脫細胞技術在構建人工卵巢中的應用進展

[摘要]人工卵巢是天然卵巢的臨時替代品，是將分離的卵泡、卵巢基質細胞和生長因子組合并包裹到生物材料中而形成的卵巢類器官。人工卵巢可恢復患者的生育功能和部分分泌功能，其中構建適合卵泡生長的生物支架材料是人工卵巢的核心。脫細胞基質材料是通過物理、化學、生物酶或其他方法有效去除組織中的細胞及核物質，以獲得細胞外基質。這種細胞外基質因去除了組織中的細胞和核物質，表現為低免疫原性；同時最大程度地保留了卵巢的組織結構和功能性基質蛋白，從而有效促進細胞的黏附、增殖和分化。脫細胞基質材料被認為是目前最理想的卵巢生物支架材料。本文對脫細胞技術在構建人工卵巢中的應用進展進行綜述，以更好地理解其機制和優缺點，為進一步優化脫細胞技術在人工卵巢構建中的應用提供新思路。

[關鍵詞]人工卵巢；脫細胞技術；細胞外基質

[中圖分類號]R711[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.18.032

近年來，全球腫瘤發病率逐年升高，且呈年輕化趨勢。放化療是惡性腫瘤治療中不可缺少的部分，而放化療會不可避免地產生不良反應，如骨髓抑制和生殖毒性等。生殖毒性可導致絕大多數女性患者在接受放化療后出現卵巢早衰甚至生育功能喪失[1-2]。因此，這些患者保留生育能力的需求較為迫切。

人工卵巢是天然卵巢的臨時替代品[3]。人工卵巢在恢復患者生育功能的同時還能恢復患者的部分分泌功能。人工卵巢已成為近年來生育力保護研究的熱點，其中尋找適合卵巢細胞的生物支架材料是構建人工卵巢的核心。脫細胞基質材料是通過脫細胞技術有效去除組織或器官內的細胞和核物質，從而保留原有的組織結構和功能性基質蛋白，可有效促進細胞的黏附、增殖和分化，被認為是當前最理想的卵巢生物支架材料[4]。脫細胞技術主要是通過物理、化學、生物酶或多種方法聯合達到去除器官或組織內細胞及核物質的目的[5]。脫細胞基質材料的制備見圖1。對于卵巢脫細胞方案而言，目前還沒有標準的脫細胞方案，只有一組評價去除細胞效果的標準：①每毫克細胞外基質干重的雙鏈DNA含量<50ng；②DNA片段長度<200bp；③4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色無明顯核物質存在[6]。

1脫細胞化學試劑

1.1表面活性劑

表面活性劑是通過破壞磷脂細胞膜達到細胞溶解的目的。表面活性劑包括離子型（呈現正電荷或負電荷）、非離子型（含有不帶電荷的親水性基團）及兩性型（兼具離子型及非離子型表面活性劑特征）。

1.1.1十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉是目前使用最廣泛的離子型表面活性劑，其可快速、徹底地去除器官或組織內的細胞及核物質；但具有一定的細胞毒性，對組織蛋白也有一定的損傷，甚至會改變組織的微觀結構[7-8]。受十二烷基硫酸鈉的細胞毒性影響，所有用到這類試劑的脫細胞方案都需執行嚴格的洗滌方案，盡可能地去除殘留在材料中的化學試劑[9]。

1.1.2TritonX-100TritonX-100是一種非離子表面活性劑。TritonX-100對組織結構的影響較小，可較好地保存組織的完整性，但其對細胞外基質中的糖胺聚糖影響較大，在脫細胞過程中會造成糖胺聚糖的丟失，且單獨使用達不到組織和器官的脫細胞標準[10]。基于這種情況，這類試劑通常是作為輔助脫細胞試劑，與其他試劑聯合使用，從而達到減少其他化學試劑的濃度和作用時間的目的。

