外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能預測人工周期-凍融胚胎移植結局的價值

【摘要】 目的：探討外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能預測人工周期-凍融胚胎移植結局的價值。方法：選取2021年1月—2023年12月于贛州市人民醫院行人工周期-凍融胚胎移植的患者108例，其中妊娠成功48例，妊娠失敗60例。觀察比較妊娠成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3、D-二聚體（D-D）、活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶原時間（PT）的差異，并分析外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能指標預測人工周期-凍融胚胎移植結局的價值。結果：妊娠成功患者外周血miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失敗患者，APTT和PT均明顯長于妊娠失敗患者（P<0.05）。miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT是妊娠失敗的影響因素（P<0.05）。miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT預測妊娠失敗的受試者操作特征（ROC）曲線下面積分別為0.857、0.790、0.922和0.861。結論：人工周期-凍融胚胎移植成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3及D-D和PT有所差異，且在預測妊娠結局方面有一定應用價值。

【關鍵詞】 miR-21-5p Foxp3 凝血功能 人工周期-凍融胚胎移植 預測價值

Value of Peripheral Blood miR-21-5p， Foxp3 and Coagulation Function in Predicting the Outcome of Artificial Cycle - Frozen Embryo Transfer/LEI Chengyong， LI Li， LUO Zhaoxia， HUANG Ying. //Medical Innovation of China， 2024， 21（18）： -143

[Abstract] Objective： To explore the value of peripheral blood miR-21-5p， Foxp3 and coagulation function in predicting the outcome of artificial cycle - frozen embryo transfer. Method： A total of 108 patients who underwent artificial cycle - frozen embryo transfer in Ganzhou People's Hospital from January 2021 to December 2023 were selected， of which 48 had successful pregnancy and 60 had failed pregnancy. The differences of miR-21-5p，

Foxp3， D-dimer （D-D）， activated partial thromboplastin time （APTT） and prothrombin time （PT） in peripheral blood of patients with successful and failed pregnancy were observed and compared. The value of miR-21-5p， Foxp3 and coagulation function indexes in peripheral blood in predicting the outcome of artificial cycle - frozen embryo transfer was analyzed. Result： The peripheral blood miR-21-5p， Foxp3 mRNA and D-D of the patients with successful pregnancy were higher than those of the patients with failed pregnancy， and APTT and PT were significantly longer than those of the patients with failed pregnancy （P<0.05）. miR-21-5p， Foxp3 mRNA， D-D and PT were the influential factors of pregnancy failure （P<0.05）. The receiver operator characteristic （ROC） area under the curve of miR-21-5p， Foxp3 mRNA， D-D and PT for predicting pregnancy failure were 0.857， 0.790， 0.922 and 0.861， respectively. Conclusion： miR-21-5p， Foxp3， D-D and PT in peripheral blood of patients with successful and failed artificial cycle - frozen embryo transfer are different， and they have certain application value in predicting pregnancy outcome.

[Key words] miR-21-5p Foxp3 Coagulation function Artificial cycle - frozen embryo transfer Predictive value

First-author's address： Department of Reproductive Medicine， Ganzhou People's Hospital， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.18.032

