枯草芽孢桿菌對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及草莓根腐病的調(diào)控作用

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；草莓；高通量測(cè)序；真菌群落結(jié)構(gòu)；草莓根腐病

中圖分類號(hào)：S436.68：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）06-0081-07

作物土傳病害的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性，微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為指示土壤健康的重要指標(biāo)。生物防治、生物有機(jī)肥和輪作等措施可有效調(diào)節(jié)土壤微生物群落，提高土壤健康水平，減少病害發(fā)生，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、土壤生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈其榮團(tuán)隊(duì)通過(guò)研究根際微生物與病害發(fā)生之間的聯(lián)系，揭示了“土壤微生物群操縱”、“鐵載體靶向療法”、“噬菌體療法”等多種調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的思路和機(jī)制，通過(guò)優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，減少土壤中病原菌的數(shù)量，進(jìn)而抑制作物病害發(fā)生。

草莓根腐病是由多種病原菌和環(huán)境互作引起的一類土傳病害，其致病菌復(fù)雜多樣，已報(bào)道的主要有絲核菌屬、鐮刀菌屬、腐霉菌屬、擬盤多毛孢屬、炭疽菌屬、疫霉屬和Dactylonectria等，生產(chǎn)中常用的高溫悶棚、灌施化學(xué)農(nóng)藥等措施易導(dǎo)致土壤板結(jié)和質(zhì)量下降、作物抗藥性等問(wèn)題。基于此，本研究以草莓為研究對(duì)象，施用枯草芽孢桿菌，利用高通量測(cè)序技術(shù)解析根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化，分析外源枯草芽孢桿菌對(duì)根際土壤真菌群落及作物病害和作物生長(zhǎng)的影響，以期為利用微生物群落定向調(diào)控草莓土傳病害探索新思路。

1材料與方法

1.1供試菌株

3×10² CFU/mL枯草芽孢桿菌TB918懸浮劑由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所贈(zèng)送，3×10¹⁰ CFU/mL枯草芽孢桿菌NCD-2懸浮劑由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所贈(zèng)送。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021—2022年在山東省臨沂市沂水縣小匡莊開展。試驗(yàn)大棚多年種植草莓，草莓根腐病連年發(fā)生嚴(yán)重，當(dāng)年未進(jìn)行悶棚處理。共設(shè)置4個(gè)處理：60L／hm²枯草芽孢桿菌TB918滴灌處理（TB918）、60L／hm²枯草芽孢桿菌NCD-2滴灌處理（NCD-2）、7.5L／hm² 30%精甲霜靈·嗯霉靈滴灌化學(xué)對(duì)照（Chem）和清水對(duì)照（CK）。每處理重復(fù)4次，共16個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積20m²（2m×10 m）。

1.3草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

草莓定植3個(gè)月后，采集不同處理的草莓根際土壤。每個(gè)處理隨機(jī)選取3株長(zhǎng)勢(shì)較為一致的草莓植株，采用抖土法獲取根際土壤，充分混勻后作為1個(gè)土樣，重復(fù)3次。分別對(duì)各處理進(jìn)行基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，使用ITSIF/ITS2R引物對(duì)真菌ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收PCR產(chǎn)物后由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。

利用美吉生物云平臺(tái)，采用Uparse（version 7.0.1090）軟件進(jìn)行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行物種分類注釋，基于FUNGuild分析根際土壤真菌的營(yíng)養(yǎng)型和功能預(yù)測(cè)，基于OTU進(jìn)行Alpha多樣性分析，基于分類學(xué)信息進(jìn)行門和屬水平群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4枯草芽孢桿菌對(duì)草莓根腐病的防治效果

本研究以草莓發(fā)病率為指標(biāo)計(jì)算防治效果，分別于草莓定植1、2、3個(gè)月時(shí)調(diào)查各處理草莓根腐病發(fā)病株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)／調(diào)查總株數(shù)×100。防效（%）=（對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率）／對(duì)照發(fā)病率×100。

