云南十里香茶樹空間轉錄組測序研究

王冬雪 滿佳旭 武思敏 趙雪婷 張冬英

摘要：近年來，云南大葉種茶和古茶樹資源備受關注，而對于云南小葉種茶樹資源研究報道較少。十里香茶樹品種是云南特有的小葉種茶樹資源，品質獨特且飲用歷史悠久。空間轉錄組技術作為一種新興的基因表達分析技術，目前尚未見在茶樹資源應用上的文獻報道。利用空間轉錄組測序技術對十里香茶樹嫩芽的基因表征情況和空間調控機制進行研究，結果顯示，Spot聚類分析識別嫩芽細胞類型，劃分為13個不同細胞類型cluster，構建空間轉錄組圖譜，觀察到不同細胞類型cluster在嫩芽的兩種發育時期的空間表達位置存在差異，呈現空間異質性。進一步鑒定不同細胞類型cluster中的差異基因，主要以抗逆脅迫、生長發育調控為主，抗逆脅迫代表性基因為LOC114312694、LOC114319171、LOC114320792、LOC114287723、LOC114284011、LOC114289235，生長發育代表性基因為LOC114263486、LOC114320821、LOC114292779、LOC114321117、LOC114286858；并繪制空間分布圖，發現這些抗逆脅迫和生長發育基因在幼葉中高表達，這說明在嫩芽發育的早期階段，其在抗逆脅迫和生長發育調控方面發揮重要作用。GO與KEGG富集分析發現，十里香茶樹嫩芽的差異基因涉及多個重要通路，如翻譯、茉莉酸信號調控、鈣離子結合、植物激素信號轉導等，這些都與茶樹生長發育緊密相關。此研究結果可為十里香茶樹發育生物學提供一定的科學依據，同時也為其他茶樹資源的研究提供一種新的思路。

關鍵詞：十里香；空間轉錄組；差異基因；空間異質性；發育生物學

中圖分類號：S571.1；S326????????????? 文獻標識碼：A????????????? 文章編號：1000-369X（2024）03-399-12

Spatial Transcriptome Sequencing of Shilixiang in Yunnan Province

WANG Dongxue1，2， MAN Jiaxu3， WU Simin1，2， ZHAO Xueting1， ZHANG Dongying1，2*

1. College of Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2. Key Laboratory of Pu'er Tea Science， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

3. Institute of Agricultural Products Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650201， China

Abstract： In recent years， Yunnan's large leaf tea and ancient tea resources have attracted much attention， while there are relatively few reports on the research of small leaf tea resources. Shilixiang， a distinctive small leaf tea resource in Yunnan， possessed unique quality and a long drinking history. Spatial transcriptome technology， an emerging gene expression analysis technique， has not been previously applied to tea resources according to current literature. The gene characterization and spatial regulation mechanism of the tender buds of Shilixiang were researched by spatial transcriptome sequencing technology in this study. The results show that 13 clusters of different cell types in the tender bud cells were identified by a spot clustering analysis and the spatial transcriptome map was constructed. The expression positions of clusters during the two developmental stages of the bud were different and spatial heterogeneity was observed from this analysis. Further exploration involved the identification of differential genes in various cell type clusters， with a focus on stress response and growth and development regulation. Representative stress responsive genes included LOC114312694， LOC114319171， LOC114320792， LOC114287723， LOC114284011 and LOC114289235. Meanwhile， representative growth and development genes included LOC114263486， LOC114320821， LOC114292779， LOC114321117， and LOC114286858. A spatial distribution map illustrated the high expression of these stress response and growth development genes in young leaves， indicating their crucial role in the early stage of tender bud development. Further GO and KEGG enrichment analysis reveal that the differential genes in the tender buds of Shilixiang are associated with multiple important pathways. These pathways included translation， jasmonic acid signal regulation， calcium ion binding， and plant hormone signal transduction， all of which are closely linked to the growth and development of tea plants. The results of this study provided a solid scientific foundation for understanding the developmental biology of Shilixiang. Additionally， they provided a new perspective for exploring other tea resources.

