北京地區蒙古櫟(Quercus mongolica)外生菌根真菌群落特征

趙譽涵 孫佳琦 孫靜雙 崔建輝 冷平生 胡增輝

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.018

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.018

收稿日期：2023-03-31? 修回日期：2023-06-19

基金項目：北京農學院揭榜掛帥項目（20230079）；北京市教委生態修復工程學高精尖學科建設項目（GJJXK21010）。

第一作者：趙譽涵，女，碩士研究生，研究方向為園林植物生理生態。E-mail：zhaoyuhan1010@163.com

通信作者：冷平生，男，博士，教授，碩士生導師，從事園林植物生理生態研究。E-mail：lengpsh@tom.com

胡增輝，男，博士，教授，博士生導師，從事園林植物生理生態研究。E-mail：buahuzenghui@163.com

摘? 要? 為揭示北京地區蒙古櫟（Quercus mongolica）外生菌根真菌群落特征，選取北京農學院林場、云蒙山國家森林公園和百花山國家級自然保護區3個蒙古櫟山區自然分布地，以及奧林匹克森林公園和中關村森林公園2個平原引種地為采樣地，采集土壤和生有外生菌根的蒙古櫟根部樣品，檢測其土壤理化及酶活性指標，采用ITS高通量測序技術對其外生菌根真菌群落進行測定，初步分析真菌群落多樣性與環境因子之間的相關性。結果表明，平原采樣地和山區采樣地的土壤特性存在明顯差異，山區分布地的全氮、速效磷含量以及磷酸酶活性較高，而平原引種地的pH、全磷含量較高。測序后經過OTU注釋和α多樣性分析，發現絨蓋牛肝菌屬（Xerocomellus）、絲膜菌屬（Cortinarius）、紅菇屬（Russula）、塊菌屬（Tuber）為北京地區蒙古櫟主要外生菌根真菌類群，但各采樣地的優勢菌各不相同，并且平原采樣地蒙古櫟根部外生菌根真菌群落多樣性指數低于山區采樣地。真菌群落與環境因子相關性分析表明，土壤全氮含量、全磷含量、速效磷含量、碳氮比、磷酸酶活性、海拔、坡度等與真菌多樣性關系密切。

關鍵詞? 蒙古櫟；外生菌根真菌；真菌多樣性；土壤理化指標；環境因子

外生菌根是外生菌根真菌侵染植物未木栓化的根系幼嫩部位形成的共生體。研究表明，外生菌根對于植物的營養吸收［1］、生長發育［2］、生理代謝［3-5］、抗逆性［6-10］等均有不同程度的提升和促進作用，并在生態系統物質循環和能量流動、及維持生態系統穩定性等方面具有重要意義［11］。

殼斗科櫟屬植物作為中國天然林中的第一大類樹木，是中國山區森林群落重要的建群種和優勢種。蒙古櫟（Quercus mongolica）是殼斗科櫟屬的落葉大喬木，抗逆性強，觀賞性高，是優質的生態景觀樹種。近年來，國內關于蒙古櫟遺傳育種［12-13］、種苗性狀［14-15］、生長特性［16-21］、繁殖［22］、抗逆［23］及群落空間結構［24］等方面的研究已逐漸開展。蒙古櫟是外生菌根依賴型樹種，雖然已通過接種方式證明外生菌根在其生長發育及環境適應中發揮著重要作用［25］，也對一些地區的蒙古櫟根際土壤的真菌類群多樣性［26-28］進行了分析，但對于其重要分布地北京地區群落組成還缺乏足夠的認知。

目前已發現的外生菌根真菌有34科、90屬，約5 000～6 000種［29］，主要類群屬于擔子菌亞門（Basidiomycota）和子囊菌亞門（Ascomycota），少部分為接合菌亞門（Zygomycota）［30］。菌根真菌賴以生存的土壤內部結構性質復雜多樣，受海拔、經緯度、坡度、光照、降水等非生物因子影響，還受動物、植物、真菌和細菌等生物因素影響，同時土壤的理化性質、營養元素、酶活性等土壤特征也會影響外生菌根真菌的多樣性和豐富度［31-32］。明確不同因素對外生菌根真菌分布和豐度情況的影響是了解外生菌根資源，進而開發利用的關鍵。

