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內蒙古玉米大斑病菌孢子數量動態變化規律

2024-07-07 04:39:55李巖佳馬麗杰郭帥領胡小平呂金黃衛利梁紅偉韓艷茹羅國君姜立慧李猛云旭
西北農業學報 2024年6期

李巖佳 馬麗杰 郭帥領 胡小平 呂金 黃衛利 梁紅偉 韓艷茹 羅國君 姜立慧 李猛 云旭

摘 要 揭示內蒙古地區玉米大斑病菌孢子的數量動態變化規律,并為玉米大斑病的預警和防控提供更科學的依據,利用孢子捕捉儀及 Real-time PCR方法,連續3 a(2021-2023年)對內蒙古6個玉米主產區的空氣中的分生孢子數量進行監測。結果表明,內蒙古地區玉米大斑病菌孢子數量的高峰期出現在6月中上旬和8月中下旬。相關性分析顯示,6個地區監測的孢子數量與空氣溫度均呈正相關(P<0.05)。孢子數量與內蒙古西部3個地區(巴彥淖爾、鄂爾多斯和呼和浩特)的相對濕度呈正相關(P<0.05),與內蒙古東部3個地區(赤峰、通遼和興安盟)的相對濕度相關性不顯著。這說明在內蒙古西部地區空氣溫度和相對濕度是影響孢子濃度的關鍵因子,在內蒙古東部地區空氣溫度是影響孢子濃度的關鍵因子。

關鍵詞 玉米大斑病;分生孢子;Real-time PCR;動態監測;氣象因子

由大斑凸臍蠕孢菌[Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs]引起的玉米大斑病(Northern corn leaf blight,NCLB)是一種全球性的玉米葉部真菌病害。該病害于1876年在意大利首次被發現,20世紀初期已遍布亞洲、非洲和美洲等玉米產區[1-2]。1899年,該病害在中國遼寧、吉林和黑龍江3省被發現,隨后在其他各省玉米種植區相繼出現,且在中國東北、華北北部、西北東部、西南冷涼山區以及其他高海拔地區發生嚴重[3]。內蒙古是中國主要的春播玉米產區,近年來玉米的播種面積呈逐年上升趨勢,到2020年,玉米播種面積已達3.82×106 hm2,占全國玉米種植面積的1/10[4]。玉米大斑病是內蒙古玉米上發生最為普遍、危害最重的葉部真菌病害。玉米在開花期和灌漿期受侵染對產量損失影響最大[5]。一般情況下,感病品種可減產約20%,嚴重時減產達50%以上[6]。Symbol`@@

玉米大斑病菌通過菌絲體和分生孢子在玉米植株病殘體上越冬,至第2年春季再萌發侵染植株。氣候條件適宜時,10~14 d就會在葉片病斑上產生分生孢子,分生孢子借空氣、雨水等可進行再侵染。病菌從種子萌發到收獲均可侵染植株[7]。病菌孢子數量是影響病害發生的關鍵因素之一,監測孢子數量動態變化規律可為病害預測提供重要的基礎數據[8]。于舒怡[9]利用固定式孢子捕捉器(載玻片粘附凡士林)捕捉空氣中玉米大斑病菌分生孢子,明確了遼寧省不同生態區田間玉米大斑病菌孢子密度動態變化規律。此外,在感病品種和菌源量一定的情況下,環境因子也是影響病害發生的關鍵因素。玉米大斑病的適宜發病溫度為20~25 ℃,超過28 ℃對病害有抑制作用。6-8月份的降水量也是影響病害發展的關鍵因素[10-11],其主要會對分生孢子的數量造成影響,因此,關注病菌分生孢子數量對于病害的預測意義重大。

