XRN4/EIN5調控擬南芥對鹽脅迫和ABA的耐受性

關鍵詞：XRN4/EIN5；鹽脅迫；ABA；擬南芥；耐受性

中圖分類號：S567.239：Q943.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0040-07

植物生長受到很多環境因素如土壤中鹽濃度等的影響，當土壤中鹽濃度過高時，Na+大量積累，破壞植物體內的離子平衡，并伴隨著滲透脅迫和離子毒害，阻礙根系吸收水分，抑制種子萌發，降低光合作用，從而影響植物生長發育，嚴重時導致死亡，造成作物大幅減產。植物通過多種機制來感知并響應逆境脅迫，會合成小分子有機物或各類激素調控植物的耐受性，例如鹽脅迫會導致脫落酸（abscisic acid，ABA）濃度增加，從而使ABA信號通路被激活，改變下游基因表達，以響應高鹽環境。

ABA是植物中一種重要的脅迫類激素，能增強植物對低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫的耐受性。ABA也參與調控植物的生理過程，如抑制種子萌發和幼苗生長、調節根的發育、促進植物葉片的衰老和脫落等。被ABA調節的基因中，超過50%的還會受到干旱或鹽脅迫的調節，這表明ABA響應與干旱、高鹽等非生物脅迫信號通路之間存在明顯的交互作用。在棉花（Gos-sypium， hirsutum）中，過表達Gh WRKY17的植株ABA水平降低，活性氧（ROS）產生減少，導致植物對鹽和干旱的耐受性降低。在擬南芥（Ara-bidopsis thaliana）中，ABA的負調控因子RACK1A（Receptor for Activated C Kinase 1A）介導了miR393的表達，進而負調控擬南芥對鹽脅迫的耐受性。

除了ABA，植物體內的脅迫類激素還有乙烯、水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonicacid，JA）等，生長促進激素包括生長素、赤霉素、細胞分裂素等。很多研究表明，植物激素并不是單一發揮作用的，而是在不同環境、不同發育階段和不同組織中協同交互發揮調控功能。如ABA可與生長促進激素協同調控鹽脅迫響應。ABA誘導的側根原基啟動可能依賴于生長素，高鹽導致ABA過量積累時會改變生長素的分布，進而抑制側根發育。ABA與GA含量之比的改變與種子萌發密切相關。ABA也可與脅迫類激素交互作用調控植物對鹽脅迫的響應。在檸檬中，SA通過調控鹽脅迫下的GA/ABA比例平衡促進種子萌發。乙烯信號通路通過與ABA交互作用參與植物耐鹽性調控，乙烯受體ETR1和ETR2的功能缺失突變體etr1和etr2分別表現為耐鹽且對ABA不敏感和對鹽、ABA高度敏感。植物對鹽脅迫的應答是一種精巧有序、多種信號協同作用的結果。

植物XRN家族包括XRN2、XRN3、XRN4，是一類5′-3′核酸外切酶，主要參與rRNA的成熟加工過程和mRNA的代謝。其中XRN4主要參與細胞質中miRNA靶基因的3′末端剪切產物、miRNA*和外源RNA的降解。XRN4又被命名為EIN5，是乙烯信號通路的關鍵基因之一，通過特異降解乙烯負調控因子EBF1/2轉錄本促進乙烯信號轉導。乙烯不僅可調節植物生長發育，在植物遭受紫外線、病蟲害、創傷等逆境脅迫時也發揮著重要作用，XRN4/EIN5可能作為連接生長發育和脅迫響應的交叉點，但目前還不清楚其在植物應對高鹽等非生物脅迫中的作用。因此深入研究XRN4的功能對揭示植物生長發育和脅迫響應的調控機制具有重要的意義。

