3種梨樹鏈格孢病菌的鑒定、遺傳多樣性及其對殺菌劑的敏感性

賈藝凡 趙延存 李朝輝 孫偉波 劉鳳權

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.018

摘要：梨黑斑病是梨樹的主要真菌病害之一，可引起葉片早落，降低梨果產量及品質，造成巨大經濟損失。本研究從各地區梨園采集病葉病果后進行病原菌分離，基于形態學觀察和多基因串聯進化樹構建對分離的病原菌進行鑒定，并進行室內藥劑敏感性試驗。結果表明，從昆明、碭山、成都、貴陽等地采集的樣品中分離鑒定到梨黑斑病菌41株，將其分為4個種，分別為喬木鏈格孢（Alternaria arborescens，3株）、梨黑斑鏈格孢（A. gaisen，1株）、棉鏈格孢（A. gossypina，1株）、鏈格孢（A. alternata，36株）。選取3種鏈格孢進行致病力分析，在翠玉梨葉片、庫爾勒香梨果實上均表現致病性，但致病力存在差異。4種殺菌劑室內藥劑敏感性測定結果表明，3種梨黑斑病菌對咪鮮胺、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯均有較好的敏感性，抑制中濃度（EC50值）為0.051 8～10.114 7 mg/L；喬木鏈格孢9-15菌株對嘧菌酯敏感性較好，EC50值為1.533 0 mg/L；喬木鏈格孢8-34、9-53，黑斑鏈格孢9-1，棉鏈格孢8-46對嘧菌酯敏感性較差。明確了3種可引起梨黑斑病的鏈格孢屬真菌特性及其對不同藥劑的敏感性，為后續藥劑防治提供技術支撐。

關鍵詞：梨黑斑病；鏈格孢；病原菌鑒定；致病力分析；敏感性

中圖分類號：S436.612；S182；S482.2? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0137-08

收稿日期：2023-05-15

基金項目：國家現代農業產業技術體系資助項目（編號：CARS-28）；江蘇省現代農業梨產業技術體系項目（編號：JATS［2023］049）。

作者簡介：賈藝凡（1990—），女，河北石家莊人，碩士，助理研究員，主要從事果樹病害研究。E-mail：yifanjia123@163.com。

通信作者：劉鳳權，博士，研究員，主要從事植物病害防控研究。E-mail：fqliu20011@sina.com。

我國是世界上最大的梨生產國，根據聯合國糧食及國家統計局數據，2019年中國梨栽培面積達94.07萬hm2，產量1 731.4萬t（2020年已達1 781.5萬t），占世界梨產量的71.45%。梨黑斑病對于梨樹危害重大，主要侵染果實、葉片和新梢，嚴重時導致葉片皺縮變形焦枯，果實龜裂，葉和果實提前脫落、新梢枯死，在世界各梨產區均有發生，給梨產業造成重大經濟損失［1-4］。梨黑斑病于1933年在日本首次由Tanaka報道；1935年，我國首次發現梨黑斑病［5-6］。梨黑斑病是由鏈格孢（Alternaria sp.）類真菌引起，目前，梨果實上鏈格孢已發現9個種，我國共發現其中6個種，即梨黑斑鏈格孢（A. gaisen K.Nagan）、鏈格孢［A. alternata （Fr.） Keissler］、極細鏈格孢（A. tenuissima）、侵染鏈格孢（A. infectoria）、鴨梨侵染鏈格孢（A. yaliinficiens R.G. Roberts）、紫萼鏈格孢（A. ventricosa R.G.Roberts）［7-10］。其中，A. alternata、A. tenuissima和A. infectoria主要生長在植物的枯死部分或衰弱部位上，A. yaliinficiens和 A. ventricosa是由美國生物學家Roberts在2003年和2007年從中國進口的鴨梨樹中分離并鑒別出來的2個新種［11-12］。

引起梨黑斑病的鏈格孢在我國分布較為廣泛，種類多樣，危害嚴重，目前主要依賴化學藥劑進行防治，且存在盲目過量施用現象。本研究比較分析來源不同的3種梨黑斑病菌的遺傳特征、菌落菌體形態、致病性及對4種殺菌劑的敏感性，旨在為我國梨黑斑病菌的分類、病害監測及科學選藥提供依據。

