基于網(wǎng)絡藥理學探討“姜黃-虎杖”藥對干預足細胞病變的作用機制

趙凱 程小紅 盧芬萍 王悅彤 李娜梅 董誠 袁二磊

*基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFC1709404）；科技部國家重點研發(fā)計劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究項目（2018YFC1704201）

第一作者簡介：趙凱（1991-），男，碩士研究生，研究方向：慢性腎臟病基礎與臨床研究。

△通信作者：袁二磊，E-mail：18709189120@163.com

摘要：目的? 應用網(wǎng)絡藥理學預測“姜黃-虎杖”藥對干預足細胞病變的可能作用靶點與機制，為臨床應用及實驗研究提供思路。方法? 借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP），檢索姜黃、虎杖的化學成分及其對應靶點蛋白，運用Cytoscape3.2.1生物信息分析軟件繪制“疾病-成分-靶點”網(wǎng)絡圖。在OMIM、DrugBank、GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索足細胞病變相關(guān)靶點，利用Venny2.1.0獲取與“姜黃-虎杖”作用靶點的交集基因。應用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.2.1軟件的“CytoNCA”插件構(gòu)建交集基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡圖并進行拓撲學分析，獲取核心預測靶點。借助DAVID數(shù)據(jù)庫對交集基因進行（GO）和（KEGG）通路富集。結(jié)果? 獲得活性成分11種，其中姜黃3種、虎杖8種，主要包括豆甾醇（Stigmasterol）、木犀草素（luteolin）、囊毒堿（Physovenine）等。PPI網(wǎng)絡圖共包含節(jié)點33個、連線333條，AKT1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A）、TNF（腫瘤壞死因子-α）等基因處于核心位置。GO分析共獲得生物信息條目1127個（P<0.05），KEGG通路富集條目244個（P<0.05），主要涉及AGE-RAGE、PI3K-Akt、NF-κB、AMPK等信號通路等。結(jié)論? 姜黃-虎杖藥對可能通過參與細胞凋亡、氧化反應等生物過程，調(diào)控PI3K-Akt、NF-κB、AMPK等信號通路，從而發(fā)揮對足細胞病變的干預作用。

關(guān)鍵詞：姜黃；虎杖；足細胞病變；網(wǎng)絡藥理學

中圖分類號：R285.5??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1007-2349（2024）06-0060-09

足細胞是一種高度特化、沒有增殖潛能的內(nèi)臟上皮細胞，由足突、初級突起、胞體構(gòu)成，胞體通過足突貼覆在腎小球毛細血管基底膜外，與腎小球基底膜以及有孔內(nèi)皮細胞共同組成腎小球的濾過屏障［1］。而免疫性損傷如狼瘡性腎炎，血流動力學損傷如腎單位減少、足細胞機械牽拉，代謝因素如高血糖、高血脂，基因突變等都會導致足細胞結(jié)構(gòu)完整性破壞及細胞代謝失調(diào)，引起足細胞足突融合，進一步從腎小球基底膜脫離，腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能損害，產(chǎn)生蛋白尿，甚至腎小球硬化等疾?。?］。近年來隨著腎臟穿刺活檢術(shù)技術(shù)的成熟和腎臟損傷分子生物學研究的深入，腎小球足細胞病變在腎臟損傷中的重要作用多次被研究者提及，該病的防治越發(fā)受到腎臟病專業(yè)領域的學者的關(guān)注。筆者在跟隨程小紅主任醫(yī)師學習期間，發(fā)現(xiàn)姜黃、虎杖的聯(lián)合應用在有關(guān)足細胞病變的腎臟病治療中具有良好的療效。鑒于此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學技術(shù)初步探討“姜黃-虎杖”藥對干預足細胞病變的主要化學成分、作用靶點及相關(guān)信號通路，為后期基礎研究與臨床用藥的開展提供借鑒。

1? 資料與方法

1.1? “姜黃-虎杖”藥物活性成分及對應靶點收集? 借助數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）（https：//old.tcmspw-e.com/tcmsp.php），設置條件為口服生物利用度（OB）≥30％、類藥性指數(shù)（DL）≥0.18［3］。輸入關(guān)鍵詞“姜黃、虎杖”，篩選藥物化學成分、對應靶蛋白。并在UniProtKB數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中將檢索條件設置為“Organism：Homosapiens”，查詢潛在靶點蛋白的對應基因。

