平沙綠僵菌SG-A兩種培養(yǎng)基比較及其對瓜絹螟的致病活力

摘 " "要：為比較平沙綠僵菌SG-A在兩種培養(yǎng)基上的生物學(xué)特性及對瓜絹螟不同蟲態(tài)的致病力，室內(nèi)測定了平沙綠僵菌SG-A在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和薩氏培養(yǎng)基（SDAY）上培養(yǎng)14 d后的菌落大小、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率等指標(biāo)，并采用浸蟲法測定了對瓜絹螟不同蟲態(tài)的致病力。結(jié)果表明，平沙綠僵菌SG-A在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后的產(chǎn)孢量顯著高于SDAY培養(yǎng)基，菌落大小和孢子萌發(fā)率差異不顯著。平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟2齡、4齡幼蟲和蛹均存在較高的致病力，孢子濃度越大，致病力越高，其中對蛹的致病力最高，LC50為1.93×105 個·mL-1，當(dāng)孢子濃度為1×108 個·mL-1時，處理8 d蛹的累積死亡率為90%，2齡和4齡幼蟲的累積死亡率也分別達到86.67%和83.33%，但4齡幼蟲出現(xiàn)死亡的時間要早于蛹和2齡若蟲，LT50為2.60 d。綜上所述，平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟各蟲態(tài)均具有較高的致病力，可進一步挖掘其生防潛力。

關(guān)鍵詞：平沙綠僵菌；SG-A菌株；瓜絹螟；生物學(xué)特性；致病力

中圖分類號：S476.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）08-152-06

Comparison of two culture medium of Metarhizium pingshaense SG-A and its pathogenic activity against Diaphania indica（Saunders）

HU Haiyan， ZHANG Ranran， WANG Yali， LI Xiaoli， DUAN Huiting

（Weifang University of Science and Technology/Shandong Provincial University Laboratory for Protected Horticulture， Shouguang 262700， Shandong， China）

Abstract： In order to compare the biological characteristics and pathogenicity of Metarhizium pingshaense SG-A on two media， the size of colony， sporulation yield and spore germination rate of M. pingshaense SG-A on potato glucose AGAR medium（PDA）and sabouraud dextrose agar with yeast extract（SDAY）were measured after 14 days. The pathogenicity of M. pingshaense SG-A against different insect states of Diaphania indica（Saunders）was determined by dip method. The biological characteristics on different media and pathogenicity to D. indica of M. pingshaense SG-A were measured . The results showed that the spore production of M. pingshaense SG-A after 14 days of PDA culture was significantly higher than that of SDAY culture medium， and there was no significant difference in colony size and spore germination rate. M. pingshaense SG-A showed high pathogenicity against the 2nd and 4th instar larvae and pupae， and the pupae had the highest pathogenicity. The LC50 was 1.93×105 conidia·mL-1， and the cumulative mortality of pupae was 90% when the spore concentration was 1×108 conidia·mL-1. The cumulative mortality of 2nd instar and 4th instar larvae also reached 86.67% and 83.33%， respectively， but the death time of 4th instar larvae was earlier than that of pupa and 2nd instar nymphs， and the LT50 was 2.60 days. In conclusion， M. pingshaense SG-A has high pathogenicity against each species of D. indica， which can further explore its biocontrol potential.

Key words： Metarhizium pingshaense; SG-A strain; Diaphania indica（Saunders）; Biological characteristics; Pathogenicity