本研究以北京地區的蒙古櫟為對象，測定土壤理化性質，利用ITS高通量測序技術分析其根部外生菌根真菌群落多樣性，以此來了解北京地區蒙古櫟外生菌根真菌群落組成及分布特點，對其原生地和引種地土壤特性以及形成的外生菌根真菌多樣性進行分析，明確多樣性規律和影響因素，為促進蒙古櫟外生菌根真菌的功能研究及其推廣應用提供參考和支撐。

1? 材料與方法

1.1? 采樣地概況

選取北京農學院林場（116°27′E，40°53′N，LC）、云蒙山國家森林公園（116°43′E，40°33′N，Y）、百花山國家級自然保護區（115°34′E，40°53′N，B）3個北京山區的蒙古櫟自然分布地以及中關村森林公園（116°22′E，40°1′N，ZGC）和奧林匹克森林公園（116°17′E，40°3′N，A）2個北京城區的平原引種地作為采樣地，其主要生態因子及林分特征見表1。

北京農學院林場位于北京市懷柔區寶山鎮四道河村，屬溫帶半干旱大陸性季風氣候，年平均氣溫比平原地區低，年降雨量較高。云蒙山國家森林公園位于北京市密云區的西北部地區，與懷柔區相連，氣溫低，空氣濕度良好，通風良好，其森林覆蓋率極高，約為95%左右。百花山國家級自然保護區位于北京地區西部的門頭溝區清水鎮，屬于溫帶大陸性季風氣候，晝夜溫差大，氣溫較平原地區偏低，降水量較多，四季分明，春季干旱多風沙，夏季溫熱多雨，秋季晴朗少風少雨，冬季寒冷多風干燥，其地帶性植被為暖溫帶落葉闊葉林。中關村森林公園位于北京市海淀區唐家嶺，園中有大量植被，森林覆蓋率高。奧林匹克森林公園位于北京市朝陽區北五環林萃路，屬溫帶大陸型半濕潤季風氣候。

1.2? 樣品采集與處理

在5個蒙古櫟林采樣地群落中設置20 m×20 m的樣地，沿S型曲線隨機選取5棵樹。除去蒙古櫟主干周圍1 m區域內的雜草及枯落物，用鐵鍬在表層0～20 cm沿主根生長方向尋找與主根連接的側根，將帶有須根的土塊裝入采樣袋中并編號。每棵樹采集3個方位的3個樣品，共采樣75袋，及時保鮮，時間不得超過10 d。將取回的土壤用抖落法獲得根際土壤，放置通風、干燥、涼爽處，風干后過0.25 mm細篩備用。將菌根表面的泥土洗刷干凈，剪成2～3 cm的小段，每棵樹隨機挑選15個根段，分成3組編號并放在2 mL的離心管里，用液氮冷藏后儲存于-80 ℃超低溫冰箱，然后送武漢康測公司進行絕對定量ITS? 測序。

1.3? 土壤理化性質測定

土壤酶活性統一采用關松蔭［33］的方法測定，土壤過氧化氫酶用H2O2滴定法測定，土壤蔗糖酶采用硫代硫酸鈉滴定法測定，土壤脲酶用靛酚藍比色法測定，土壤磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定。土壤全磷與全鉀的含量采用硫酸與高氯酸消煮ICP測量法，全氮的含量采用國標半微量凱式法，有機質的含量采用國標重鉻酸鉀法，土壤pH用電位法測定（水∶土=1∶1）。

1.4? DNA提取、PCR擴增與測序

蒙古櫟菌根DNA的提取使用天根植物基因組DNA提取試劑盒。將模板DNA用F引物擴增1個循環，擴增結束后，用Ampure XP磁珠純化。然后使用正向引物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和反向引物ITS1R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′擴增ITS1區。PCR程序為：95 ℃，3 min→（95 ℃，30 s；? 60 ℃，30 s；72 ℃，45 s）×35→72 ℃，10 min→? 4 ℃ hold；反應體系為5×PCR Buffer 10 μL，10 mM dNTPs 1 μL，F和R引物各1 μL，KAPA HiFi DNA Polymerase 1 μL，模板DNA 10 ng。最后，用Ampure XP磁珠純化回收PCR產物，采用NanoDrop檢測純度并定量，純化后的擴增產物等物質的量混合，采用Novaseq PE150進行測序。