1? 材料與方法

1.1? 樣品采集及分離純化

2018—2020年，從陜西銅川、江蘇南京、云南昆明、安徽碭山、四川成都、貴州貴陽等10個省份的33個梨園采集100余份病葉與病果，用組織分離法進行樣品分離。用已滅菌手術刀在發病部位與健康部位交界處切取一小部分組織，每個樣品取3塊，放入75%乙醇中浸泡30 s進行消毒，再用無菌水清洗2次。將清洗后的組織用無菌濾紙按壓至干爽狀態，將該組織置于新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中，25 ℃恒溫培養2～3 d，待長出真菌后，從邊緣打孔，將菌絲塊轉接到新的PDA培養基中，在25 ℃恒溫培養箱中黑暗倒置培養6～9 d。

1.2? 病原菌鑒定

1.2.1? 病原菌形態學觀察

將菌株純培養后，采用5 mm打孔器在菌落邊緣打出菌塊，放置于PDA培養基平板中，每個處理3個重復，將其倒置于25 ℃恒溫培養箱中，黑暗培養7 d后，觀察菌落形態、顏色等特征。利用光學顯微鏡對分生孢子梗和分生孢子形態特征進行觀察，并對其進行攝影記錄。

1.2.2? 病原菌分子鑒定

1.2.2.1? 病原菌基因組DNA提取

使用T5 Direct PCR Kit（南京擎科生物科技有限公司）提取菌株的DNA，具體操作如下：利用無菌牙簽從菌落邊緣挑取少量菌絲，放入裝有50 μL Lysis Buffer A溶液的離心管內，95 ℃加熱10 min（較難裂解的樣品可適當增加裂解時間），12 000 r/min離心1 min，取上清液1～3 μL為模板進行PCR擴增（雜質含量較高時，可取適量上清液與等體積的Dilution Buffer B混勻后，取1～3 μL為模板進行PCR擴增）。

1.2.2.2? 病原菌基因組擴增和測序

采用分子鑒定法對得到的菌落進行鑒定。利用特異性引物分別采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增病原菌內部轉錄間隔區核苷酸序列ITS以及翻譯延伸因子TEF1、鏈格孢過敏原基因Alta1、內聚半乳糖醛酸酶基因endoPG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH序列。序列擴增引物見表1。PCR 擴增選用20 μL 體系，包括無菌水8.5 μL，2×Hieff PCR Master Mix 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板 0.5 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃補充延伸5 min，ITS、TEF1、Alta1、endoPG、GAPDH擴增的退火溫度分別為52、52、59、54、59 ℃，反應30 s，30個循環。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳，其中緩沖劑選擇TBE，在140 V下上樣5 μL電泳檢測。將PCR擴增產物送至南京擎科生物科技有限公司進行序列測定，將獲得的序列在NCBI數據庫中進行Blastn比對（表2）。

1.2.2.3? 多基因系統進化分析

將對比后的基因序列與參考文獻中報道的引物對應的序列，在MAGA 7.0軟件中進行多基因對比分析，使用最大似然法進行系統發育分析，構建系統發育進化樹。

1.3? 病原菌致病性測定

1.3.1? 葉片刺傷接種

2021年，通過葉片針刺接種測定各菌株的致病性。挑選大小均勻的翠玉梨葉片，噴灑75%乙醇進行表面消毒后，用無菌水漂洗處理，之后用無菌牙簽刺傷葉片，在傷口上接種供試菌株菌餅，設置PDA培養基為空白對照，將葉片放在白色無菌搪瓷盤中，并將無菌脫脂棉浸沾無菌水覆于葉柄上，每個黑斑病菌株設置3個重復，并用保鮮膜封閉保濕。將搪瓷盤放置在25 ℃恒溫培養箱中，培養5 d后觀察記錄發病情況。

1.3.2? 果實有傷接種

2021年，通過果實針刺接種測定各菌株的致病性。選取大小一致的庫爾勒香梨果實，用水將香梨洗凈，再使用75%乙醇噴灑到梨果表面達到消毒的效果，最后用無菌水清洗果面。用無菌牙簽刺傷果面，將菌餅接種于傷口處，每個黑斑病菌株設置3個重復，將接種后的香梨放入無菌保鮮盒中密封，在25 ℃恒溫培養箱中培養 6 d 后觀察并記錄發病情況。