1.1.3CHAPSCHAPS是一種兩性表面活性劑，兼具離子型及非離子型表面活性劑的特征。CHAPS的優點是對基質中的蛋白無影響，包括膠原蛋白、彈性蛋白及纖維蛋白，更有利于保持基質的微觀結構；其缺點是會降低細胞外基質的機械性能。CHAPS對于較薄組織的脫細胞效果理想，但對于較厚組織的單獨使用則無法達到有效脫細胞的標準[11]。

1.2酸和堿

酸堿具有強腐蝕性和強氧化性。其脫細胞原理主要通過酸堿使組織蛋白變性，讓細胞內核酸受到破壞，進而使細胞膜和核物質增溶，從而達到破壞細胞的目的。酸堿對組織蛋白的破壞是對所有蛋白無差別的破壞，包括機體所需要的基質蛋白；同時，酸堿也會改變細胞外基質的機械性能。

1.2.1過氧乙酸過氧乙酸是一種易溶于水的弱酸，具有強腐蝕性和強氧化性。在豬膀胱源性細胞外基質的膠原纖維排列及雙向力學行為研究中發現，經過氧乙酸消毒處理的膀胱基質的膠原排列分布發生較大變化，進而影響基質的機械性能[12]。同時，對基質中的蛋白也有一定的影響，包括膠原蛋白、彈性蛋白、纖維蛋白、糖胺聚糖及一些信號蛋白[13]。

1.2.2氫氧化鈣、硫化鈉和氫氧化鈉氫氧化鈣、硫化鈉和氫氧化鈉等都易溶于水，其均是具有強腐蝕性和強氧化性的強堿性溶液。在早期脫細胞實驗中，主要用于去除樣本中的毛發[14]。Eivazkhani等[15]通過比較不同化學試劑（十二烷基硫酸鈉、氫氧化鈉）對卵巢組織的影響，發現氫氧化鈉比十二烷基硫酸鈉更適合卵巢組織脫細胞，在后期支持卵泡重建中表現出更好的效果。

2生物學方法

2.1生物酶

生物酶通過作用于特定蛋白破壞細胞及核物質，主要用于脫細胞方案的進一步優化，脫細胞效果與組織細胞外基質的結構特征及蛋白成分有很大的相關性。其優點是可選擇性地去除組織中的細胞及核物質；缺點是生物酶長時間的作用會對基質中的膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖等天然基質成分造成一定的損害[16]。鑒于生物酶長時間的使用會對基質蛋白造成破壞，在脫細胞處理時生物酶的使用需要嚴格把控作用時間。

2.2核酸酶

核酸酶一種作用于核苷酸鏈中磷酸二酯鍵的水解酶，通過水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，將DNA或RNA裂解成多個片段，從而有效去除組織內的核物質。但核酸酶只針對核物質，一般同其他脫細胞試劑聯合使用，目的是強化去除核物質。研究發現，核酸酶同脫氧膽酸鈉聯合應用可極大提高組織DNA的去除率[17-18]。

3物理方法

物理方法是利用物理原理裂解細胞并破壞細胞基質黏附蛋白，從而實現組織內細胞有效去除的方法。

3.1高滲、低滲溶液

高滲和低滲溶液脫細胞的機制主要是通過滲透休克破壞細胞的細胞膜結構并形成細胞碎片，同時也可干擾DNA與蛋白質之間的相互作用。然而，這種方式可對組織內細胞進行有效破壞，但細胞破壞后形成的大量細胞碎片及核物質卻殘留在組織內，無法有效從基質內移除[19]。因此，這種方式單獨使用時的脫細胞效果欠佳，通常需同其他方法聯合使用。

3.2凍融循環

凍融循環通常是指在-80℃和37℃之間反復進行冷凍-解凍交替循環，在凍融過程中組織或器官內細胞不斷形成冰晶，破壞細胞膜，從而實現細胞的破壞[20]。在具體的脫細胞方案中，可通過改變溫度差或改變凍融的次數尋找最合適的凍融溫度和凍融次數。甚至有文獻報道可將凍融循環持續整個脫細胞過程，得到的細胞外基質并不會因為凍融循環次數的增加而增加蛋白的丟失[21]。但單獨的凍融循環無法有效去除組織內殘留的核物質，需同其他方法聯合使用才能達到較好的脫細胞效果。