1.2? 疾病靶點基因的篩選? 以“podocyte disease”“podocytopathy”“Podocyte lesion”等足細胞病變的相關(guān)疾病為關(guān)鍵詞，分別利用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、DrugBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.com/）、在OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）進行檢索，得到各個數(shù)據(jù)庫中足細胞疾病靶點，去掉重復靶點并取并集，得到足細胞疾病靶點數(shù)據(jù)集。

1.3? 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建? 將篩選得出的姜黃、虎杖活性成分對應靶點基因與足細胞病變所對應基因上傳至Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中繪制韋恩圖，取得疾病藥物交集基因。將結(jié)果導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）中，獲取PPI網(wǎng)絡圖，利用Cytoscape3.2.1軟件的“CytoNCA”插件進行拓撲學分析，根據(jù)拓撲參數(shù)值進一步篩選網(wǎng)絡圖中核心靶點［4］。

1.4? GO分析和KEGG信號通路富集? 取姜黃-虎杖”與足細胞病變的交集基因，在DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中進行GO和KEGG生物學過程富集分析。以物種“Homo sapiens（人）”，標識符“（Official gene symbol）”為條件［3］，篩選P<0.05的富集條目，并以P值從小到大進行排序。獲取前20位富集條目導入OmicShareTools數(shù)據(jù)庫（https：//www.omicshare.com/tools/），以條形圖、氣泡圖形式展示富集分析結(jié)果。

2? 結(jié)果

2.1? “姜黃-虎杖”藥對化學成分篩選結(jié)果? 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得活性化學成分11種，其中虎杖8種、姜黃3種，設置條件為OB≥30％、DL≥0.18，活性化學成分基本信息詳見表1。

2.2? “疾病-成分-靶點”網(wǎng)絡分析? “姜黃-虎杖”藥對與足細胞病變的關(guān)鍵靶點圖見圖1。共包含節(jié)點123個、連線242條。其中，中藥節(jié)點2個、活性成分節(jié)點11個、靶點蛋白節(jié)點110個。其中豆甾醇、木犀草素、囊毒堿、beta-谷甾醇、槲皮素等對應的靶點較多，可能是姜黃-虎杖作用于足細胞病變的核心活性成分。

2.3? “姜黃-虎杖”藥物靶點與疾病靶點交集結(jié)果? 本次研究得出姜黃作用靶點28個、虎杖作用靶點98個、足細胞病變相關(guān)基因1552個。導入Venny2.1.0在線作圖（見圖2）后，獲取變交集基因44個，其中3個為柴胡與黃芩共同作用靶點（PTGS2、PTGS1、PIK3CG）。

2.4? PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析結(jié)果? 通過STRING數(shù)據(jù)庫在線構(gòu)建姜黃-虎杖干預足細胞病變的PPI網(wǎng)絡圖，結(jié)果以TSV格式導出并輸入Cytoscape3.7.1軟件中可視化，繪制出一個由33個節(jié)點組成包含333條邊的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖，同時根據(jù)Degree值對蛋白從大到小進行排列，Degree值為節(jié)點中心度，數(shù)值

越大代表節(jié)點之間關(guān)系更密切。本研究以Degree值≥30為篩選條件，共獲得910個關(guān)鍵靶點，由此推測AKT1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A）、TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、IL-6（白介素-6）、CASP3（胱天蛋白酶3）、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、EGFR（表皮生長因子受體）、JUN（核內(nèi)原癌基因）、TP53（腫瘤蛋白P53）可能為姜黃-虎杖干預足細胞病變的關(guān)鍵靶蛋白。

2.5? GO基因分析與KEGG通路富集結(jié)果? 通過GO基因分析得到1127個條目（P<0.05），其中生物過程（BP）條目1033個、細胞組成（CC）條目38個、分子功能（MF）條目56個，見圖3。生物過程主要以無機物反應（response to inorganic substance）、細胞凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、類固醇激素反應（response to steroid hormone）、氧化反應（response to oxygenlevels）等為主要富集條目，見圖4；細胞組成主要涉及膜筏（membrane rafts）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（transcription regulator complex）、膜側(cè)（side of membrane）、受體復合物（receptor complex）等，見圖5；分子功能主要涉及激酶結(jié)合（kinase binding）、蛋白質(zhì)同源二聚化活性（protein homodimerization activity）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）等，見圖6。KEGG富集獲得244個（P<0.05）信號通路，顯著富集的前20條通路詳見圖7。結(jié)果顯示姜黃-虎杖干預足細胞病變的可能與HepatitisB（乙肝病毒感染通路）、AGE-RAGEsignaling pathway indiabetic complications（糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Aktsignalingpathway）、HepatitisC（丙肝病毒感染通路）、NF-κB信號通路（NF-kappaB signaling pathway）、癌癥通路（Pathways in cancer）、瘧疾（Malaria）、AMPK信號通路（AMPK signaling pathway）等通路有關(guān)。表明姜黃-虎杖的活性靶點可通過調(diào)控多個通路協(xié)同發(fā)揮治療作用。