明確玉米大斑病菌分生孢子數量動態變化規律,對該病害的科學精準綠色防控具有指導作用,對保障玉米生產和糧食安全具有重要意義。目前,關于內蒙古地區玉米大斑病菌孢子數量周年變化規律以及孢子濃度與氣象因子關系的研究還未見報道。本研究將以玉米大斑病菌作為研究對象,連續3 a對內蒙古6個玉米主產區空氣中的孢子進行捕捉,同時對空氣溫度、相對濕度和降水量等氣象因子進行詳細記錄,采用 Real-time PCR法對捕捉到的孢子進行定量分析,以期明確玉米大斑病菌分生孢子在內蒙古地區的周年數量動態變化規律和空氣中的孢子數量與氣象因子的關系,為玉米大斑病的精準預測和病情防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及樣本采集

選擇內蒙古春玉米區有代表性的6個盟市作為調查點,自西向東分別為巴彥淖爾市臨河區、鄂爾多斯市達拉特旗、呼和浩特市玉泉區、赤峰市寧城縣、通遼市開魯縣和興安盟突泉縣(圖1)。各盟市選擇的調查點常年種植玉米,種植面積均在33 hm2以上,玉米品種為當地自選品種。于2021年4月初在每個調查點田塊旁邊固定安裝小西農孢子捕捉儀(西安黃氏生物工程有限公司產品),3 a間孢子捕捉儀的位置不移動。在孢子捕捉儀兩側插入涂抹凡士林的5? cm長的捕捉針,通過高速旋轉將玉米大斑病菌分生孢子收集在捕捉針上,最后將兩根捕捉針取下放入同一個2.0 mL離心管中,帶回實驗室放于-80 ℃冰箱中保存,備用。該儀器可在無人操作的環境中連續旋轉采樣,每? 7~10 d取一次樣品。

1.2 DNA提取

選用Fast DNA Spin Kit for soil 試劑盒(美國MP Biomedicals 有限責任公司產品)對捕捉針上捕捉的分生孢子樣品進行DNA提取。抽提過程中為避免孢子的損失,直接將Sodium Phosphate Buffer 和MT buffer加入收集管中,在MM400研磨儀(德國Retsh公司產品)上以25 Hz 頻率研磨40 s,共研磨3次,后續步驟按照說明書進行。

1.3 Real-time PCR供試引物及體系優化

采用石妞妞等[12]設計的玉米大斑病菌特異性引物(表1)進行Real-time PCR,反應的體系為:SYBR Green 12.5 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板4 μL,補ddH2O 6.5 μL。程序為? 95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個循環。在Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏診斷有限公司)上進行。

1.4 Real-time PCR重復性評價及標準曲線的? 建立

對采集到的玉米大斑病葉進行組織分離和純化,挑取純化好的菌株,將其置于PDA平皿上? 26 ℃培養7 d,用無菌水洗下孢子,用兩層濾紙過濾,除去懸液中的菌絲,將濾液在4 000 r·min-1下離心10 min,去除上清液,加入無菌水。在血球計數板下將其稀釋成1×105 、1×104、1×103、? 1×102、1×101、1×100 mL-1 6個梯度的孢子懸浮液模擬樣本,研磨粉碎后,參照Fast DNA Spin Kit for soil 試劑盒說明書提取DNA。以無菌水作為陰性對照,按照上述反應體系和程序進行Real-time PCR。每個稀釋度重復3次,計算變異系數,評價其重復性。根據1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100 mL-1 6個梯度的孢子濃度對數(x)和對應的Ct值(cycle threshold)(y)繪制標準曲線。

1.5 氣象數據的獲取及相關分析

在孢子捕捉儀附近安裝多維環境氣象監測儀(西安黃氏生物工程有限公司產品),采集空氣溫度、相對濕度及降水量等關鍵氣象數據,并上傳到云端數據庫中保存,備用。采用SPSS軟件的Spearman相關性分析方法對空氣中的孢子數量與氣象因子之間的關系進行分析。

2 結果與分析

2.1 Real-time PCR體系評價

將濃度為1×105 、1×104、1×103、1×102、? 1×101、1×100 mL-1 的孢子模擬樣品在同一條件下進行Real-time PCR,每個濃度重復3次,Ct值的平均值分別為13.70、17.49、22.24、25.54、? 29.01、32.87;變異系數依次為0.04%、0.01%、? 0.03%、0.02%、0.03%、0.02%,均小于1%(表2),說明該檢測方法具有良好的重復性。