1.5枯草芽孢桿菌對(duì)草莓的促生作用

在不同時(shí)間段內(nèi)，分別調(diào)查各處理草莓的冠徑、葉面積和葉片葉綠素含量（SPAD值）。冠徑使用直尺測(cè)量，葉面積使用直尺測(cè)量每株草莓最大葉片的長(zhǎng)和寬后計(jì)算，SPAD值使用手持式葉綠素快速檢測(cè)儀（金科利達(dá)TYS-4N）測(cè)定，每重復(fù)測(cè)量10個(gè)植株或葉片。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05），采用OriginPro 8.6軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1草莓根際土壤真菌多樣性分析

多樣性分析結(jié)果（表1）顯示，與CK相比，經(jīng)枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918處理的Shannon指數(shù)顯著上升22.88%和13.86%，Simpson指數(shù)顯著下降55.91%和36.56%，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)分別顯著上升19.06%、39.08%和16.57%、34.89%。表明施用枯草芽孢桿菌后，草莓根際土壤真菌的多樣性發(fā)生了較大變化，物種的豐富度和多樣性明顯增加。

2.2草莓根際土壤真菌營(yíng)養(yǎng)型分析

利用FUNGuild對(duì)真菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分類，由圖1可知，樣本主要有3類基本營(yíng)養(yǎng)型、5類交叉營(yíng)養(yǎng)型及未知營(yíng)養(yǎng)型。其中在3類基本營(yíng)養(yǎng)型中，CK、Chem、NCD-2、TB918處理的病理營(yíng)養(yǎng)型相對(duì)豐度分別是17.69%、10.81%、8.23%、9.46%，腐生營(yíng)養(yǎng)型相對(duì)豐度分別為12.14%、10.79%、32.53%、26.94%，共生營(yíng)養(yǎng)型相對(duì)豐度分別為0.23%、0.14%、0.75%、0.78%；兩種枯草芽孢桿菌處理的病理營(yíng)養(yǎng)型均低于對(duì)照，腐生營(yíng)養(yǎng)型和共生營(yíng)養(yǎng)型均高于對(duì)照。

如表2所示，1073個(gè)OTU中共有23個(gè)OTU經(jīng)FUNGuild鑒定為植物病原菌，其在CK、Chem、NCD-2、TB918處理的相對(duì)豐度分別為15.44%、5.99%、7.73%和2.39%。其中，織球殼菌屬（Plectosphaerella）占主要地位，其序列數(shù)在4個(gè)處理中分別占病原菌序列總數(shù)的89.99%，90.38%、85.96%、80.21%，占全部真菌系列總數(shù)的13.9%、5.4%、6.65%、1.92%。

2.3草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)如圖2所示，在門水平上（圖2A），優(yōu)勢(shì)菌門主要是子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和被孢菌門（Mortierellomycota），各處里中這3個(gè)門的總豐度均達(dá)80%以上。與CK相比，NCD-2和TB918處理的子囊菌門相對(duì)豐度明顯提高，擔(dān)子菌門和被孢菌門相對(duì)豐度明顯降低。

在屬水平上（圖2B），豐度在前15的優(yōu)勢(shì)菌屬是：被孢霉屬M(fèi)ortierella、Tausonia、毛殼菌屬Chaetomium、籃狀菌屬Talaromyces、織球殼菌屬Plectosphaerella、油壺菌屬Olpidium、錐蓋傘屬Conocybe、假裸囊菌屬Pseudogymnoascus、小囊菌屬M(fèi)icroascus、腐質(zhì)霉屬Humicola、Oliveonia、Solic-occozyma、鐮刀菌屬Fusanum、Kernia、Aspergillus。其中，前5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬在CK、Chem、NCD-2、TB918處理中的總相對(duì)豐度分別達(dá)到64.97%、63.88%、44.78%、40.21%，說(shuō)明它們可能在土壤真菌群落結(jié)構(gòu)中起重要作用：NCD-2和TB918處理與CK差異均較明顯的主要菌屬有被孢霉屬、Tausonia、毛殼菌屬、織球殼菌屬，均表現(xiàn)為被孢霉屬、Tausonia和織球殼菌屬相對(duì)豐度降低，毛殼菌屬相對(duì)豐度增加；其中毛殼菌屬的相對(duì)豐度分別是CK的8倍和28倍，織球殼菌屬相對(duì)豐度則由CK的13.9%分別下降到6.65%和1.90%。各處理Fusarium的相對(duì)豐度均較低，分別為0.81%、0、0.79%和1.16%。