1.5? OTU聚類和分析

將測序數據預處理，所得的原始數據要進行序列拼接、序列過濾。獲得有效序列后，將OTU序列與真菌ITS數據庫的模板序列進行比對，獲取每個OTU的分類學信息。使用UID去重、糾錯后進行OTU聚類和物種分類。然后計算各組共有或特有的OTU數量并采用韋恩圖進行展示。最后，使用QIIME軟件分別對每組樣本計算α多樣性指數，包括Chao1、Simpson和Shannon指數，進行β多樣性分析［34］，確定環境因子對真菌群落影響程度，并分析明確菌根真菌與環境因子的相關性。

2? 結果與分析

2.1? 不同采樣地土壤理化指標

不同采樣地土壤環境pH和電導率之間存在明顯差異（圖1）。5個采樣地土壤pH為5～8，除ZGC外其余采樣地基本呈現弱酸性，其中ZGC的pH最高為7.84，B的pH最低為5.17（圖1-A）。5個采樣地土壤EC值為10～25?? μS·cm-1，其中B的EC值為23.8?? μS·cm-1，顯著高于其他采樣地，其他采樣地間無顯著性差異（圖1-B，? P＜0.05）。

各采樣地間的土壤養分含量也存在明顯差異（圖2）。平原采樣地的土壤全氮含量顯著低于山區采樣地，其中Y含量最高，A最低，含量約為Y的1/5（圖2-A）。土壤全磷含量平原采樣地顯著高于山區，其中ZGC、A約為其他采樣地的2倍（圖2-B），而其土壤速效磷含量卻顯著低于B、Y、LC山區采樣地，其中最高的Y與最低的ZGC的土壤速效磷含量相差5.5 mg·kg-1 （圖2-C）。ZGC土壤全鉀含量顯著高于其他采樣地，達到? 7 810 mg·kg-1，其余各采樣地間差異不顯著（圖2-D，P>0.05）。B與LC的土壤速效鉀明顯高于其他采樣地，其中含量最高的LC約為最低ZGC的5倍，A顯著低于B與LC但高于Y和ZGC （圖2-E，P＜0.05）。ZGC的土壤有機質顯著低于其他采樣地，僅為94.59 g·kg-1，A和Y顯著高于ZGC但低于B和LC （圖2-F，P＜? 0.05）。A的土壤C/N顯著高于其他采樣地，其余各采樣地間無顯著差異（圖2-G，P>0.05）。

不同采樣地的4種土壤酶活性見圖3。B的土壤過氧化氫酶活性顯著低于其他采樣地（P＜0.05），值為0.66 mg·（g·d）-1，其余采樣地之間無明顯差異（P>0.05），均在0.7～0.8?? mg·（g·d）-1間（圖3-A）。各采樣地的土壤蔗糖酶活性均在6.18～7.52 mg·g-1·d-1之間，除了Y較低，其他采樣地之間無顯著差異（圖3-B，P>0.05）。除A土壤脲酶活性為18.79?? mg·g-1·d-1顯著低于B與ZGC，其他采樣地則差異不顯著（圖3-C，P>0.05）。平原的土壤磷酸酶活性顯著低于山區，其中ZGC最低，為5.26 mg·g-1·d-1，約為最高值Y的1/5，山區之間差異不顯著（圖3-D，P>0.05）。

2.2? 蒙古櫟外生菌根真菌多樣性

不同采樣地蒙古櫟外生菌根真菌測序數見表2，通過標記覆蓋率可以看出5個蒙古櫟菌根真菌調查地樣品檢測的標記覆蓋率均達到99.9%以上，說明數據可靠，可以進行下一步分析。通過OUT讀長可知ZGC的OTU最多為463 353.4，LC的OTU最少為52? 343條，5個采樣地 OUT數排序為 ZGC>A>Y>B>LC。