2.2 標準曲線

運用Real-time PCR方法對1×105 、? 1×104、1×103、1×102、1×101、1×100 mL-1?? 6個濃度的孢子模擬樣品進行定量,以不同梯度的分生孢子濃度的對數為橫坐標,對應的Ct值為縱坐標繪制標準曲線(圖2)。標準曲線方程為y=? -3.819 4x+33.023,決定系數(R2)為0.997 4。Ct值的平均值為13.70~32.87,最低可檢測到的孢子濃度為1 mL-1。

2.3 各地區孢子數量動態分析

分析2021-2023年各地區孢子濃度情況,2021年巴彥淖爾市的玉米大斑病菌孢子濃度在6月12日達到峰值,此時的孢子濃度為135.25 mL-1,相對濕度為60.87%,空氣溫度為? 26.2 ℃;2022年巴彥淖爾市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月11日達到峰值,此時的孢子濃度為19.45 mL-1,相對濕度為60.41%,空氣溫度為25.98 ℃;2023年巴彥淖爾市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月14日達到峰值,此時的孢子濃度為? 7 172.44 mL-1,相對濕度為73.08%,空氣溫度為29.17 ℃(圖3)。

分析2021-2023年鄂爾多斯市的孢子濃度發現,2021年鄂爾多斯市的玉米大斑病菌孢子濃度在6月10日達到峰值,此時的孢子濃度為? 121.34 mL-1,相對濕度為46.92%,空氣溫度為? 17.50 ℃;2022年鄂爾多斯市的玉米大斑病菌孢子濃度在9月23日達到峰值,此時的孢子濃度為1 019.15 mL-1,相對濕度為65.94%,空氣溫度為22.89 ℃;2023年鄂爾多斯市的玉米大斑病菌孢子濃度在9月7日達到峰值,此時的孢子濃度為684.60 mL-1,相對濕度為79.16%,空氣溫度為25.86 ℃(圖4)。

分析2021-2023年呼和浩特市的孢子濃度發現,2021年呼和浩特市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月6日達到峰值,此時的孢子濃度為4.94 mL-1,相對濕度為55%,空氣溫度為24.96 ℃;2022年呼和浩特市的玉米大斑病菌孢子濃度在7月28日達到峰值,此時的孢子濃度為115.40 mL-1,相對濕度為62.66%,空氣溫度為? 23.29 ℃;2023年呼和浩特市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月24日達到峰值,此時的孢子濃度為? 2 398.97 mL-1,相對濕度為64.79%,空氣溫度為18.92 ℃(圖5)。

分析2021-2023年赤峰市的氣象因子對孢子濃度的影響發現,2021年赤峰市的玉米大斑病菌孢子濃度在6月2日達到峰值,此時的孢子濃度為283.91 mL-1,相對濕度為49.38%,空氣溫度為24.03 ℃;2022年赤峰市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月1日達到峰值,此時的孢子濃度為1 006.94 mL-1,相對濕度為77.49%,空氣溫度為27.63 ℃;2023年赤峰市的玉米大斑病菌孢子濃度在6月2日達到峰值,此時的孢子濃度為? 1 742.85 mL-1,相對濕度為71.68%,空氣溫度為20.75 ℃(圖6)。

分析2021-2023年通遼市的孢子濃度發現,2021年通遼市的玉米大斑病菌孢子濃度在5月28日達到峰值,此時的孢子濃度為178.83 mL-1,相對濕度為59.51%,空氣溫度為? 15.68 ℃;2022年通遼市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月26日達到峰值,此時的孢子濃度為? 63.28 mL-1,相對濕度為69.23%,空氣溫度為? 25.03 ℃;2023年通遼市的玉米大斑病菌孢子濃度在8月18日達到峰值,此時的孢子濃度為918.03 mL-1,相對濕度為74.70%,空氣溫度為30.28 ℃(圖7)。