植物應對逆境脅迫時，很多基因表達發生變化，從而重塑機體生理和代謝過程以應對脅迫。ABA信號通路需要對很多基因的表達進行及時調控，這種調控可能涉及mRNA降解，如mRNA5′-3′降解相關基因的突變體dcp5-1對ABA介導的種子萌發高度敏感，lsm1a lsm1b和xrn4-5突變體對ABA介導的根生長高度敏感。目前對于XRN4/EIN5這個參與乙烯和ABA信號通路調控的多功能基因在鹽脅迫中的作用還不清楚。因此，本研究通過分析鹽脅迫對XRN4/EIN5突變體ein5-6生長發育的影響，探究乙烯和ABA信號通路對耐鹽性的交互作用。

1材料與方法

1.1植物材料

野生型擬南芥為哥倫比亞生態型Columbia（Col-0）。XRN4/EIN5 T-DNA插入突變體ein5-6種子購買自擬南芥生物資源中心（ABRC，ht-tps：//www.arabidopsis.org/）。

1.2脅迫處理及發芽率、綠化率、葉片數、葉片面積統計

挑選相同批次飽滿周正的擬南芥Col-0和ein5-6種子，分別裝入1.5 mL離心管中，加入1mL 75%乙醇消毒2 min，用3%次氯酸溶液消毒10 min，最后用滅菌水洗滌5次，以保證將次氯酸全部去除。用無菌的1mL槍頭均勻地將種子鋪在1/2MS固體培養基上，鹽脅迫的培養基中分別含有0、50、100、150、200 mmol/L NaCl，ABA處理的培養基中分別含有0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 μmol/L ABA（Sigma）。用鋁箔紙包裹平板，在4℃冰箱放置2天后轉至22℃培養箱中培養（16 h光照/8 h黑暗）。以胚根突破種皮，剛剛露白為萌發標準，統計各平板不同時間點的發芽率，待出現兩片子葉后開始統計綠化率。在第12天拍照并統計單株葉片數，測定葉片面積，其中，葉片數統計30株幼苗的，葉片面積測量5個葉片的，均取平均值。

1.3數據處理與分析

實驗所記錄的圖片由相機拍攝，圖片用Ado-be Illustrator CC 2018軟件處理。利用Image J軟件測量圖片中擬南芥葉片面積。利用GraphPadPrism 5軟件統計實驗數據并作圖。采用SPSS22.0軟件利用Student’s t-test進行差異性分析。

2結果與分析

2.1鹽脅迫下XRN4/EIN5突變對擬南芥種子萌發的影響

在正常的培養條件下，野生型Col-0和突變體ein5-6能夠全部發芽并長出子葉，最終發芽率均為100%（圖1A）。在鹽濃度為0～100mmol/L時（圖1A、B、C），ein5-6發芽早于Col-0，且處理60h內的發芽率明顯高于Col-0，之后與Col-0的相當（0～50 mmol/L）或低于Col-0（100 mmol/L）；當鹽濃度增加到150～200mmol/L時，ein5-6的發芽率總是比Col-0低（圖1D、E）。綜合來看，鹽濃度越高，Col-0和ein5-6的種子萌發越晚，發芽率越低，尤其ein5-6突變體的種子萌發對長時間高濃度鹽脅迫更敏感，處理96 h時的發芽率均比Col-0低。

2.2鹽脅迫下XRN4/EIN5突變對子葉變綠的影響

在子葉出現后統計綠化率，結果（圖2）發現，各濃度鹽處理下Col-0的子葉綠化率均隨著處理時間的延長呈升高趨勢，除200mmol/L NaCl處理外，最終均達到100%；而ein5-6的子葉僅能在正常培養條件下最終全部變綠，鹽濃度越高，綠化率越低。在鹽濃度為100 mmol/L及以下時，處理84 h內，ein5-6綠化率高，鹽濃度越低，與Col-0差異越大；之后則比Col-0低，且鹽濃度越高，降幅越大（圖2A、B、C）；當鹽濃度達到150 mmol/L時，ein5-6的綠化率低于Col-0，脅迫時間越長差異越明顯（圖2D）：鹽濃度為200 mmol/L時，Col-0和ein5-6的綠化率都大大降低，尤其ein5-6，子葉一直未能變綠，綠化率為零（圖2E）。當比較不同時間點的綠化率時，發現不同鹽濃度處理60h時，ein5-6的綠化率總是比Col-0高，而120 h時ein5-6的綠化率總是比Col-0低，表明ein5-6突變體的子葉綠化率對鹽脅迫更敏感。

