會引起腦血流量的減少，從而影響中樞神經細胞的葡萄糖和氧供應，導致β-淀粉樣蛋白沉積增加，可能進一步加重AD的進展^[22]。因此對nNOS在AD致病中的詳細機制進行深入研究，有望以nNOS為靶點找到治療AD的方法。

2.4 nNOS與亨廷頓舞蹈病（Huntington’s disease，HD） HD是一種以運動功能障礙、認知障礙和精神障礙為特征的致命神經退行性疾病。該病是由于4號染色體上的基因異常引發了CAG片段擴增，從而導致亨廷頓蛋白中聚谷氨酰胺鏈延伸所引起的^[23]。有研究發現，在HD小鼠的紋狀體和小腦中觀察到nNOS表達和活性降低，且在nNOS基因缺失的小鼠中HD病情進展更快，這些足以說明nNOS在HD病理中的重要作用^[24]。但是，這個結果與nNOS在癲癇、PD、AD等疾病中的表達恰恰相反。Deckel等^[25]發現，在HD小鼠中使用nNOS抑制劑阻斷nNOS活性后，導致過氧亞硝酸鹽生成增加，從而導致HD的快速進展。這些結果表明，nNOS功能異常可能顯著促進HD中發現的神經退行性病變，提示著從nNOS入手來對抗HD進展的可能性，后續仍需進一步深入研究其在HD中的詳細致病機制，在此基礎上研發藥物起到治療HD的作用。

2.5 nNOS與神經性疼痛（neuropathic pain，NP） NP是由于感覺神經系統病變引起一種常見慢性疼痛，包括三叉神經痛、帶狀皰疹后神經痛和中風后疼痛等，對患者的生活質量造成了極大損害^[26]。它的特征包括對有害刺激的反應增強、對非有害刺激的異常反應和自發性疼痛。Boettger等^[27]發現，nNOS基因缺失的小鼠對疼痛的反應更加耐受，其表現出的疼痛行為較正常小鼠明顯減少；在給損傷的野生型動物使用nNOS抑制劑后，也極大地緩解了它們的NP^[28]，這表明nNOS在介導NP中起到重要作用。如何控制和改善NP則需進一步研究其潛在機制，可能有以下幾種作用方式。首先，nNOS可以通過生成過氧亞硝酸鹽增強N-甲基-D-天冬氨酸受體的磷酸化，從而導致中樞敏化，參與持續性疼痛的維持^[29]。此外，nNOS還可以通過調控包括趨化因子在內的炎癥介質表達，作用在感覺神經元上的趨化因子受體，從而使負責疼痛傳導的C-纖維敏化，最終導致痛覺過敏^[30]。其下游產物NO的過量產生和環磷酸鳥苷的合成在炎性疼痛和NP中也發揮著一定作用^[31]，nNOS通過調節NO的生成參與到NP中去。綜上，充分證實了nNOS在NP中發揮的作用，因此nNOS可以作為NP的一個潛在治療靶點。

3 nNOS的選擇性抑制劑

鑒于nNOS過度產生的NO在眾多腦功能性疾病中的作用，nNOS是一個值得進一步關注的重要治療靶點。目前已經研究出一些選擇性nNOS抑制劑，主要方法包括利用精氨酸模擬物作為競爭性nNOS抑制劑等，接下來將對幾種常見的抑制劑進行簡單介紹。

3.1 7-硝基吲哚（7-nitroindazole，7-NI） 作為最早發現的選擇性抑制NOS的化合物之一，7-NI對nNOS的抑制是否具有選擇性仍有異議。在體外研究中，7-NI與nNOS和eNOS均能結合，但在活體細胞中，7-NI對腦組織中的nNOS有抑制作用，對完整血管中的eNOS活性沒有影響^[32]。盡管在體外，7-NI與NOS的結合沒有特異性選擇其中一種分型，但在動物體內則具有nNOS選擇性抑制作用。在動物實驗中，戊四唑（pentylenetetrazole，PTZ）點燃癲癇小鼠模型中海馬齒狀回新生神經元的增殖和存活顯著增強；然而，在使用7-NI抑制nNOS的活性后，明顯抑制了齒狀回新生神經元的增殖和存活^[33]。目前，將7-NI應用于人體內探究其作用的實驗尚未大量開展，在一項關于人體溫度的血管調節實驗中，研究者使用了皮內微透析的方式進行7-NI給藥治療，這種技術可以允許7-NI發揮純粹的局部作用，而沒有全身作用的風險^[34]。因此能否利用該項技術，還是開發新的技術將7-NI特異性輸入到腦功能性疾病的病變腦區起到治療作用，還需要進一步探索。