分析2021-2023年興安盟的孢子濃度發現,2021年興安盟的玉米大斑病菌孢子濃度在6月2日達到峰值,此時的孢子濃度為1? 350.27 mL-1,相對濕度為85.70%,空氣溫度為11.21 ℃;2022年興安盟的玉米大斑病菌孢子濃度在8月26日達到峰值,此時的孢子濃度為244.19 mL-1,相對濕度為63.48%,空氣溫度為23.37 ℃;2023年興安盟的玉米大斑病菌孢子濃度在8月18日達到峰值,此時的孢子濃度為4 609.61 mL-1,相對濕度為69.83%,空氣溫度為26.31 ℃(圖8)。

分析2021-2023年各地孢子濃度的總和發現,3 a間各地區的孢子濃度總和呈逐年遞增趨勢,且2023年各地區的孢子濃度總和普遍高于前兩年。其中,巴彥淖爾市、呼和浩特市、通遼市和興安盟的孢子濃度在2021年和2022年相差不大,但在2023年有顯著的增長趨勢;鄂爾多斯市2023年和2022年的孢子濃度總和基本相同,但較2021年有明顯的增長;赤峰市3 a間孢子濃度總和呈持續增長趨勢(圖9)。

2.4 氣象因子對玉米大斑病菌孢子濃度的影響

對2021-2023年內蒙古地區空氣中的孢子濃度與氣象因子進行相關性分析,結果表明,內蒙古6個盟市的孢子濃度與空氣溫度均呈顯著正相關(P<0.05),其中鄂爾多斯市、赤峰市、通遼市和興安盟地區的孢子濃度與空氣溫度呈極顯著正相關(P<0.01)。內蒙古西部3個地區(巴彥淖爾市、鄂爾多斯市、呼和浩特市)的孢子濃度與相對濕度呈顯著正相關(P<0.05),東部3 個地區(赤峰市、通遼市、興安盟)的孢子濃度與相對濕度相關性不顯著。巴彥淖爾市、鄂爾多斯市和赤峰市的孢子濃度隨著降水量的增加而減少,呼和浩特市和興安盟的孢子濃度隨著降水量的增加而增加,但孢子濃度與降水量的相關性均不顯著。由于通遼地區獲取氣象因子期間無降雨,因此孢子濃度與降水量之間無法分析相關性(表3)。

3 討? 論

目前,使用化學藥劑仍然是防治玉米大斑病最有效的方式。明確內蒙古地區的玉米大斑病菌孢子數量動態變化規律,對預測田間病害發生情況,合理精準施藥至關重要。建立科學的玉米大斑病菌孢子數量檢測體系是監測病原菌動態變化的前提。目前,已有利用孢子捕捉儀與實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法監測病原菌數量動態變化規律的報道,如苜蓿銹病[13]、大豆銹病[14]、甜菜霜霉病[15]、小麥條銹病[16]、小麥赤霉病[17]等。本研究參考實驗室小麥條銹菌夏孢子檢測體系,構建了玉米大斑病菌孢子檢測體系,最低能夠檢測到1 mL-1的孢子濃度,可用于內蒙古地區空氣中玉米大斑病菌孢子樣品的檢測。

本研究3 a間利用孢子捕捉儀捕捉采集孢子的時間不一致(圖3~圖8),主要是因為在2021年初次設計捕捉起始時間時,首先參考了于舒怡[9]的研究結果,于舒儀利用孢子捕捉器對遼寧省玉米大斑病發病前空中孢子攜帶量進行持續捕捉,結果表明,5月初(玉米剛播種)田間即可偶爾捕捉到玉米大斑病分生孢子,6月中旬達高峰,6月下旬首次發現病斑。結合內蒙古地區春玉米實際播種時期(4月下旬到5月上旬),確定了2021年初次捕捉采集孢子的時間為5月28日(鄂爾多斯市播種時間較其他地區早,因此提早了2 d;巴彥淖爾市由于天氣原因推遲了4 d),為了捕捉到初次釋放的分生孢子和找尋孢子釋放高峰期,前3次捕捉和6月中旬捕捉均間隔2 d捕捉1次。后期結合2021年田間病害調查結果發現,內蒙古6個監測點初次發病主要集中在7月中下旬到8月上旬(個別提前到7月初,如赤峰地區),8月中下旬到9月上旬進入發病盛期。因此,2022年和2023年設計孢子捕捉起止時間時,向后推遲到從6月上旬開始,到9月中旬結束。個別監測點出現采集時間不一致是由于孢子捕捉針需要人工采集并進行更換,受外界因素的影響(疫情防控和當地惡劣天氣)不能及時取樣,導致采集時間存在一定的偏差。

