超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物

摘要：通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法對5種水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物進行分析。樣品前處理經(jīng)乙腈溶液超聲提取，采用中性氧化鋁固相萃取柱凈化，通過Shim-pack XR-ODS色譜柱分離，流動相系統(tǒng)（含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇）梯度洗脫后，在正離子模式下以電噴霧電離多反應模式監(jiān)測，同位素內(nèi)標法定量。5種水產(chǎn)品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物在0.5～20.0 μg/L范圍內(nèi)，標準曲線相關系數(shù)均大于0.998，線性良好，4種目標化合物在1～4 μg/kg，加標回收率為78.9%～96.8%，相對標準偏差（RSD）為1.1%～5.2%。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；孔雀石綠；結晶紫；代謝物；水產(chǎn)品

中圖分類號：S948""" 文獻標識碼：A

基金項目：天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心青年科技項目（nyzj202202）

作者簡介：韓現(xiàn)芹（1981—），女，河北保定人，碩士，高級農(nóng)藝師，從事水產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究。

孔雀石綠（Malachite green，MG）和結晶紫（Crystal violet，CV）均屬于人工合成的含有三苯甲烷類堿性工業(yè)染料［1］，多年來，廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和運輸過程中，作為驅蟲劑、防腐劑和殺菌劑使用，以防治魚體水霉病、爛鰓病及小瓜蟲病等［2］，在酒店或餐館暫養(yǎng)池中延長鮮活水產(chǎn)品的存活時間［3］。因其效果顯著，備受養(yǎng)殖戶推崇。

MG和CV在生物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物分別是隱性孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）和隱性結晶紫（Leucocrystal violet，LCV）［4］。MG和CV及其代謝產(chǎn)物具有高毒性，通過引入自由基生成、游離DNA斷裂和染色體畸變引起致癌和遺傳毒性變化［5］，并長時間殘留于生物體內(nèi)。人體攝入后可能對人類的肝臟、腎臟、脾臟和生育率造成不良影響。因此，歐盟、加拿大及美國均已將其列入水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物［6］，在中國《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號）中規(guī)定，孔雀石綠為食品動物中禁止使用的藥品（在動物性食品中不得檢出）。

由于MG和CV價格低廉而且易得，對水霉病的特效性，且沒有更好的替代品出現(xiàn)，盡管國家明令禁止使用，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)仍存在違規(guī)使用的情況，多年禁而不止。據(jù)市場監(jiān)管總局報道，2021年每個季度都有水產(chǎn)品中檢出孔雀石綠的現(xiàn)象［7］，由于孔雀石綠對生態(tài)環(huán)境和人類健康構成的潛在威脅，這幾年一直是嚴打的對象。不同水產(chǎn)品因其肌肉蛋白質(zhì)和脂肪含量不同，容易引起基質(zhì)效應。因此，對MG、CV及其代謝物的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）檢測方法進行優(yōu)化，對其基質(zhì)效應進行探討，為魚類產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測提供技術支撐，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品試劑

島津DGU-20A5R超高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX三重四級桿5500質(zhì)譜儀配備電噴霧離子源（日本島津公司，美國SCIEX公司）；3-18K高速離心機（德國Sigma公司）；Vortex-2型渦旋混勻儀；分析天平（XS105型，瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超聲機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；氮吹儀（N-EVAP-24型，美國Organomation公司）；IKA T25數(shù)顯型分散機（德國IKA公司）。

孔雀石綠（MG）、結晶紫（CV）、隱性孔雀石綠（LMG）、隱性結晶紫（LCV）、孔雀石綠-D5、隱性孔雀石綠-D6標準品，純度均＞99.0%，均購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；甲酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水乙酸銨（色譜級，德國Sigma公司）；中性氧化鋁柱（3 mL，500 mg，天津艾杰爾公司）；試驗用水（超純水，屈臣氏）；0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 主要溶液配制

儲備液的配制：準確稱取MG、CV、LMG和LCV標準品各0.01000 g（精確至0.000001 g），分別用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，即1 mg/mL的儲備液，MG-D5和LMG-D6分別用甲醇配制成0.5 mg/mL標準溶液，儲備于棕色瓶并在-18 ℃冰箱中保存。

標準工作液：分別吸取MG、CV、LMG和LCV儲備液用甲醇逐級稀釋為100 ng/mL的混合標準工作液。同法制得MG-D5和LMG-D6的100 ng/mL的混合內(nèi)標標準溶液。于4 ℃冰箱中避光保存1個月。用乙腈水溶液（乙腈/流動相=1∶1）將孔雀石綠配置成1～40 μg/kg標準序列溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備

將水產(chǎn)品去皮/殼，取可食用部分，用均質(zhì)機絞碎，備用。

1.3.2 提取

稱取5.0 g均質(zhì)試樣于50.0 mL離心管中，加入200 μL 100.0 ng/mL混合內(nèi)標標準工作液，加入10 mL乙腈，渦旋混合5 min，9000 r/min離心5 min。然后將上清液轉移至25.0 mL容量瓶中，殘渣再加入10 mL乙腈，重復提取一次，上清液合并轉移至同一容量瓶中，乙腈定容，待凈化。