蒙古櫟外生菌根真菌組成在屬水平的分布見圖4，5個采樣地主要的真菌分別是枝孢瓶霉屬Cladophialophora屬、磚格孢屬（Dictyosporium）、扁孔腔菌屬（Lophiostoma）、青霉屬（Penicillium）、塊菌屬（Tuber）、鬼傘屬（Coprinopsis）、粉褶菌屬（Entoloma）、被孢霉屬（Mortierella）、阿太菌屬（Piloderma）、絨蓋牛肝菌屬（Xerocomellus）、絲膜菌屬（Cortinarius）、鐮刀菌屬（Fusarium）、南極樹粉孢屬（Oidiodendron）、紅菇屬（Russula）、錘舌菌屬（Leotia）、籃狀菌屬（Talaromyces）。扁孔腔菌屬、磚格孢屬、南極樹粉孢屬、塊菌屬、絨蓋牛肝菌屬在A表現出較高的富集。還有些屬只存在于部分地區的部分樣本中，如籃狀菌屬在A、ZGC北京平原地區的含量較多，錘舌菌屬、粉褶菌屬只在B的個別樣品中存在，紅菇屬在B、LC、Y的樣本中含量較多，被孢霉屬、阿太菌屬在B、LC中含量較多，絲膜菌屬和青霉屬在Y富集。

5個采樣地蒙古櫟根部外生菌根真菌種類的Venn圖見圖5。5個采樣地中有5種共有真菌，其中A有2 419種真菌，區別于其他地區的差異菌有847種。ZGC有2 610種真菌，其中差異于其他地區的有848種真菌。Y共有2 978種真菌，其中有764種真菌與其他地區相比有差異。LC有2 294種真菌，區別于其他地區有466種差異真菌。B有1 959種真菌，差異菌有821種。各個采樣點都存在著大量相同菌落，同時也存在不同的差異真菌，不同的立地條件導致菌根真菌的豐富度不相同。

5個蒙古櫟分布地的α多樣性見圖6，LC的Chao1指數最高，ZGC和A較低。Shannon多樣性指數最大的是LC，其次是Y、B，ZGC和A較低。而對于Simpson指數，LC值最大，Y其次，A最低。綜合Chao1、Shannon、Simpson指數可得知平原采樣地的菌根真菌多樣性低于山區采? 樣地。

5個采樣地蒙古櫟的β多樣性見圖7，樣本點距離越近，相關性越顯著。由圖7可知，在B、Y和LC的幾個樣本之間距離較近，而與A和ZGC樣本點相距較遠，這表明：山區3個采樣地的真菌

豐富度與真菌類群較為相似，與平原兩采樣地真菌同源性較低。

2.3? 蒙古櫟外生菌根真菌與環境因子的相關性

菌根真菌多樣性指數（Chao1、Shannon、Simpson）與土壤理化性質、土壤酶活性、海拔和坡度之間的相關性見表3。土壤全氮、速效磷、磷酸酶、海拔、坡度與真菌多樣性指數成顯著正相關。其中，速效磷與Shannon指數相關性最大，海拔與Simpson指數相關性最大。全磷、C∶N、

土壤過氧化氫酶活性與真菌多樣性指數成顯著負相關，其中，全磷與Shannon指數負相關性極顯著，C∶N與Simpson指數呈極顯著負相關（P<0.01）。與Chao1指數相關性最大的為坡度，有極顯著負相關性的為過氧化氫酶活性。此外，各多樣性指數與全鉀、速效鉀、有機質、pH、EC值、土壤蔗糖酶活性以及脲酶活性之間無顯著相關性（P<0.05）。由此可知，全氮、全磷、速效磷、? C∶N、磷酸酶活性、海拔和坡度等環境因子對菌根真菌多樣性產生深刻的影響。