Keywords： Shilixiang， spatial transcriptome， differential gene， spatial heterogeneity， developmental biology

隨著科學技術的日新月異，茶樹基因組的研究從未止步[1]。自2010年中國科學院啟動“茶基因組”計劃以來，歷經7年，構建了第一個茶樹基因組（阿薩姆種基因組），為后續的茶樹研究提供了先例[2]。茶樹基因組具有高雜合性，極大制約了茶樹基因組的進展[3-4]。迄今為止，在茶樹基因組數據庫中，已經公布眾多茶樹基因組，如云抗10號[2]、舒茶早[5-6]、龍井43[7]等。這些基因組的公布為茶樹的遺傳育種、進化起源等提供了一定的科學參考[8]。目前，轉錄組學分析已被廣泛用于揭示茶樹特征性次級代謝通路、抗逆性和產量相關的轉錄調控等機制的研究[9-11]，包括采用不同組織的不同時空樣本[12]、生物脅迫樣本和非生物脅迫樣本[13-14]。也有研究者使用二代轉錄組測序技術對茶樹舒茶早品種進行了轉錄組測序[15]，這使得茶樹二代轉錄組測序研究進入到快速發展階段。近些年來，大量的基因組測序加速了茶樹的遺傳育種進程[16-19]，這些研究結果對促進茶樹品種改良具有重要意義。

空間轉錄組技術作為近幾年新興的高通量測序技術，為我們解析基因在組織結構中的復雜調控提供了一種全新的視角。傳統的轉錄組技術，雖可以提供基因在總體水平上的表達信息，但不能揭示基因在組織或細胞水平上的具體分布情況。而空間轉錄組技術可在組織原位同時獲得基因表達特征和空間分布數據，進一步推進了對組織原位細胞真實基因表達的研究。擬南芥是第一個構建空間轉錄組圖譜的樣本，該圖譜揭示了擬南芥跨組織結構域的141個差異表達基因[20]。在馬齒莧植物中應用空間轉錄組技術聚焦光合作用場所的葉肉細胞和束鞘細胞群體，進行了兩種不同的空間基因表達分析[21]。通過構建蘭花發育過程中的空間轉錄組技術圖譜，為進一步研究蘭花開花過程中復雜而重要的基因調控網絡提供了寶貴的資源[12]。也有研究報道，利用空間轉錄組技術創建的番茄愈傷組織的細胞圖譜，可以揭示其異質性并鑒定出不同的細胞類型[22]。在江南卷柏（Selaginella moellendorffii）根系中進行空間轉錄組測序研究，支持了控制根系發育機制高度趨同進化的觀點[23]。目前，空間轉錄組技術在茶樹資源中的應用還未見報道。

云南是茶樹的起源地，大葉種茶樹資源和古茶樹資源備受人們關注[25]，而當地小葉種茶樹資源關注度較低。十里香茶樹作為云南特有的小葉種茶樹資源，栽培歷史悠久，其最早應用可追溯到唐代[25]。近些年來，十里香茶樹研究多集中在遺傳多樣性和種質資源保護、栽培技術、新品種的選育和產量優化等方面，且多采用傳統研究技術，目前整體研究水平較低，研究進程較為緩慢[26-27]。本文利用空間轉錄組技術對十里香茶樹嫩芽進行研究，旨在為十里香茶樹發育生物學提供科學依據，同時也為其他茶樹資源的研究提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品于2022年6月采集自昆明市云南農業大學茶葉種植基地，茶樹品種為十里香，同一茶樹上取5個嫩芽。

1.2 樣品制備

使用異戊烷和液氮浴冷凍新鮮嫩芽，用OCT包埋冷凍組織樣本，﹣80 ℃保存；在冷凍切片機中進行冷凍切片；并收集組織切片用于RNA提取及質檢，保證組織冷凍過程中RNA無降解。

1.3 組織優化

將冷凍切片按照區域貼在組織優化的玻片上，然后對組織切片進行甲醇固定、蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin and eosin staining，HE染色）和明場成像，再進行不同時間梯度透化和熒光標記的cDNA合成，最后移除組織進行熒光成像，通過熒光信號的強度和彌散程度確定最佳的透化條件，即熒光信號的強度最大且沒有彌散為最佳透化時間，用于后續基因表達文庫的構建。

1.4 基因表達文庫構建和質檢

將組織切片貼于基因表達的玻片上，進行甲醇固定、H&E染色和明場成像；根據組織優化確定的透化時間進行組織透化，基因表達玻片上的組織切片釋放的mRNA被spot上的特殊引物捕獲并逆轉錄成cDNA。從載玻片上收集帶有空間條形碼的cDNA，經過二鏈合成、變性、PCR擴增得到初步cDNA，再通過酶切片段化處理、末端修復加A尾、磁珠片段篩選、接頭連接、磁珠純化、添加樣本indexes PCR構建標準二代測序文庫。