取空白魚肉樣品前處理取得空白基質(zhì)溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 ng/mL的基質(zhì)匹配混合標準溶液（其中內(nèi)標質(zhì)量濃度均為2.0 ng/mL）。

1.3.3 凈化

中性氧化鋁固相萃取柱，事先用2 mL乙腈對其進行活化，移取5 mL待凈化液加入固相萃取柱凈化，然后用2 mL乙腈淋洗，收集洗脫液于45 ℃水浴下氮吹至近干，加入2.0 mL初始流動相溶液渦旋混合1 min溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS（2.0 mm I.D.×75 mm）；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL；流動相A：2 mmol/L乙酸銨水溶液（含體積分數(shù)0.1%甲酸）；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序見表1。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：35.0 psi；碰撞氣壓力：9 psi；噴霧氣和輔助氣壓力：55.0 psi。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究中的目標化合物分別為MG、LMG、CV、LCV、MG-D5和LMG-D6，均為氫鍵供體，易形成M+1型分子離子峰，因此采用正離子模式。分別移取0.02 μg/mL單標溶液，通過二通將質(zhì)譜和液相色譜連接，以針泵注射方式進入電噴霧離子源，優(yōu)化各分析物的母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能量等。本研究使用儀器為AB 5500三重四級桿質(zhì)譜儀，優(yōu)化參數(shù)結果如表2所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗在正離子模式下，以Shim-pack XR-ODS作為分離色譜柱，分別研究了以甲醇溶液和乙腈溶液作為有機相時目標物的分離情況，結果顯示乙腈溶液分離度較好，靈敏度較高，因此試驗選定乙腈溶液作為有機相。以乙酸銨-甲醇為流動相，經(jīng)過C18色譜柱分離，用內(nèi)標法在正離子模式下以電噴霧電離多反應模式監(jiān)測進行定量分析。標準溶液的MRM色譜圖見圖1。

2.3 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在魚肉空白中，添加一系列濃度的4種標準溶液，以響應強度為縱坐標，添加濃度為橫坐標，進行回歸分析，添加質(zhì)量濃度范圍和線性方程見表3，結果顯示，4種目標物在線性范圍內(nèi)的相關系數(shù)r均大于0.99，線性關系良好。回歸方程、相關系數(shù)、檢出限（信噪比S/N≥3）、定量限（信噪比S/N≥10）見表3。

2.4 方法的回收率和精密度試驗

分別以加州鱸、鯉、草魚、鰱和鳙5種空白樣品為基質(zhì)，進行加標回收實驗，添加量分別為1、2、4 μg/kg混合標準溶液，每個添加量6個重復，密封、渦旋，冷藏24 h。轉天取出，避光，常溫，自然融化，之后按照樣品的前處理方法進行提取、凈化、濃縮。由表4可知，在不同的添加水平下，4種目標物的平均回收率范圍為78.9%～96.8%，RSD在1.1%～5.2%之間，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F的要求，表明該方法準確度較高，精密度良好，能夠滿足檢測要求。

2.5 實際樣品的測定

該方法減少了繁瑣的前處理過程，9 min內(nèi)完成1針進樣，降低了人力物力成本，提高了檢測效率，且方法靈敏度高，準確性好，適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠定性篩查和定量檢測。采用該方法對日常監(jiān)督抽檢及天津市售的300批次魚類樣品進行檢測，未在樣品中檢出孔雀石綠和結晶紫及其代謝物，符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號規(guī)定。

3 結論

本研究優(yōu)化了液相色譜和質(zhì)譜儀器條件，測定5種水產(chǎn)品基質(zhì)中MG、LV及其代謝物的回收率，并進行了方法學論證。該方法優(yōu)化了前處理方法，減少了繁瑣的過程，兩針進樣16 min可完成檢測，提高了效率，降低了成本，具有適應性廣、簡單快速、靈敏度高和結果可靠等優(yōu)點，適用于水產(chǎn)品中MG、LV及其代謝物殘留的快速篩查和檢測，可為建立更快速、準確地檢測水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的方法提供新思路。

參考文獻

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［7］Commission of the European Communities.Commission decision 2002/675/EC：implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results［Z］.European Commission：Belgium，2002-08-17.

［8］中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號［EB/OL］.（2019-12-27）［2024-04-10］.http：//www.moa.gov.cn/govpublic/xmsyj/202001/t20200106_6334375.htm.

［9］國家市場監(jiān)督管理總局.市場監(jiān)管總局關于20批次食品抽檢不合格情況的通告〔2021年 第21號〕［EB/OL］.（2021-05-06）［2024-04-10］.https：//gkml.samr.gov.cn/nsjg/spcjs/202105/t20210507_329238.html.