3? 討? 論

蒙古櫟是北京山區森林群落的重要組成樹種，是外生菌根依賴性樹種，外生菌根會影響養分、水分的吸收及其抗逆性，在生長發育及對逆境脅迫的適應中起著重要作用［7-10，35］，因此合適的菌根能促進蒙古櫟在平原區的應用。但目前對蒙古櫟菌根的研究較少，特別是對能形成菌根的真菌多樣性還缺乏系統性了解，而且外生菌根真菌的類型和群落組成也會受到環境因子的影響［36-37］。所以本研究測定了北京地區蒙古櫟原生地和引種地的土壤特性和外生菌根真菌群落多樣性，并對二者之間相關性進行了初步解析。

由于5個采樣地彼此間的距離相對較遠，所以土壤理化性質和土壤酶活性受不同環境影響會存在一定的差異。從土壤理化指標來看，平原地區森林公園的土壤全氮和速效磷含量相對較低，而全磷含量較高，這可能與城市森林公園蒙古櫟林地枯枝落葉較少，腐殖質層較薄，以及養護管理措施有關。其中，奧林匹克森林公園的全磷含量較高而土壤磷酸酶活性較低，這可能是因為較低的土壤磷酸酶活性導致植物可利用態磷的轉化量低，植物吸收磷的量較少，從而造成較多的磷保留在土壤中。相反，山區蒙古櫟分布區B、LC和Y的土壤全磷含量較低，而土壤磷酸酶活性較高，這是因為在磷缺乏的條件下，外生菌根真菌的分泌物會提高土壤中磷的活性，從而促進宿主植物吸收磷元素，這也是外生菌根真菌對土壤中磷的活化機理之一。楊國亭等［38］在研究中也表明，菌根真菌可以分泌磷酸酶和硝酸還原酶，將土壤中不可吸收的元素轉化為可吸收利用的元素從而增加養分的獲取。此外，pH與土壤營養元素含量之間也表現出來較高水平的相關性。本研究中的B和LC山區采樣地有機質含量較高，這可能是因為這兩地土壤pH為5～6，適宜菌根真菌生長，因而土壤營養元素含量較高。

菌種的多樣性指數反映該地區菌種豐富度與均勻度，Chao1指數可以估計群落中實際存在的物種數；Shannon指數可以綜合考慮群落的豐富度和均勻度，Shannon指數值越高，表明群落的多樣性越高；Simpson指數是評價群落多樣性的常用指數之一，Simpson指數值越高，表明群落中物種數越多，各種個體分配越均勻，物種多樣性程度越高。根據測序結果所得菌根真菌的α多樣性與屬水平的OTU注釋分析以及各個不同地區的熱圖可以發現：不同地區的菌種分布以及菌根真菌多樣性不相同。北京山區和平原采集地的菌根真菌多樣性差異較大，北京山區菌種豐富度明顯高于平原地區。從各采樣地的樣品總體情況來看，絨蓋牛肝菌屬、絲膜菌屬、紅菇屬、塊菌屬為北京地區蒙古櫟主要外生菌根真菌類群。其中，絲膜菌屬、紅菇屬、塊菌屬也是北京東靈山遼東櫟的主要外生菌根真菌類群。此外，楊岳等［39］發現了內蒙古地區白樺根圍土壤的外生菌根真菌的優勢屬也有紅菇屬、絲膜菌屬。

通過分析環境因子對外生菌根真菌群落的影響，發現全氮、全磷、速效磷、C∶N、磷酸酶活性、海拔和坡度等環境因子對菌根真菌多樣性的影響較為顯著。有研究表明：由于氮含量增加會影響外生菌根真菌的類群轉化，所以土壤氮含量也決定著菌根分布［40］，并且土壤磷酸酶活性與菌根多樣性之間呈顯著正相關，這可能是由于磷酸酶將土壤中難溶的有機磷轉化為易于吸收的無機磷，無機磷含量增加對于宿主植物生長與菌根真菌生存都起到促進作用。楊岳等［39］研究結果也表明，土壤全磷與pH產生的協同作用對外生菌根真菌群落組成具有顯著影響。

此外，海拔、坡度、經緯度等環境因子以及植被情況也都對菌根真菌多樣性產生了不可忽視的影響。景躍波［41］就中國已有菌根研究做出綜述，土壤類型及質地、土壤酸堿度及養分狀況、季節、溫度、光照、立地因子、宿主植物等變化都會對外生菌根真菌群落分布造成顯著的影響。白淑蘭等［37］也發現大青山外生菌根真菌多樣性與坡度顯著相關。有研究表明氣候的變化、火燒、樹木種植與砍伐以及動物和人類活動等因素對土壤真菌群落具有明顯影響［42］。