2.3鹽脅迫下XRN4/EIN5突變對葉片數和葉片面積的影響

觀察并拍照第12天時擬南芥幼苗的生長表型，并統計葉片數和葉片面積。結果（圖3）表明，在正常條件下（0mmol/L NaCl），ein5-6突變體的葉片數和葉片面積顯著增加，分別比Col-0提高28.67%和55.73%，之后隨著鹽濃度的增加，Col-0與ein5-6突變體在葉片數和葉片面積上的差異逐漸減小：但當鹽濃度超過100 mmol/L后，二者之間的差異表現與之前相反，表現為ein5-6突變體的葉片數和葉片面積顯著低于Col-0，在鹽濃度為150 mmol/L時分別比Col-0降低54.06%和41.94%。

2.4 XRN4/EIN5突變對ABA的響應

ABA參與鹽脅迫響應的調節。為闡明ein5-6對鹽脅迫的敏感是否與ABA有關，對ein5-6進行ABA處理，結果（圖4）顯示，ein5-6對ABA的響應與對鹽脅迫響應的趨勢一致，ABA處理濃度越低、時間越短，子葉綠化率高于Col-0越明顯。但隨著ABA處理濃度的提高和時間的延長，ein5-6的子葉綠化率越來越低，最終明顯低于Col-0，表明ein5-6突變體對ABA更加敏感。

3討論與結論

本研究發現XRN4/EIN5突變后，擬南芥幼苗對高鹽脅迫和ABA處理比野生型更敏感，ein5-6突變體的種子發芽率、子葉綠化率、葉片數、葉片面積在高鹽脅迫下都明顯低于野生型Col-0，且子葉綠化率也隨著ABA濃度的增加比野生型降低更明顯。說明XRN4/EIN5基因在高鹽和ABA等非生物脅迫響應中發揮著重要作用。

ein5-6的子葉在正常情況下比Col-0大可能與乙烯通路有關。Zhang等發現過表達乙烯通路的轉錄激活子EIN3會產生乙烯通路增強的特征性表型——子葉變小，而突變EIN3或EIN5后子葉變大。宋士勇等研究表明，乙烯通路信號轉導基因EIN2參與了鹽脅迫響應的調節，突變體ein2-1的發芽率和根長統計結果表明其對鹽脅迫高度敏感，ein2-1對滲透脅迫和ABA也高度敏感，EIN2基因通過ABA依賴途徑調控擬南芥對滲透和鹽脅迫的反應，EIN2突變導致ABA含量增加。乙烯通路中的其他關鍵基因EIN3、ETR1突變后對非生物脅迫的敏感性也發生了變化。本研究表明乙烯通路的轉導基因EIN5突變后也導致了對鹽脅迫和ABA的敏感性增加。因此推測整個乙烯通路可能都參與了脅迫反應。

植物響應鹽脅迫的信號途徑主要有ABA信號通路、鹽過敏感（salt overly sensitive）信號通路、鈣依賴型蛋白激酶（calcium-dependent protein ki-nase，CDPK）級聯反應途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯反應途徑和磷脂信號通路等。ABA信號轉導不僅可以改變ABA應答基因表達的變化，也可以影響植物對非生物脅迫的響應。本研究發現XRN4/EIN5對鹽脅迫和ABA都高度敏感，未來可以通過實驗進一步探究XRN4/EIN5是否通過ABA信號途徑來介導鹽脅迫響應，如檢測鹽脅迫和ABA處理后XRN4/EIN5的表達水平變化，鹽脅迫下ABA通路相關基因的表達變化，這些基因在Col-0和ein5-6突變體中的表達差異，Col-0和ein5-6突變體中ABA含量的差異及其在不同鹽濃度處理下的變化，進而揭示ein5-6突變體中ABA信號通路和鹽脅迫響應的關系。