本研究通過對內蒙古6個盟市玉米大斑病菌孢子連續3? a的監測發現,孢子濃度的高峰期主要集中在玉米吐絲期(6月中上旬)和抽穗灌漿期(8月中下旬)。玉米大斑病是多循環病害,第二次高峰期的出現應是再侵染引起的。巴彥淖爾市、鄂爾多斯市、通遼市和興安盟均出現孢子濃度峰值后移的現象(2021年孢子濃度峰值主要在6月中旬出現,2022年和2023年孢子濃度峰值在8月中下旬出現)。在其他因素如氣候、品種等適宜的條件下,孢子濃度峰值后移可能影響玉米的抽穗灌漿,最終將對玉米的產量和品質造成影響。

大量研究表明,空氣中的孢子濃度與氣象因子密切相關。宋晶晶等[18]發現,空氣中小麥白粉菌的孢子密度與溫度和相對濕度呈負相關,與降水量呈正相關。于舒怡等[19]證明了高濕和降水會降低空氣中葡萄霜霉病菌孢子密度。戶雪敏等[20]發現小麥條銹菌夏孢子數量與空氣溫度與日照時數呈顯著正相關。谷醫林[21]證明空氣中孢子密度與相對濕度呈負相關,且在濕度處于60%左右的水平時,小麥條銹菌夏孢子孢子濃度出現最大值。本研究發現,內蒙古自西向東6個盟市的孢子濃度與空氣溫度呈正相關(P

本研究還發現,內蒙古西部3個地區巴彥淖爾市、鄂爾多斯市和呼和浩特市2023年孢子濃度分別高達7 172.44 mL-1、684.60 mL-1和? 2 398.97 mL-1,但田間調查發病很輕,病情指數分別為0.22、0.44和0.52。分析可能是由于相對高溫低濕環境不利于分生孢子的萌發,也可能與當地玉米品種的抗病性有關,如鄂爾多斯市監測點種植的玉米品種為‘滿世通161號,抗大斑病(3R)。內蒙古東部3個地區赤峰市、通遼市和興安盟2023年孢子濃度分別為742.85 mL-1、? 918.03 mL-1和4 609.61 mL-1,田間調查病情指數分別為17.05、21.04和58.72。病情指數表現出隨著孢子濃度增加而升高的趨勢。說明孢子濃度是引起內蒙古東部區玉米大斑病發生的關鍵因素。

內蒙古地區東西長約2 400 km,南北最大跨度1 700多km,橫跨東北、華北、西北地區,囊括了中國北方春玉米區的各種生態類型區,自西向東6個地區盟市之間氣象差異較大。在后續構建玉米大斑病發病程度預測模型中,可將東部3個地區劃為一類,西部3個地區劃為一類,分別構建模型。此外,玉米大斑病的發生還與玉米品種、侵染時期等因素密切相關,本研究僅研究分析了關鍵氣象因子對玉米大斑病菌孢子濃度的影響,在未來的研究中,可充分考慮玉米品種、侵染時段等因素對大斑病發生的影響。同時,將結合3 a田間病害調查結果,研究孢子濃度與病害發生程度的關系。本研究對于監測點附近的玉米品種沒有做干預,均以當地主栽品種為準并記錄了品種類型,主要為下一步建立更接近田間實際發生情況的內蒙古地區玉米大斑病發病程度的監測預警系統做準備。并且通過本研究已經確定了影響玉米大斑病發生的幾個關鍵因子如孢子濃度、溫度、相對濕度、品種等。