2.4枯草芽孢桿菌對(duì)草莓根腐病的防治效果

分別于草莓定植1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月調(diào)查（表3），TB918在3個(gè)調(diào)查時(shí)間對(duì)草莓根腐病的防效分別為79.73%、73.91%和58.44%，NCD-2對(duì)草莓根腐病的防效分別為76.78%、76.02%和61.24%，Chem對(duì)草莓根腐病的防效分別為27.86%、35.21%和27.94%。同一調(diào)查時(shí)間段內(nèi)，TB918和NCD-2處理的草莓根腐病發(fā)病率差異不顯著，但均顯著低于Chem和CK，表明施用枯草芽孢桿菌能有效防治草莓根腐病。

2.5枯草芽孢桿菌對(duì)草莓的促生長(zhǎng)作用

由圖3可知，同一時(shí)間段內(nèi)枯草芽孢桿菌TB918和NCD-2處理對(duì)草莓各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響差異均不顯著，但相較Chem和CK均顯著增加；Chem處理中只在定植1個(gè)月時(shí)的冠徑比CK顯著增加，其他指標(biāo)差異不顯著。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌TB918和NCD-2可增加草莓冠徑、葉面積和葉片葉綠素含量，有效促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

3討論

3.1真菌多樣性指數(shù)與病害發(fā)生之間的關(guān)系

真菌作為根際微生物的重要組成部分，其群落多樣性與作物健康和土壤生態(tài)有很大的相關(guān)性，可利用Alpha多樣性來(lái)衡量一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)的微生物多樣性。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)施用外源微生物對(duì)土壤真菌多樣性影響的研究存在不同的結(jié)論，謝爾瓦尼木·阿不都艾尼等認(rèn)為枯草芽孢桿菌可以導(dǎo)致土壤真菌的Chao和Ace指數(shù)上升，Simpson指數(shù)下降，提高真菌的多樣性指數(shù)；熊冰杰等認(rèn)為施用適量生物菌有機(jī)肥可以提高土壤微生物多樣性，緩解三七連作障礙；Zhao等認(rèn)為枯草芽孢桿菌能有效防治馬鈴薯黃萎病，但降低了根際土壤真菌多樣性。為了明確施用枯草芽孢桿菌對(duì)草莓根際真菌多樣性的影響，本研究設(shè)置了兩種枯草芽孢桿菌處理，結(jié)果顯示，施人枯草芽孢桿菌能提高草莓根際真菌的Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)，降低Simpson指數(shù)，有效提升草莓根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性。試驗(yàn)中使用的枯草芽孢桿菌NCD-2與Zhao等使用的是同一株生防菌，但與其在馬鈴薯上的試驗(yàn)呈現(xiàn)出相反的多樣性結(jié)果，綜合分析認(rèn)為，作物病害發(fā)生與土壤真菌多樣性關(guān)系較為復(fù)雜，不同外源微生物以及同一種外源微生物在不同作物上均可能對(duì)土壤真菌多樣性產(chǎn)生不同的影響。