3? 討論

2002年P(guān)ollak首次提出“足細胞病”這一概念，即以足細胞病變?yōu)轱@著特點的腎小球疾病，機體代謝紊亂、血流動力學改變、免疫復合物形成、基因突變、中毒以及感染等皆可誘發(fā)，病理學一般表現(xiàn)為腎小球足細胞數(shù)量減少、腎小球基質(zhì)成分改變、基底膜的增厚、足突融合等，臨床出現(xiàn)大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫等癥狀［5］。根據(jù)病因可將足細胞病分為3類，原發(fā)性、獲得性和遺傳性。原發(fā)性足通常以微小病變、局灶節(jié)段性腎小球硬化以及膜性腎病的表現(xiàn)形式而發(fā)??；而獲得性足細胞病多為自身免疫性、感染相關(guān)性、藥物相關(guān)性、腫瘤相關(guān)性、腎移植相關(guān)性膜性腎病等；遺傳性足細胞病有家族性腎病綜合征、遺傳性FSGS等［6-7］。

中醫(yī)古籍中并無“足細胞病變”的名稱，但根據(jù)其臨床特點，一般歸于中醫(yī)“水腫”、“尿濁”、“腎勞”等范疇。水腫多由體內(nèi)肺、脾、腎三臟功能失調(diào)所致，肺為華蓋，在上不能制約水源，脾臟無力運化水濕，腎臟在下不能固攝精氣，精微物質(zhì)流失，氣虛無法通調(diào)水道，從而導致疾病的發(fā)生。程小紅主任醫(yī)師從醫(yī)40余年，在中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟病方面具有豐富的臨床經(jīng)驗，認為其病因病機主要為本虛標實，正虛為本，濕邪為標，兼雜瘀血。正虛為本，正如《景岳全書》［8］曾論證水腫道：“凡欲辨水氣之異者，在欲辨其陰陽耳……若病在水分，則多為陰證……陽衰則氣不化，而精即為水……水不能化，因氣之虛……此水腫之病，所以多屬陽虛也。瘀血為患，《血證論》［9］中言：“水濕泛溢，阻滯氣機……，血行緩慢而成瘀……”。程小紅主任醫(yī)師在腎臟病理學領域具有較高的造詣，將顯微鏡下的病理改變視為中醫(yī)望診的延伸，認為腎臟足細胞病變屬“腎絡微型癥瘕”，治療上注重活血化瘀散結(jié)。臨床治療尤其善使用姜黃、虎杖藥對，姜黃可行氣、破血、除風熱，虎杖能利濕、清熱、活血化瘀，二者配伍具有清熱利濕，活血行氣之功效?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，姜黃含有姜黃素類、揮發(fā)油類、黃酮類、酚酸類等成分，并且具有較好的抗腫瘤、抗病毒、抗炎、調(diào)血脂等作用［10］?；⒄群休祯?、二苯乙烯類、萜類等化學成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、改善糖脂代謝、心血管、肝、腎保護等作用［11］。

本研究通過“疾病-成分-靶點”網(wǎng)絡模型的預測分析得出為豆甾醇、木犀草素、囊毒堿、beta-谷甾醇、槲皮素等作用靶點較多，推測為“姜黃-虎杖”干預足細胞病變的主要活性成分。相關(guān)藥理學研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性，可通過調(diào)節(jié)雌激素、內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素等信號通路上MAPK3、PRKACA等核心靶點的表達，調(diào)控細胞因子水平，從而發(fā)揮抗炎作用［12-13］。槲皮素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，可通過抑制p38MAPK、NF-κB信號通路抑制炎癥因子的表達，從而發(fā)揮抗炎、改善氧化應激和免疫調(diào)節(jié)作用，進一步減輕腎小球系膜增生和基底膜增厚，發(fā)揮保護腎臟功能的目的。靳英麗等［14］研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過增強nephrin和podocin蛋白在足細胞內(nèi)的表達保護腎臟。張兆洲等［15］研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過阻斷轉(zhuǎn)化生長因β1信號轉(zhuǎn)導通路中的分子，抑制轉(zhuǎn)化生長因子P1誘導的足細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，達到維持腎小球濾過屏障的完整性的作用。相關(guān)研究表明β-谷甾醇可通過降低因組胺釋放引起的小鼠毛細管通透性增加，抑制NF-κB信號通路，活化IL-10，降低PEG2、緩激肽、組胺等炎癥介質(zhì)活性，緩解炎癥反應［16-17］。木犀草素屬于黃酮化合物，存在于多種植物中，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護和抗過敏的特性。木犀草素中含有的酚羥基具有較強的還原性，同時它還可抑制環(huán)氧化酶２的產(chǎn)生，從而抑制氧化反應［18］。木犀草素同時能夠調(diào)節(jié)IL-6、IL-10等炎癥因子表達抑制炎癥反應［19］。