凍融胚胎移植（frozen embryo transfer， FET）作為輔助生殖技術的一部分，已逐漸成為提高不孕不育夫婦妊娠率的重要策略。據統計，我國的不孕癥患病率為7%～10%，這不僅對育齡夫婦的身心健康構成了嚴重影響，也對家庭和社會和諧造成了負面影響[1]。雖然FET具有周期短、胚胎利用率高和并發癥發生率低等優點，但其成功率仍不夠高，據報道，我國FET的成功率為38.60%～68.42%，這一數據顯然還有提升的空間[2]。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）這一類非編碼小分子RNA在生殖醫學領域引起了廣泛關注。miRNA通過在轉錄后水平調節基因的表達，影響卵巢功能和子宮內膜的容受性，從而可能影響到FET的成功率[3]。有研究證實，miR-21-5p在多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）大鼠中的表達降低，其高表達能促進卵巢顆粒細胞的增殖并抑制細胞凋亡，這可能對FET的成功率有著潛在的影響[4]。此外，免疫系統在妊娠中也發揮著關鍵作用。Foxp3作為調節性T細胞的重要亞型，通過分泌的細胞因子如白介素-10，能顯著地調節免疫應答，降低免疫系統的過度活躍，從而維護正常妊娠[5]。有研究表明，Foxp3信使核糖核酸（Foxp3 messenger RNA，Foxp3 mRNA）在黃體期的低表達與反復植入失敗之間存在關聯[6]。凝血功能的平衡對胚胎著床至關重要，凝血功能障礙可能通過干擾胚胎著床進而影響妊娠結果[7]。盡管凝血指標在預測妊娠結局方面的作用受到認可，但具體應用哪些指標來預測妊娠結局在學術界尚未形成共識?；诖?，本研究旨在綜合探討miRNA、免疫應答及凝血功能對FET患者妊娠率的影響，以期為提高FET的成功率提供更為深入和全面的科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—2023年12月于贛州市人民醫院行人工周期-FET的患者108例。納入標準：（1）年齡20～40歲；（2）內分泌激素水平正常；（3）月經周期規律，有優勢卵泡；（4）近3個月未使用激素類藥物。排除標準：（1）有子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等子宮疾?。唬?）有吸毒等不良嗜好；（3）有精神疾病；（4）有腹部手術史。本次研究獲得本院醫學倫理委員會批準。患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 人工周期-FET 在進行子宮內膜的準備時，本研究采取激素替代療法。胚胎通過玻璃化冷凍法（Vitrolife公司，冷凍解凍試劑盒）進行冷凍保存，并在移植當日通過玻璃化解凍法（Vitrolife公司，冷凍解凍試劑盒）進行解凍。通過B超技術，監測子宮內膜的厚度和形態，并根據需要調整雌激素的劑量，直至增殖期子宮內膜厚度達到或超過8 mm。在子宮內膜達到適宜厚度后的第4天，進行胚胎移植。移植前，評估胚胎卵裂球的完整性，并將存活率達ymrrqBiUajywxRX5pbelmOFLBzdNr3RNtH4DJE1kttk=到或超過50%的卵裂球定義為健康的胚胎，以便進行移植。妊娠成功標準：胚胎移植35 d后行陰道B超檢查，顯示子宮腔內有妊娠囊及胎心搏動。

1.2.2 指標檢測 （1）miR-21-5p?；颊呖崭範顟B下采集3 mL外周靜脈血樣，用北京天根公司提供的試劑盒進行實驗。首先，使用miRNA提取試劑盒從血液樣本中分離出總miRNA；接下來，應用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的miRNA逆轉錄成cDNA；隨后，進行miRNA熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）分析，使用針對miR-21-5p和內參基因U6的專一性引物進行。PCR反應遵循的程序包括：先在95 ℃下預變性3 min，然后95 ℃下15 s、60 ℃下34 s，循環40輪。通過PCR獲得的循環曲線和循環閾值（Ct）來分析數據，以U6作為內參基因，采用2-ΔΔCt的方法來計算miR-21-5p的相對表達量。（2）Foxp3。采集患者4 mL的靜脈血樣本并使用乙二胺四乙酸作為抗凝劑，隨后以1︰1的比例使用PBS溶液進行稀釋。接著，利用淋巴細胞分離介質進行單核細胞的分離，并調整細胞濃度至1×106/L。取100 μL的細胞懸液，分別添加20 μL的CD4-PE和CD25-FITC標記抗體，于室溫下暗處孵育20 min。之后，加入冷PBS進行洗滌并進行離心，去除上清并添加2 mL的細胞破膜液，在4 ℃暗處孵育1 h。經過兩次洗滌后，加入2 μL的小鼠血清進行封閉，孵育20 min。隨后加入20 μL的Foxp3抗體，在4 ℃暗處孵育30 min，再次洗滌兩次后，使用Beckman Coulter生產的CytoFLEX流式細胞儀進行分析檢測。（3）凝血功能指標。利用Sysmex CA-6000 Series全自動血液分析儀檢測D-二聚體（D-dimer，D-D）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin，APTT）和凝血酶原時間（prothrombin time，PT）。

1.3 統計學處理

數據分析采用SPSS 22.0軟件。計量資料包括年齡、miR-21-5p等，用（x±s）表示，用獨立樣本t檢驗分析組間差異；計數資料包括不孕類型等，用率（%）表示，用字2檢驗分析組間差異；預測妊娠失敗的價值采用受試者操作特征（ROC）曲線分析；妊娠失敗的影響因素采用logistic回歸分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 妊娠成功和失敗患者的臨床資料比較

本次研究妊娠成功48例，納為妊娠成功組，妊娠失敗60例，納為妊娠失敗組。兩組年齡、體重指數、不孕類型和病因比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 妊娠成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能指標比較

妊娠成功組miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失敗組，APTT和PT均明顯長于妊娠失敗組（P<0.05）；兩組TT比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 多因素分析

將miR-21-5p（實測值）、Foxp3 mRNA（實測值）、D-D（實測值）、APTT（實測值）和PT（實測值）作為自變量，妊娠結局（成功=0，失敗=1）作為應變量進行logistic回歸分析，結果顯示：miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT是妊娠失敗的影響因素（P<0.05），見表3。