瓜絹螟[Diaphania indica（Saunders）]是危害設(shè)施蔬菜的重要害蟲之一，其中葫蘆科植物是其嗜食的主要寄主，特別是在黃瓜、絲瓜、苦瓜等寄主上的危害逐年加重[1]。在溫室適宜的環(huán)境條件下，瓜絹螟單雌產(chǎn)卵量可達500粒，常年危害植物葉片和果實，尤其3齡后食量暴增，吐絲綴合葉片或嫩梢后藏匿其中，每個葉片上有幾十頭幼蟲取食，危害嚴(yán)重時可將葉片全部吃光[2]。目前，關(guān)于瓜絹螟的防治主要采用化學(xué)藥劑，但長期單一地采用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致瓜絹螟的抗藥性逐漸增強。因此，亟待尋找一條綠色高效的防治途徑，生物防治已逐漸被人們所重視，廣泛應(yīng)用于保護地蔬菜害蟲的防治，蟲生真菌就是化學(xué)農(nóng)藥控制害蟲的重要替代品，其中綠僵菌（Metarhizium spp.）是目前應(yīng)用最廣泛的蟲生真菌之一，綠僵菌種類較多，已經(jīng)被證實對多種害蟲均有較高的防治效果。林華峰等[3]研究表明，綠僵菌大孢變種在進行土壤和噴霧處理蠐螬后的累積僵蟲率分別達88.23%和76.47%。Zhao等[4]研究表明，平沙綠僵菌MaFZ-13侵染茶尺蠖后的死亡率達93%。裴松松等[5]利用紫外誘變得到的金龜子綠僵誘變菌株F2-M18-8-4對西花薊馬的校正蟲口減退率為79.52%，顯著高于吡蟲啉、噻蟲嗪及乙基多殺菌素的防治效果。Peng等[6]研究表明，金龜子綠僵菌CQMa421施用7 d后對稻飛虱的防效在60%以上。另外，還有較多關(guān)于綠僵菌防治飛蝗、葉甲等害蟲的研究報道[7-8]。但目前關(guān)于平沙綠僵菌對瓜絹螟致病性的研究還未見報道。筆者選擇前期分離篩選到的1株平沙綠僵菌菌株SG-A （Metarhizium pingshaense SG-A），通過比較馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和薩氏培養(yǎng)基對平沙綠僵菌菌株SG-A生長和產(chǎn)孢等指標(biāo)的影響以及對瓜絹螟不同蟲態(tài)的致病力，以期為瓜絹螟的生物防治提供菌種資源和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種：菌株SG-A是通過采集壽光市學(xué)府蔬菜有限公司露天種植的煙薯25田塊地表以下20 cm的土壤樣品，以黃粉蟲誘集法并分離純化后獲得[9]，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定為平沙綠僵菌（Genebank登錄號為：OR900300）。

供試?yán)ハx：瓜絹螟幼蟲于2023年4月采自壽光市稻田鎮(zhèn)西里村黃瓜大棚植株上，并帶回室內(nèi)飼養(yǎng)多代后取齡期一致的2齡、4齡幼蟲以及蛹備用。

1.2 方法

試驗于2023年8—9月在濰坊科技學(xué)院進行。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對平沙綠僵菌SG-A菌落生長的影響 試驗采用菌液點滴法[3]，刮取平板中的分生孢子，使用含有0.05%吐溫-80的無菌水配成1×108 個·mL-1的孢子懸浮液，用無菌移液槍移取2 μL孢子懸浮液分別接種到薩氏培養(yǎng)基（SDAY：10 g·L-1蛋白胨、40 g·L-1葡萄糖、10 g·L-1酵母提取物及20 g·L-1瓊脂）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1及瓊脂20 g·L-1）的無菌平板中央，將含有孢子懸浮液的培養(yǎng)皿使用封口膜封好后放置于培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中溫度保持在（25±1）℃，濕度為（70±5）%。培養(yǎng)3 d后，挑選含有單菌落的培養(yǎng)皿以十字交叉法測定菌落直徑，每個處理5次重復(fù)，每隔2 d測定1次，培養(yǎng)14 d后測定結(jié)束，計算菌落日增長量，同時觀察記錄兩種培養(yǎng)皿的菌落顏色、菌落形態(tài)等特征。

1.2.2 " "不同培養(yǎng)基對平沙綠僵菌SG-A產(chǎn)孢量的影響 " "平沙綠僵菌SG-A菌落培養(yǎng)14 d后，用0.5 cm直徑的無菌打孔器分別在SDAY和PDA培養(yǎng)基菌落直徑1/2處打取菌蝶，置于50 mL的錐形瓶中，加入20 mL滅菌的吐溫-80溶液，使用磁力攪拌器將孢子塊充分打散，使孢子均勻分布，然后用血球計數(shù)板在生物顯微鏡下統(tǒng)計不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，每個處理至少5次重復(fù)。

按照劉寶生等[10]的方法統(tǒng)計產(chǎn)孢量：1 cm2 菌落孢子數(shù)量＝（平均每個小格孢子數(shù)量×4×106×稀釋倍數(shù)）/（3.14×r2×n），r為菌落半徑（cm），n為菌落的數(shù)量（塊）。