1.5 組織透化和cDNA合成

根據組織優化試驗確定的透化時間進行組織透化，使細胞中的mRNA得到釋放，并結合到相應的捕獲探針上；再進行mRNA逆轉錄，得到完整cDNA一鏈；經過二鏈合成、二鏈變性回收、cDNA擴增和cDNA純化得到完整的cDNA。

1.6 cDNA定量及質控

取1 ?L樣品稀釋至2 ng·?L-1，使用Qubit測定純化后cDNA產物濃度，使用High sensitivity Agilent Technologies 2100 Bioanalyzerd對cDNA產物峰型進行測定。

1.7 文庫定量和質控

取10 ?L cDNA進行建庫，通過片段化、末端修復加A尾，接頭連接，磁珠純化，樣本index PCR，PCR后的磁珠雙端片段篩選等步驟完成文庫構建。并利用Qubit4.0測定文庫濃度；稀釋到合適的濃度，利用Qseq400進行片段檢測，一般文庫分布于在300～800 bp，平均片段分布于400～500 bp。

1.8 上機測序

文庫質檢合格后，利用百邁客公司二代測序儀平臺對空間基因表達文庫進行測序，測序策略為PE150。

1.9 測序數據及其質量評估

采用百邁客公司Illumina技術對樣本的轉錄組進行雙端150 bp測序。為確保測序數據的質量和可靠性，使用Fastp（v0.23.4）對數據進行預處理，去除低質量序列，限制N堿基的存在，修剪了序列的前端和尾端，確保所保留的序列長度不低于75 bp。

1.10 BSTMarits分析

使用百邁客公司平臺的BSTMatrix數據分析軟件包，以過濾后的fastq文件和組織切片的甲苯胺藍染色圖片為輸入數據，進行參考基因組比對、組織檢測和Spatial Barcode/UMI統計，生成spot-基因表達矩陣。

1.11 Spot聚類分析

利用Seurat包中的sctransform算法對數據進行標準化處理，之后通過vst算法篩選出數據中表達變化最大的基因集，默認選擇3 000個差異基因作為高變異基因（High-variance genes，HVGs），使用UMAP[28]和t-SNE[29]兩種降維手段進行spot聚類分析，將空間spot劃分成不同區域cluster并進行后續分析。

1.12 區域功能富集分析

使用7個公共數據庫根據差異基因序列的相似性進行比對注釋，包括Nr非冗余蛋白質數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）、Swiss-Prot蛋白數據庫（www.expasy.org）、GO基因本體數據庫（http：//geneontology.org）、COG同源蛋白簇數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/research/

cog）、KOG真核同源基團數據庫（http：//genome.

jgi-psf.org/help/kogbrowser.jsf）、Pfam大型蛋白結構域家族的數據庫（http：//pfam.xfam.org）和京都基因與基因組百科全書（KEGG，www.genome.jp/kegg），得到基因的注釋信息，并為對應cluser進行空間轉錄組亞群分析、差異表達基因分析、GO/KEGG功能富集分析。

2 結果與分析

2.1 數據質量評估結果

由于目前還沒有十里香茶樹基因組數據作為參考，因此將十里香茶樹測序數據與數據庫內已有的茶樹基因組進行比對，發現與舒茶早基因組數據的比對率最高，達到80%以上。轉錄組比對結果同樣顯示與舒茶早比對率最高。而且舒茶早是中小葉品種，因此選擇舒茶早作為參考基因組。本研究共獲得59.42 G的原始測序數據，統計獲取352 196個Spots，去除低質量的序列后獲得198 075 303個reads。十里香茶樹基因組的GC含量值為35.32%；質量值≥20的堿基所占的百分比（Q20）為93.39%，質量值≥30的堿基所占的百分比（Q30）為87.75%，與參考基因組和轉錄組的平均比對率分別為93.52%和77.22%，測序飽和度為71.38%，測序各項指標質量較好，可以滿足后續分析條件。