3.2真菌群落結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生之間的關(guān)系

雖然根際土壤微生物多樣性與病害發(fā)生之間的關(guān)系存在不同的研究結(jié)論，但是合理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在植物健康中發(fā)揮著重要作用。施人外源有益微生物能夠減少土壤病原菌的數(shù)量，重塑根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)土傳病害有明顯的抑制作用。田春麗等研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，鐮刀菌屬等病原菌的豐度顯著增加，斗管囊霉屬等有益菌的豐度顯著下降。本研究通過(guò)高通量測(cè)序，利用FUNGuild分析預(yù)測(cè)了土壤真菌群落的營(yíng)養(yǎng)型和功能，從生態(tài)功能視角探索真菌群落結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生之間的聯(lián)系。結(jié)果表明，經(jīng)枯草芽孢桿菌處理后，對(duì)作物有害的植物病原菌相對(duì)豐度大幅下降，對(duì)作物有益的腐生菌和共生菌相對(duì)豐度大幅提高；而化學(xué)對(duì)照中的植物病原菌、腐生菌和內(nèi)生菌的相對(duì)豐度均低于清水對(duì)照，說(shuō)明化學(xué)藥劑處理在殺滅病原菌的同時(shí)也削弱了有益菌。綜合分析認(rèn)為，施用枯草芽孢桿菌能夠減少病原菌數(shù)量，增加有益菌數(shù)量，優(yōu)化根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，達(dá)到防病和促生的作用。

3.3真菌種類與病害發(fā)生之間的關(guān)系

根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的改變降低了草莓根腐病的發(fā)生程度，為進(jìn)一步明確在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用的真菌類群，本研究分析了各處理在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)分析了Chaetomium和Plectosphaerella兩個(gè)相對(duì)豐度較大的屬。其中，Chaetomium是一類具有生物防治效果的有益真菌，能夠產(chǎn)生具球毛殼菌素等代謝產(chǎn)物，對(duì)大麗輪枝菌、灰霉菌和鐮刀菌等多種病原菌具有抑制作用，同時(shí)對(duì)植物還有促生長(zhǎng)作用。本研究中，枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918處理草莓根際土壤中Chaetomium，的相對(duì)豐度分別達(dá)到清水對(duì)照的8倍和28倍，說(shuō)明Chaetomium，在草莓根腐病的防治中發(fā)揮了重要作用，這為下一步嘗試使用Chaetomium類生防菌防治草莓根腐病提供了新思路。

Plectosphaerella是近年來(lái)在全世界各地被發(fā)現(xiàn)的能夠引起多種作物病害的一類新型致病菌。2014年國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了由黃瓜織球殼菌P.cu-cumerina引起的番茄萎蔫病，2020年美國(guó)馬薩諸塞州發(fā)現(xiàn)了由P.cucumerina引起的礬根草根腐病，2020年鄭州市發(fā)現(xiàn)了由P.cucumerina導(dǎo)致的草莓萎蔫病。本研究利用高通量測(cè)序分析也發(fā)現(xiàn)在山東地區(qū)的草莓土壤中存在Plecto-sphaerella，且其在清水對(duì)照中的相對(duì)豐度達(dá)到13.9%，經(jīng)枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918處理后分別下降為6.65%和1.92%。而草莓根腐病常見(jiàn)病原菌Fusarium在CK、Chem、NCD-2和TB918中的相對(duì)豐度均較低，由此推測(cè)Fusarium不是本試驗(yàn)中草莓根腐病的主要致病菌，而相對(duì)豐度較大的Plectosphaerella可能起了更主要的作用。這也表明山東地區(qū)可能存在由Plectosphaerella引起的草莓萎蔫病，下一步將結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果，平板定向分離鑒定Plectosphaerella，明確其在山東地區(qū)草莓上的致病性。

4結(jié)論

綜上，施用枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918可提高草莓根際土壤真菌群落多樣性，增加有益菌相對(duì)豐度，降低病原菌相對(duì)豐度，優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)；能有效防治草莓根腐病，增加冠徑、葉面積、葉片葉綠素含量等生長(zhǎng)指標(biāo)值，對(duì)作物有顯著的防病促生作用。結(jié)合高通量測(cè)序和真菌群落結(jié)構(gòu)分析，可以快速發(fā)現(xiàn)草莓根腐病發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵致病菌Plectosphaerella和潛在生防菌Chaetomi-um，為植物病害防治提供一種新策略。