1.2.3 " "不同培養(yǎng)基對平沙綠僵菌SG-A孢子萌發(fā)率的影響 " "首先配制1×107個·mL-1的孢子懸浮液，在含有10 mL SDAY和PAD培養(yǎng)基的錐形瓶中分別加入1 mL的孢子液，放入恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)24 h，然后吸取適量菌液滴加到血球計數(shù)板上觀察孢子萌發(fā)情況，以芽管長度＞孢子半徑的孢子視為已萌發(fā)孢子[11]，每個處理至少5次重復(fù)，每次觀察孢子數(shù)量不少于200個，計算孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率/%=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100。

1.2.4 " "平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟幼蟲及蛹的致病力 " "試驗采用浸蟲法[5]，先用含有0.05%吐溫-80的無菌水配制孢子懸浮液，從高濃度往低濃度依次稀釋，配制時用磁力攪拌器將孢子攪拌均勻，配制濃度依次為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104個·mL-1。然后分別挑選齡期一致的瓜絹螟2齡、4齡幼蟲及蛹，將瓜絹螟幼蟲及蛹分別浸入到不同濃度的孢子懸浮液中2～3 s后取出，在無菌濾紙上晾干多余藥液后，將瓜絹螟幼蟲分別放入含有幼嫩黃瓜葉片的一次性塑料盒中飼養(yǎng)，保鮮膜封口后扎眼透氣，將瓜絹螟蛹放入含有濕潤濾紙的一次性塑料盒中，以含有0.05%吐溫-80無菌水作為空白對照，每個處理至少5次重復(fù)，每個重復(fù)10頭試蟲，將處理好的試蟲放入培養(yǎng)箱中觀察飼養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度（25±1） ℃，濕度（70±5）%，光周期為L∶D=12 h∶12 h。每天觀察瓜絹螟幼蟲和蛹的存活情況，以細毛筆觸碰幼蟲蟲體不動即視為死亡，觸碰蛹的腹部末端不動也視為蛹已死亡，將死亡僵硬的幼蟲和蛹放到含有濕潤無菌濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，鏡檢如果有綠僵菌菌絲和孢子長出即為綠僵菌感染導(dǎo)致的死亡，統(tǒng)計每個處理感染死亡的幼蟲和蛹的數(shù)量，計算死亡率和校正死亡率。死亡率/%=死蟲數(shù)/供試蟲數(shù)×100。校正死亡率/%=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2010進行數(shù)據(jù)初步的統(tǒng)計整理和作圖，采用SPSS18.0進行單因素方差分析及鄧肯氏新復(fù)極差法多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌株SG-A生長和產(chǎn)孢量的影響

試驗結(jié)果表明，平沙綠僵菌SG-A在PDA和SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的生長形態(tài)存在差異，在SDAY上培養(yǎng)后菌落的正面顏色為黃白色，菌絲生長比較旺盛，孢子顏色為黃綠色，反面顏色為紅褐色，菌落有縱褶，而在PDA培養(yǎng)基上菌落正面為輪紋狀，孢子顏色為深綠色，菌落上覆蓋一層薄的菌絲，反面為顏色較淺的輪紋狀（圖1）。培養(yǎng)14 d后兩種培養(yǎng)基的菌落直徑大小和孢子萌發(fā)率差異均不顯著，但在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后的產(chǎn)孢量為4.74×105 個·mL-1，顯著高于SDAY培養(yǎng)基（表1）。

2.2 平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟幼蟲和蛹的致病力

從平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟2齡幼蟲的致病結(jié)果（圖2-A）可以看出，處理后第3天開始出現(xiàn)死亡蟲體，且隨著濃度的增加和時間的延長，瓜絹螟2齡幼蟲的校正死亡率增加。處理第8天，當(dāng)孢子濃度為1×108 個·mL-1時，瓜絹螟2齡幼蟲的死亡率最高為86.67%。瓜絹螟2齡幼蟲感染綠僵菌死亡后，第1天體色會由綠色變?yōu)榻┯驳狞S色，第2天體表節(jié)間會逐漸長出白色菌絲，第4～5天后體表會逐漸長出綠色孢子并布滿整個蟲體（圖2-B）。