2.2 十里香茶樹嫩芽空間轉錄組圖譜的構建

聚類分析獲得不同細胞類型的cluster共13個，不同顏色的區域代表不同功能，空間距離代表表達模式的關聯程度（圖1）。構建不同細胞類型cluster分布空間轉錄組圖譜，可以觀察細胞群的全局性和局部相似性。從圖2中可以看到兩種發育形態的嫩芽（嫩芽主要包括幼葉和芽軸），第一種嫩芽的發育形態（以cluster0的123為例），cluster4、cluster5、cluster9主要富集于芽軸；cluster1、cluster2、cluster6、cluster10富集于幼葉。第二種嫩芽發育形態（以cluster0的45為例），cluster3、cluster7富集于幼葉；cluster4、cluster8、cluster11富集于芽軸。這一分析發現，不同細胞類型cluster在不同的發育階段，基因的表達位置存在空間異質性，暗示嫩芽發育過程中基因的表達呈動態變化。準確劃分細胞邊界和鑒定細胞的確切位置對理解嫩芽區域特異性的細胞分化過程至關重要。

2.3 十里香茶樹差異基因的表達分析

對十里香茶樹嫩芽中不同細胞類型cluster的差異基因進行功能注釋，由表1可知，這些基因主要涉及植物抗逆性調節、生長發育以及兒茶素合成。從表1中選取具有代表性基因進一步繪制空間轉錄組圖譜，如圖3所示。LOC114312694、LOC114319171、LOC114320792、LOC114287723、LOC114284011和LOC114289235等基因參與了植物生長發育中的抗逆性調節過程，這些基因紅色基本集中在幼葉區域，在幼葉中有高表達（圖3A～圖3F）。幼葉生長在植物的頂端和外端，對環境變化非常敏感，在生長發育過程中受到各種環境壓力和逆境條件的挑戰，從而演化出一種適應機制，故抗逆性基因表達較高。LOC114263486、LOC114320821、LOC114292779、LOC114321117、LOC114286858等基因參與調控生長發育相關，紅色基本集中在幼葉區域（圖3G～圖3K），說明這些與調控生長發育相關的基因在幼葉

區域有高表達，在芽軸表達較低。LOC1142266906是類黃酮代謝途徑下游的無色花青素還原酶，它是決定茶樹兒茶素類化合物類型的關鍵酶類，具有多種重要的生物學功能。如圖3L所示，LOC1142266906基因在整個嫩芽組織高表達，說明類黃酮代謝在十里香茶樹嫩芽發育中發揮重要的作用。

2.4 十里香茶樹嫩芽差異基因GO功能分類注釋

GO功能分類注釋結果分為生物學過程、細胞組分和分子功能3類（圖4）。生物學過程主要包括生物調節（32%）、對刺激的反應（29%）、代謝過程（18%）、細胞過程（16.4%）

等。細胞組分中細胞部分、細胞器、細胞器部分和大分子復合物分別占比為65%、6.4%、7.7%、8.8%。分子功能中，酶調節活性、結合活性、蛋白活性占比較高，分別為20.8%、26.7%、23.4%。

從GO富集結果選取每個cluster最顯著的GO通路富集項（表2），結合2.3章節分析發現，抗逆脅迫基因聚類于cluster1、cluster2、cluster4、cluster6、cluster7和cluster12，其在GO富集通路主要涉及翻譯、核糖體、核小體、細胞壁大分子分解代謝、茉莉酸介導信號通路調控、幾丁質分解代謝、蛋白質異源二聚化活性、葉綠體類囊體膜和光系統Ⅰ、光系統Ⅱ等。生長發育基因聚類于cluster0、cluster2、cluster4和cluster10。GO富集通路主要關于核糖體、細胞壁、核小體、轉錄輔阻遏蛋白活性、轉錄共調節因子活性、鈣離子結合、對刺激的反應調控、茉莉酸介導信號通路調控、細胞壁大分子分解代謝、幾丁質分解代謝、蛋白質異源二聚化活性、葉綠體類囊體膜和光系統Ⅰ、

光系統Ⅱ等通路。翻譯、核糖體和核小體是植物細胞內生命活動的關鍵組成部分，直接參與蛋白質合成，而蛋白質是植物嫩芽發育和生理過程中不可或缺的重要分子。細胞壁大分子分解代謝、茉莉酸介導信號通路調控、幾丁質分解代謝、蛋白質異源二聚化活性、轉錄輔阻遏

蛋白活性、轉錄共調節因子活性、鈣離子結合、對刺激的反應調控等過程在植物嫩芽的發育中都具有重要作用，直接或間接影響植物的生長、發育和逆境響應。葉綠體類囊體膜和光系統Ⅰ、光系統Ⅱ的發育對植物嫩芽的生長、發育和能量供給至關重要。