3.3高靜水壓

高靜水壓是指對組織或器官施加600MPa以上的壓力，通過高強度壓力破壞組織或器官細胞[6]。高靜水壓脫細胞時，較高的靜水壓破壞細胞的效果較好，但同時也會引起基質蛋白的變形，從而影響基質的機械性能。因此，高靜水壓的水壓必須控制在一定壓力之下，以確保不引起基質蛋白的機械性能改變。

3.4超臨界二氧化碳

超臨界流體具有似液體的密度及似氣體的擴散系數，其臨界溫度為31.1℃，臨界壓力為7.40MPa，與生物體系相容。超臨界流體的優點是可在類似于臨界點受控速度通過組織時，將組織中的細胞移除，可將組織的機械性能的破壞降到最低[22]。此外，二氧化碳是一種具有擴散性的氣體，不會殘留在組織內，因此不需要洗滌過程。然而，超臨界二氧化碳是非極性的，在對細胞膜等極性物質進行溶解時，需要添加極性夾帶劑（如乙醇），但添加這種新的夾帶劑會給組織引入新的雜質[23]。對于超臨界流體，目前已應用于多個臟器及組織的脫細胞處理中，并取得良好效果。在大鼠心臟組織、豬角膜、豬和牛心包及人類脂肪組織等方面，都已有明確報道成功應用超臨界流體方法對組織進行有效脫細胞的案列，同時保留了組織的結構和機械性能[24-27]。

3.5溫度

溫度主要是通過影響其他脫細胞試劑、酶及蛋白的活性間接影響脫細胞效果。不同溫度可能會導致蛋白含量和結構發生變化。Hashimoto等[28]在對角膜進行脫細胞研究中發現，角膜在不同溫度條件下脫細胞得到的脫細胞基質中的膠原和糖胺聚糖含量存在差異，10℃比30℃的保存效果更好。

4程序性細胞死亡

程序性細胞死亡是通過傳送合適的信號，有意激活細胞凋亡路徑。整個程序性死亡只是以組織內的細胞為目標，從而使組織內的細胞外基質得以完整保留[29]。與傳統的脫細胞方式不同，在程序性細胞死亡過程中，細胞沒有被破壞，而核物質是被包裹在細胞膜或凋亡小體內的[30]。因此，材料具有免疫原性的細胞成分或核物質成分均不會向基質中泄露，從而有效降低材料免疫排斥的發生[31-32]。通過誘導細胞凋亡得到的脫細胞細胞外基質還有一個潛在的優勢，即通過刺激鄰近祖細胞的增殖參與組織再生[33]。

5小結與展望

人工器官是近幾年的研究熱點，其可有效解決移植器官來源緊缺的問題，同時可有效減少因器官移植后長期免疫抑制治療對患者生活質量的影響，在骨骼、血管、皮膚等領域獲得了很好的效果。

人工卵巢領域的研究起步相對較晚，2015年Laronda等[34]才首次將脫細胞技術應用于構建卵巢生物支架材料。通過眾多研究者的不斷探索，卵巢脫細胞技術已取得很大進展，已先后獲得鼠、豬、牛和人等卵巢組織脫細胞基質。但就目前的卵巢脫細胞技術而言，仍存在諸多問題。如脫細胞基質內核物質殘留、脫細胞過程對基質的改變（包括基質功能蛋白的損傷、生物力學性能的改變以及細胞毒性作用）等。同時，人工卵巢也引發了一些倫理問題，如卵巢組織來源及捐贈者的知情同意和隱私保護，關于個人遺傳信息保護和隱私保護，人工卵巢使用對象的公平和公正等倫理問題。希望通過對人工卵巢這項新的醫療治療手段進行各方利益和權益的權衡，采取一系列措施確保其使用的安全、合法及符合倫理要求。相信在不久的將來，隨著研究者對各個環節關鍵技術的突破，將人工卵巢應用到臨床中并為卵巢衰竭患者提供新的治療方案。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–08–07）

（修回日期：2024–06–08）