平沙綠僵菌SG-A處理瓜絹螟4齡幼蟲后，從第2天開始，高濃度處理出現(xiàn)蟲體死亡，且隨著孢子濃度的升高和處理時間的延長，4齡幼蟲的死亡率逐漸升高。當(dāng)濃度為1×108個·mL-1時，處理第8天瓜絹螟4齡幼蟲的校正死亡率為83.33%。4齡幼蟲死亡后體色也由綠色變?yōu)榻┯驳狞S色，隨著侵染時間的延長，體表會布滿菌絲并逐漸長出綠色的孢子（圖3）。

平沙綠僵菌SG-A處理瓜絹螟蛹的試驗結(jié)果表明，菌株SG-A對瓜絹螟蛹的致病力最高，蛹的死亡從第3天開始出現(xiàn)，隨著孢子濃度的升高和處理時間的延長，蛹的死亡率逐漸升高，當(dāng)濃度為1×108 個·mL-1時，處理第8天瓜絹螟蛹的校正死亡率為90.00%。當(dāng)蛹死亡時觸碰蛹體末端無反應(yīng)，且蛹體僵直體色變深，節(jié)間、附肢等部位逐漸長出白色的菌絲，隨后3～5 d逐漸長出綠色孢子并布滿蟲體（圖4）。

2.3 平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟幼蟲和蛹的毒力分析

從表2可以看出，平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟幼蟲和蛹的毒力測定結(jié)果存在差異，其中平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟蛹的毒力最高，半致死濃度LC50為1.93×105 個·mL-1，對4齡幼蟲的毒力最低，LC50為4.03×105 個·mL-1。

2.4 1×108 個·mL-1濃度的平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟幼蟲和蛹的致死中時（LT50）

從表3可以看出，平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟幼蟲和蛹的致死中時（LT50）存在差異，其中平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟4齡幼蟲的致死中時最短，為2.60 d，對瓜絹螟蛹的致死中時（LT50）最長，為4.56 d。

3 討論與結(jié)論

綠僵菌是重要的害蟲生防菌，具有種類多、安全高效且不易產(chǎn)生抗性等眾多優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治。研究表明，綠僵菌的生長速率、產(chǎn)孢量是影響其致病力的重要因素[12-13]，而營養(yǎng)物質(zhì)是影響綠僵菌生長和產(chǎn)孢的重要影響因子之一。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，平沙綠僵菌SG-A在PDA和SDAY兩種培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量存在明顯的差異，在PDA培養(yǎng)基上生長的菌落產(chǎn)孢量顯著高于SDAY培養(yǎng)基。龐繼鑫等[14]研究表明，萊氏綠僵菌在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量也顯著高于SDAY培養(yǎng)基。這說明，相比SDAY培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基更適合平沙綠僵菌SG-A的生長和繁殖。

目前，關(guān)于綠僵菌對多種害蟲具有較高致病力的研究已有較多報道，但關(guān)于綠僵菌對瓜絹螟致病力的相關(guān)研究還未見報道。筆者研究發(fā)現(xiàn)，從土壤中分離得到的平沙綠僵菌菌株SG-A對瓜絹螟2齡、4齡和蛹均具有較高的致病力，且孢子濃度與致病力呈正相關(guān)。其中，對蛹的致病力最高，LC50為1.93×105個·mL-1，孢子濃度為1×108 個·mL-1時，處理8 d蛹的累積死亡率為90.00%，2齡和4齡幼蟲的累積死亡率也分別達到86.67%和83.33%。楊帆等[15]研究表明，平沙綠僵菌對小菜蛾具有較高的侵染力，5 d后的累積校正死亡率為78.33%。本研究結(jié)果表明，平沙綠僵菌SG-A對蛹的致病力最高，但4齡幼蟲的致死中時（LT50）要短于蛹和2齡幼蟲，這可能是由于4齡幼蟲體表表面積較大且節(jié)間褶皺多，更容易接觸到較多的孢子，導(dǎo)致出現(xiàn)死亡的時間最早。

綜上所述，平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟2齡、4齡幼蟲和蛹均存在較高的致病力，孢子濃度越大，致病力越高，可作為防治瓜絹螟的蟲生真菌，研究結(jié)果可為瓜絹螟的綠色防控提供參考和依據(jù)。但本試驗僅比較了在室內(nèi)條件下平沙綠僵菌SG-A對瓜絹螟不同蟲態(tài)的致病力，田間對瓜絹螟的致病力以及具體的致病機制等還有待于更深入的研究。

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