2.5 十里香茶樹嫩芽差異基因KEGG功能分類注釋

KEGG注釋結果可以分為細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、代謝、有機系統和組織系統6類，共注釋1 335條通路，其中代謝富集到的基因數量最多，為777條，其次為遺傳信息處理，為378條，環境信息處理、有機系統、細胞過程、組織系統分別富集到81、43、36、20條（圖5）。結果表明，在十里香茶樹嫩芽發育階段，植物的代謝和遺傳信息處理的生物活動占據著重要的位置。從KEGG富集結果選取各cluster最顯著的KEGG通路富集項（表3）。結果表明，13個cluster中差異基因表達主要涉及氨基酸生物合成、氨基糖

和核苷酸糖代謝等通路，均與蛋白質代謝過程緊密相關。蛋白質是生命活動的基因組成部分，植物生長發育過程中的所有關鍵步驟都與蛋白質表達密切相關，如光合作用、呼吸作用、營養物質吸收和轉化、逆境響應和信號傳遞等。這些差異基因表達的富集結果為茶樹發育過程中蛋白質代謝提供了重要線索，有助于更全面地理解十里香茶樹嫩芽在生長發育階段的生物學調控機制。

3 討論

本研究應用空間轉錄組測序技術識別十里香茶樹嫩芽的基因表達情況和空間信息。Spot聚類注釋嫩芽不同細胞類型，劃分13個不同細胞類型cluster，空間轉錄組圖譜表明，不同細胞類型cluster在嫩芽不同發育時期的表達位置存在空間異質性。推測嫩芽作為茶樹幼嫩組織，處于高度發育狀態，細胞處于不斷分裂分化過程，導致一些基因在特定階段的特定細胞類型中表達，執行特定的生物學功能。

進一步鑒定不同細胞類型cluster的差異基因，發現LOC114312694、LOC114319171、LOC114320792、LOC114287723、LOC114284011、LOC114289235基因參與嫩芽的抗逆性調節，在嫩芽的幼葉部位高表達，在芽軸低表達。這可能是因為在茶樹的嫩芽中，幼葉包裹著芽軸，葉片充當了芽軸的保護外層，芽軸受外界的影響遠小于嫩葉，所以抗逆性基因在芽軸的表達較少而在幼葉中表達量較高，是機體適應外界環境機制的體現。LOC114263486、LOC114320821、LOC114292779、LOC114321117、LOC114286858基因參與生長發育調控，在幼葉中高表達，在芽軸中低表達。這可能是由于幼葉比芽軸接觸到更多的光，光合作用更強，因此這些與生長發育調控相關的基因在幼葉中高表達。LOC1142266906是類黃酮代謝途徑下游的無色花青素還原酶（LAR），LOC1142266906基因在整個嫩芽組織中高表達，說明類黃酮代謝在十里香茶樹嫩芽發育中發揮重要的作用。

基于空間轉錄組圖譜分析嫩芽中特定細胞類型的表達模式，鑒定了大量在十里香茶樹嫩芽不同部位間表達水平顯著差異的基因，且涉及多個生物學過程和功能。GO功能富集分析結果顯示，細胞組分中主要富集于細胞部分、細胞器等；在分子功能中主要富集于結合、蛋白和酶調節活性部分；顯著的GO富集通路包括翻譯、核糖體、核小體、細胞壁大分子分解代謝、轉錄輔阻遏蛋白活性、轉錄共調節因子活性、鈣離子結合、對刺激的反應調控、茉莉酸介導信號通路調控、幾丁質分解代謝、蛋白質異源二聚化活性、葉綠體類囊體膜和光系統Ⅰ、光系統Ⅱ等，這些通路直接或間接影響著嫩芽的生長發育、能量供給和逆境脅迫反應，在嫩芽發育過程中具有重要作用。KEGG數據庫共注釋到1 335條代謝通路，代謝占據主導位置，與Muthusamy等[30]研究結果相似，基因富集的代謝途徑包括氨基酸代謝、碳代謝等代謝調節，花青素、生長素、植物激素等前提物質的合成，植物信號傳導，以及耐寒、耐旱、耐抗病等抗逆脅迫。綜合富集分析發現，嫩芽基因調控網絡主要參與逆境脅迫、生長發育等過程，反映了嫩芽對生態環境變化的適應性，在發育階段需要平衡生長發育和應對外部逆境的需求，以確保其在不同生態條件下生長發育。

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