本研究利用ITS高通量測序技術首次對北京地區蒙古櫟外生菌根的真菌多樣性進行了分析，得到了能與蒙古櫟共生形成外生菌根的真菌類群，并初步明確了真菌與環境因子的關系，為進一步揭示蒙古櫟外生菌根真菌的種類、分布及作用提供了參考，也為培育菌根化苗木和推廣應用提供了依據。

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Community Composition of Ectomycorrhizal Fungi Associated

with Quercus mongolica in Beijing，China

ZHAO Yuhan1，2，SUN Jiaqi1，SUN Jinqshuang3，CUI Jianhui4，LENG Pingsheng1，5 and HU Zenghui1，2

（1.Engineering Technology Research Center for Ancient Tree Health and Ancient Tree Culture of National Forestry and

Grassland Administration/College of Landscape Architecture，Beijing University of Agriculture，Beijing? 102206，China；

2.Beijing Laboratory for Urban and Rural Ecological Environment，Beijing? 102206，China；3.Nanliyuan Forest Farm of

Fangshan District，Beijing? 102425，China；4.Dawopu Collective Forest Farm of Fangshan District，Beijing? 102407，China；

5.Beijing Engineering Technology Research Center of Rural Landscape Planning and Design，Beijing? 102206，China）

Abstract? To evaluate the characteristics of ectomycorrhizal fungal communities associated with Quercus mongolica in Beijing，China，three naturally occurring in mountainous areas of Q. mongolica （Forest Farm of Beijing University of Agriculture，Yunmeng Mountain National Forest Park，and Baihua Mountain National Nature Reserve），and two introduced areas in plains （Olympic Forest Park and Zhongguancun Forest Park） were selected as sampling sites. The soil and ectomycorrhizal roots of??? Q.mongolica were collected，and the physiochemical properties along with enzyme activity indices of the soil were analyzed.The community structure of ectomycorrhizal fungi in roots was determined using ITS high-throughput sequencing technology. Preliminary analysis was conducted to examine the correlation between the ectomycorrhizal fungal community diversity and environmental factors. The results showed that there were significant differences in soil characteristics between the plain and mountainous areas. Total nitrogen，available phosphorus，and phosphatase activity were higher in mountainous areas，whereas? the pH value and total phosphorus content were higher in plain areas.Sequencing and OTU annotation along with α diversity analysis showed that Xerocomellus，Cortinarius，Russula，and Tuber were the main ectomycorrhizal fungi groups of Q. mongolica in Beijing，however，the dominant fungi varied across different sampling sites. Moreover，the diversity indexes of ectomycorrhizal fungi in the roots of Q. mongolica from plain sampling sites were lower compared to those in mountainous areas. The correlation analysis between fungal community and environmental factors showed that soil total nitrogen content，total phosphorus content，available phosphorus content，carbon to nitrogen ratio，phosphatase activity，altitude，and slope were closely related to fungal diversity.

Key words? Quercus mongolica; Ectomycorrhizal fungi; Fungal diversity; Soil physiochemical index; Environmental factor

Received ??2023-03-31??? Returned? 2023-06-19

Foundation item? Open Competition Project of Beijing University of Agriculture （No.20230079）; High-level Disciplinary Construction Project in Ecological Restoration Engineering Funded by Beijing Municipal Education Commission（No.GJJXK21010）.

First author? ZHAO? Yuhan，female，master student.Research area：physiological ecology of landscape plants.E-mail：zhaoyuhan1010@163.com

Corresponding?? author? LENG Pingsheng，male，Ph.D，professor，master supervisor.Research area：physiological ecology of landscape plants.E-mail：lengpsh@tom.com

HU? Zenghui，male，Ph.D，professor，Ph.D? supervisor.Research area：physiological ecology of landscape plants.E-mail：buahuzenghui@163.com（責任編輯：成? 敏? Responsible editor：CHENG? Min）