3.2 S-methyl-L-thiocitrulline（SMTC） SMTC是一種合成的L-精氨酸類似物，對nNOS和eNOS均有很強的選擇性，但是對腦組織中nNOS的特異性是血管內皮中eNOS的17倍^[35]。研究發現，SMTC能夠穿過血腦屏障發揮抑制中樞nNOS的作用，在使用SMTC抑制nNOS后可以引起人腦神經血管耦合反應性的降低^[36]，而神經血管耦合功能的異常則會引起一些功能性神經退行性變。因此，通過合理利用SMTC對nNOS的抑制功能有望起到治療相關功能神經退行性變的效果。

3.3 N（ω）-propyl-L-arginine（L-NPA） L-NPA作為L-精氨酸類似物也是nNOS的一種高選擇性抑制劑，其對nNOS的抑制性分別是eNOS和iNOS的149倍和3 158倍^[37]。研究者使用L-NPA治療紅藻氨酸誘導的癲癇小鼠，發現可降低驚厥樣運動發作的嚴重程度和持續時間以及癲癇持續狀態期間癲癇樣棘波的頻率^[38]。這說明，L-NPA有治療癲癇的潛力，但能否應用到人體來進行癲癇的治療還待進一步研究。

3.4 2-氨基喹啉類抑制劑 2-氨基喹啉類藥物具有生物可用的nNOS抑制劑的前景，但其對人體內nNOS的抑制能力較低，并且與其他中樞神經系統中的其他靶標有顯著的結合，這就導致其會產生多種不良后果。Cinelli等^[39]一直基于2-氨基喹啉支架進行抑制劑的設計與合成；該團隊研發的第一代氨基喹啉類是具有良好藥代動力學的nNOS抑制劑，但其在人體中對nNOS的選擇性明顯低于eNOS，這就造成了藥物的脫靶；第二代抑制劑雖然減少了脫靶結合，但是其在藥物腸道吸收利用不佳，且對人體nNOS和eNOS具有同樣低選擇性；最新一代的抑制劑則通過加入部分化學基團后，明顯增強了對人體nNOS的作用效果，也改善了脫靶和腸道滲透性特性。其能否運用到人體中起到治療相關疾病還有待進一步研究。

3.5 基于2-氨基吡啶支架的選擇性nNOS抑制劑 除了以上這些藥物以外，Do等^[40]在基于NOS結構藥物設計和片段跳躍的指導下，通過2-氨基吡啶支架設計出一系列選擇性nNOS抑制劑，但是存在部分藥代動力學的缺陷。設計具有改善藥代動力學特性的強效nNOS抑制劑至關重要，該抑制劑需要同時兼具高亞型選擇性和強血腦屏障滲透性的效果，這樣既能減少作用于eNOS和iNOS所帶來的副作用，也能利用到神經系統中起到治療效果。

4 結 語

綜上所述，nNOS的功能異常與部分腦功能性疾病的發病機制密切相關，同時nNOS及其產物NO在中樞神經系統中的作用是非常復雜的，因此充分了解其在多種神經疾病中的作用機制對疾病治療具有指導意義。目前階段設計和發現的化合物雖然能夠選擇性抑制nNOS的功能，但還存在血腦屏障滲透性差、副作用多等缺陷。因此以nNOS為針對性靶點進行藥物的研發，有望治療相關腦功能性疾病。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：甘小葵、宋校偉負責起草文章，查閱文獻及分析；孟帆、周其岡負責文獻內容的總結；張明、方一鳴負責查閱文獻和機制的總結；黃保勝負責課題監管和指導，文章的審閱和修訂。

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（收稿2023-03-16 修回2023-07-01）