綜上所述,空氣中有效孢子濃度并不是由單一因素決定,而是多種因子綜合作用的結果。本研究基于孢子捕捉儀和Real-time PCR定量方法,明確了內蒙古地區玉米大斑病菌孢子的周年變化規律,同時分析了空氣溫度、相對濕度和降水量對孢子動態的影響,為后期構建基于孢子數量和氣象因子的預測模型奠定基礎,同時也為玉米大斑病的早期防治提供理論依據和參考價值。

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Annual Dynamic Variation of Conidium Number of? Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs in Inner Mongolia

LI Yanjia1,MA Lijie2,GUO Shuailing1,HU Xiaoping1,L? Jin2,

HUANG Weili3,LIANG Hongwei4,HAN Yanru5,LUO Guojun6,

JIANG Lihui7,LI Meng8 and? YUN Xu9

(1.Collage of? Plant Protection.Northwest A&F University,Key Laboratory of Integrated Management of Crop Pests on

the Loess Plateau,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Yangling? Shannxi 712100,China; 2.Ordos Vocational

College of Eco-environment,Ordos? Inner Mongolia 017010,China; 3.Xian Huangs? Biological Engineering Co.,

Ltd,Xian 710065 China; 4.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,

Hohhot 010031,China; 5.Linhe District Agricultural Technology Extension Center of Inner Mongolia,Bayannur

Innner Mongolia 015000,China; 6.Ningcheng County Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension

Center,Chifeng? Inner Mongolia 024205,China; 7.Kailu County Agricultural and Animal Husbandry Technology

Extension Center,Tongliao?? Inner Mongolia 028400,China; 8.Tuquan County?? Agricultural and Animal Husbandry

Technology Extension Center,Hinggan League? Inner Mongolia 137500,China; 9.Ordos Academy of

Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Ordos? Inner Mongolia 014300,China)

Abstract To investigate the dynamic change rule of pathogen spores of? Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs in Inner Mongolia and provide a more scientific basis for early warning and control of maize northern leaf blight,the numbers of conidia in the air of six maize-producing areas in Inner Mongolia were monitored for three consecutive years (2021-2023) by spore trapper and Real-time PCR.The results showed that the peak of the numbers of conidia in Inner Mongolia appeared in Mid-to-early June and Mid-to-late August.Correlation analysis showed that the numbers of conidia monitored in the six regions were positively correlated with air temperature (P<0.05).The numbers of conidia were positively correlated with the relative humidity in three regions of western Inner Mongolia (Bayan Nur,Ordos and Hohhot) (P<0.05),but were not significantly correlated with the relative humidity in three regions of eastern Inner Mongolia (Chifeng,Tongliao and Hinggan League).In conclusion,the key factors affecting spore concentration are air temperature and relative humidity in the west of Inner Mongolia,and the key factor affecting spore concentration is air temperature in the east of Inner Mongolia.

Key words Maize northern leaf blight; Conidium; Real-time PCR; Dynamic Monitor; Meteorological factors

Received? 2023-12-17??? Returned 2024-01-29

Foundation item Science and Technology Project of Inner Mongolia (No.2021GG0197);Project of Key Laboratory of Integrated Management of Crop Pests on the Loess Plateau,Ministry of Agriculture and Rural Affairs (No.KFJJ20210101); Ordos Industry Innovation Talent Project (No.2022).

First author LI Yanjia,female,master student.Research area:epidemiology of plant diseases.E-mail:Laleenareina@nwafu.edu.cn

Corresponding?? author HU Xiaoping,male,professor.Research area:epidemiology of plant diseases.? E-mail:xphu@nwsuaf.edu.cn

MA Lijie,female,associate professor.Researcharea:epidemiology of plant diseases.E-mail:malijie1016@163.com(責任編輯:郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

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