2.4 miR-21-5p、Foxp3及凝血功能預測妊娠結局的價值

miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT預測妊娠失敗的ROC曲線下面積分別為0.857、0.790、0.922和0.861，見表4和圖1。

3 討論

在輔助生殖技術領域，FET是一種常見的臨床實踐，旨在提高妊娠成功率并改善生殖結局[8]。然而，FET的成功率受多種生物學和臨床因素的影響，這些因素包括但不限于內分泌狀態、胚胎質量、免疫和凝血功能的變化。因此，尋找能夠預測FET成功率的生物標志物是當前研究的熱點之一。

在本研究結果中，妊娠成功組和妊娠失敗組年齡、體重指數、不孕類型和病因的比較，差異均無統計學意義，這表明這些因素不會對患者的妊娠結局產生顯著影響。另外，妊娠成功患者外周血

miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失敗患者，APTT和PT均明顯長于妊娠失敗患者（P<0.05），提示這些指標可能與妊娠結局具有密切相關性。進一步將miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D、APTT和PT作為自變量進行logistic回歸分析，結果顯示這些變量（除APTT外）是妊娠失敗的獨立影響因素，這強化了單變量分析的發現，即這些變量可能直接或間接影響妊娠結局。由此，本研究通過ROC曲線分析發生，miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT在預測妊娠失敗方面顯示出較好的價值，這為臨床實踐中改進妊娠結果提供了潛在的生物標志物。

分析原因為，miR-21已被發現在PCOS患者的卵巢顆粒細胞和卵泡液內表達異常，這種表達與顆粒細胞內的游離睪酮和游離雄激素水平緊密相關[9-10]。李紅娟等[11]的研究表明，在PCOS大鼠模型中，miR-21-5p的表達水平顯著降低，而高表達miR-21-5p能夠有效抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，這一發現表明miR-21-5p在保護卵巢顆粒細胞、維持其正常功能方面具有重要作用。張麗等[12]的研究進一步支持了這一觀點，他們發現miR-21-5p表達水平的降低與PCOS患者不孕發顯著相關。具體機制可能涉及以下幾個方面：首先，miR-21-5p表達降低會促進卵巢顆粒細胞的凋亡，而顆粒細胞在卵泡發育和成熟過程中起著關鍵作用，其過度凋亡會影響卵泡的正常發育；其次，顆粒細胞是卵泡的重要組成部分，miR-21-5p的低表達可能通過促進顆粒細胞凋亡，進而影響卵泡的發育過程，導致排卵異常和不孕；最后，miR-21-5p的低表達可能導致卵泡發育不良和卵泡數量減少，從而降低卵巢儲備功能，影響生育能力[13]。

Foxp3是一種關鍵的轉錄因子，主要在調節性T細胞中表達，對于T細胞的功能分化具有決定性的作用[14]。具體來說，Foxp3通過促進T細胞向調節性T細胞的分化并抑制Th1細胞的活性，建立一種抗炎和免疫耐受的環境，這對于胚胎免受母體免疫系統攻擊至關重要。調節性T細胞釋放的抑制性細胞因子，如TGF-β和IL-10進一步促進了這種耐受環境，幫助維持妊娠的穩定。因此，Foxp3不僅是細胞分化的調節器，也是維持妊娠所需免疫平衡的關鍵因素，對于確保母體對胚胎的免疫耐受、促進妊娠的順利進行具有重要意義。在文獻[15]的研究中指出，在體外受精及胚胎移植過程中不成功的患者，其外周血中的Foxp3的表達呈現下降趨勢，本研究結果與之一致。

D-D是纖維蛋白降解的產物，反映了體內纖維蛋白的生成和降解情況。較高的D-D水平表明體內有更活躍的纖維蛋白代謝，這在一定程度上反映了胚胎植入成功后對局部微血管的修復和重塑需求增加[16]。其次，成功妊娠需要一個良好的子宮內膜環境，較高的D-D水平可能與更好的子宮內膜血供和適應性變化相關，可幫助支持胚胎植入和早期發育[17]。此外，D-D水平升高還與免疫系統的調節有關，成功妊娠過程中，免疫系統需要在保護胚胎免受母體免疫攻擊和防止感染之間保持平衡，適度的凝血活動和纖溶系統的參與有助于這一過程[18]。最后，妊娠成功不僅依賴于局部子宮內環境的變化，還涉及母體系統性適應，包括血液凝固機制的調整，較高的D-D水平反映了母體對妊娠的適應性反應，如血液流變性的改變，以支持胎盤和胚胎的發育。PT是評價外源性凝血途徑和共同凝血途徑的一個指標。妊娠移植失敗患者中，D-D水平較低，PT縮短主要反映凝血系統功能紊亂，這可能導致子宮內膜對胚胎的支持不足，影響胚胎的正常植入和發育[19-20]。

綜上所述，人工周期-FET妊娠成功和失敗患者外周血miR-21-5p、Foxp3及D-D和PT指標有所差異，且在預測妊娠結局方面有一定應用價值。

參考文獻

[1] LAWRENZ B，MELADO L，FATEMI H M.Frozen embryo transfers in a natural cycle： how to do it right[J].Curr Opin Obstet Gynecol，2023，35（3）：224-229.