信號通路作為細胞外分子信號經(jīng)細胞膜傳入細胞內(nèi)發(fā)揮效應的一系列酶促反應通路，在整個生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用［3］。本次研究KEGG通路富集結(jié)果顯示PI3K-Akt、癌癥、AMPK、NF-κB等可能是“姜黃-虎杖”藥對干預足細胞病變的關(guān)鍵信號通路。PPI拓撲學分析結(jié)果顯示，AKT1、VEGFA、TNF-α、IL-6、CASP3、MAPK1等靶點處于網(wǎng)絡核心位置?？赡転榻S-虎杖干預足細胞病變的關(guān)鍵靶蛋白。PI3K/Akt信號通路作為一個復雜的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程。有研究表明足細胞損傷中肌動蛋白細胞骨架的紊亂與PI3K有關(guān)。PI3K/AKT 信號通路是mTOR 的上游調(diào)控通路，NR1 被認為具有足細胞保護作用，而PI3K/AKT/mTOR 信號通路的活化參與 NR1 介導細胞保護作用［18］。在足細胞病變中，由CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）介導PI3K募集于質(zhì)膜上，并刺激足細胞中PI3K依賴的Akt信號轉(zhuǎn)導，最終引起足細胞結(jié)構(gòu)、功能完整性損傷，甚至凋亡［20］。NF-κB信號通路可調(diào)控參與炎癥反應的基因表達，是足細胞損傷的重要靶點。TLR4作為NF-κB上游轉(zhuǎn)錄因子，在腎小球炎癥過程也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TNF-α和IL-6是TLR4/NF-κB信號通路激活的產(chǎn)物，而高糖刺激可促進TLR4高表達，激活的TLR4在腎臟中進一步誘導足細胞中NF-κB的活化，而促進炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，加重足細胞的炎癥損傷［21-23］。AMPK信號通路是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是足細胞關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)器和能量傳感器，由AMP／ATP比值決定其活性，當出現(xiàn)ATP消耗增加、AMP濃度升高的情況時，比如缺血缺氧、低血糖、應激、和運動等，可調(diào)控AMPK活化，促進足細胞營養(yǎng)吸收并增強其分解代謝［24］。相關(guān)研究表明通過調(diào)控AMPK通路改善足細胞能量代謝，抑制氧化應激，減少足細胞凋亡，促進足細胞肌動蛋白重塑等方式減輕糖尿病腎病足細胞損傷，進一步延緩病情進展［25］。腎小管上皮細胞及內(nèi)皮細胞可分泌TNF-α，可介導炎性因子的分泌及聚集，進一步加重炎腎臟損傷［26］。苑佳奇等［27］研究發(fā)現(xiàn)隨著TNF-α作用濃度及作用時間的增加，足細胞受損嚴重，相關(guān)蛋白表達量明顯降低。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一 種多向性分子，其中在骨髓的造血細胞、發(fā)育腎組織的神經(jīng)纖維中都有表達，并且多種生物效應的發(fā)揮也會通過 VEGF和它的異性受體相互結(jié)合。腎小球中的VEGF可自行分泌后繼續(xù)作用于足細胞，且在足細胞上有特異性的結(jié)合位點，對足細胞進行增殖和分化扮演非常重要的作用［28］。以上研究均間接的驗證了本研究預測的生物過程和信號通路的可行性。

綜上所述，姜黃-虎杖藥對的關(guān)鍵活性成分為豆甾醇、木犀草素、囊毒堿、beta-谷甾醇、槲皮素等，可能通過PI3K-Akt、癌癥、AMPK、NF-κB等信號通路作用于AKT1、VEGFA、TNF-α、IL-6、CASP3、MAPK1等核心靶點發(fā)揮穩(wěn)定足細胞病變功能。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的特性，與中醫(yī)藥治療整體觀的基本思路相符合，為后續(xù)的臨床和實驗研究提供了客觀依據(jù)。但此次局限于在線數(shù)據(jù)庫的生物信息分析層面，仍需進一步實驗研究進行驗證。

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（收稿日期：2023-08-07）