[2] ZHANG Y，FU X，GAO S，et al.Preparation of the endometrium for frozen embryo transfer： an update on clinical practices[J].Reprod Biol Endocrinol，2023，21（1）：52.

[3] ZHU Y，CAI Y，ZHENG B，et al.Alteration of lncRNA expression in mice placentae after frozen embryo transfer is associated with increased fetal weight[J].Reprod Biol，2022，22（2）：100646.

[4] CAO M， ZHAO Y， CHEN T，et al.Adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal microRNAs ameliorate polycystic ovary syndrome by protecting against metabolic disturbances[J].Biomaterials，2022，28（8）：121739.

[5]王貝貝，馬麗麗，曹宇新.孕晚期胎膜早破孕婦陰道內菌群變化、外周血單個核細胞FoxP3、STAT5表達及妊娠結局[J].中國計劃生育學雜志，2022，30（12）：2816-2820.

[6]曾彬，于婉瑩，李翠，等.外周血自然殺傷細胞、Treg細胞和Foxp3表達與體外受精胚胎移植術不良結局的相關性及預測價值研究[J].中國醫刊，2021，56（1）：85-87.

[7]宋家美，陳靜思，鄧玉梅，等.不孕癥女性IVF助孕前后凝血四項及D二聚體變化與妊娠結局[J].昆明醫科大學學報，2021，42（1）：85-88.

[8]王春艷，王婕妤，程靜嫻，等.輔助生殖技術與子代安全[J].國際生殖健康/計劃生育雜志，2023，42（3）：226-230.

[9] NAJI M，ALEYASIN A，NEKOONAM S，et al.Differential expression of miR-93 and miR-21 in granulosa cells and follicular fluid of polycystic ovary syndrome associating with different phenotypes[J].Sci Rep，2017，7（1）：14671.

[10]陳惠香，魏孫祥，王哲，等.基于miR-451a/miR-21-5p的表達量關系鑒別月經血與外周血[J].中國法醫學雜志，2022，37（5）：476-480，484.

[11]李紅娟，唐小珂，王雅莉.微RNA-21-5p靶向PDCD4基因對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細胞增殖、凋亡的影響及其分子機制研究[J]. 中華生物醫學工程雜志，2019，25（4）：450-454.

[12]張麗，李友云，王永超，等.外周血miR-21-5p表達對多囊卵巢綜合征不孕患者人工授精結局的預測價值[J].分子診斷與治療雜志，2021，13（1）：87-90.

[13] QIU F，TONG H，WANG Y，et al.Inhibition of miR-21-5p suppresses high glucose-induced proliferation and angiogenesis of human retinal microvascular endothelial cells by the regulation of AKT and ERK pathways via maspin[J].Biosci Biotechnol Biochem，2018，82（8）：1366-1376.

[14]黃葉芳，朱博玉，王妍，等.銀甲片通過糾正外周血Th17/Treg平衡改善慢性輸卵管炎大鼠不孕[J].中國現代應用藥學，2023，40（19）：2635-2642.

[15]李瑾然，吳瑛，高倩，等.外周血凝血功能指標對凍融胚胎移植妊娠結局影響研究[J].中國實用婦科與產科雜志，2023，39（9）：953-956.

[16]李蘭，李偉偉.β-HCG、Hcy、CA125、D-D及FIB聯合檢測在預測早期流產中的價值[J].國際檢驗醫學雜志，2021，42（3）：266-269.

[17]左延娟，劉艷麗，馬園園.孕早期D-D、AMH和P水平聯合預測先兆流產保胎結局的作用研究[J].中國優生與遺傳雜志，2021，29（1）：43-46.

[18]耿玲玲，邱建國，張文華，等.超聲多模態評分及sFlt-1、D-Dimer對原因不明復發性流產妊娠結局的預測[J].新疆醫科大學學報，2023，46（11）：1490-1495.

[19]李燕燕，李雄英.低分子肝素對復發性流產患者凝血功能、血栓彈力圖的影響[J].中國性科學，2023，32（1）：52-55.

[20]蔡丹，黃向紅，張遠芳，等.血栓彈力圖與常規凝血檢測評估早期復發性流產患者凝血功能及指導抗凝治療的預后比較[J].生殖醫學雜志，2023，32（1）：55-60.

（收稿日期：2024-04-24） （本文編輯：陳韻）