病果分級標準：0級，無病斑；1級，病斑直徑≤1.0 cm；2級，病斑直徑1.1～2.0 cm；3級，病斑直徑2.1～3.0 cm；4級，病斑直徑3.1～4.0 cm；5級，病斑直徑≥4.1 cm［18］。

1.4? 梨黑斑病菌對4種常用殺菌劑的室內敏感性測定

生長速率法是測定病原真菌對殺菌劑敏感性的常規方法之一，2021年測定各菌株對梨生產上4種常用殺菌劑的敏感性［19］。4種殺菌劑原藥分別用甲醇溶解，配制母液，然后按照以下各藥劑的終濃度分別添加到液態的PDA培養基中，快速混勻倒入無菌平皿中，制備各藥劑5個濃度梯度的PDA平皿，即嘧菌酯（10、20、40、80、160 μg/mL）、咪鮮胺（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL）、苯醚甲環唑（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL）、吡唑醚菌酯（0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL）。每種濃度重復3次，在PDA培養基中加入同等比例的甲醇作為空白對照。在梨黑斑病菌菌落邊緣打孔（直徑5 mm），將菌餅置于已制備好的PDA平板中心，而后放入25 ℃培養箱內倒置培養，6 d后以十字交叉法測量記錄菌落直徑，按照公式（1）計算抑制率。

抑制率=［（對照菌落直徑-0.5）-（處理菌落直徑-0.5）］/（對照菌落直徑-0.5）×100%。（1）

以藥劑濃度的對數值為自變量，抑制率對應的概率值為因變量，擬合每種殺菌劑對各菌株的毒力回歸方程，計算EC50值及相關系數。

2? 結果與分析

2.1? 病原菌的鑒定與基因序列分析

基于菌株的形態學和5個基因序列（ITS、endoPG、GAPDH、Alta1和TEF1）的特征，將2018—2020年從江蘇省、陜西省、云南省等梨產區采集的梨黑斑病病樣中分離純化獲得的41個菌株初步鑒定為鏈格孢菌，進一步將每個菌株的5個基因序列串聯起來，使用MAGA 7.0進行系統發育分析。結果發現，除鑒定到常規的鏈格孢（A. alternata）36株，還基于多基因串聯進化樹分析鑒定到喬木鏈格孢（A. arborescens）3株、梨黑斑鏈格孢（A. gaisen）1株、棉鏈格孢（A. gossypina）1株（圖1）。鏈格孢（A. alternata）多生長于植物的干枯和衰弱部位，在我國各梨產區均有發生且已被系統研究，但關于梨黑斑鏈格孢、喬木鏈格孢和棉鏈格孢的研究相對較少，對其生物學特性、致病性及其對不同殺菌性的敏感性、發生流行的潛在風險缺乏認識［20］。

2.2? 病原菌的分布

從10個省份13個市采集的病害樣品中共分離

鑒定得到41株菌株，其中36株鏈格孢（A. alternata）菌株分別來源于江蘇南京7株、江蘇鎮江1株、陜西銅川4株、陜西咸陽1株、云南昆明1株、四川金川2株、四川成都1株、貴州貴陽1株、安徽碭山5株、山西長治5株、浙江杭州2株、河南商丘3株、河北邢臺3株；3個喬木鏈格孢菌株分別來源于云南昆明2株、安徽碭山1株；1個梨黑斑鏈格孢（A.gaisen）菌株來自四川成都；1個棉鏈格孢（A.gossypina）菌株來自貴州貴陽（表3）。

2.3? 病原菌形態學特征

2.3.1? 菌落形態

將3株喬木鏈格孢（8-34、9-15、9-53）、 1株梨黑斑鏈格孢（9-1）、 1株棉鏈格孢（8-46）在PDA固體培養基平皿上培養7 d后發現，各菌株菌落形態差異明顯（圖2），其中8-34、9-1 和8-46菌株的菌絲為綠色，9-15和9-53菌株的菌絲為深灰色，均可以產生黑色素；9-15和9-53菌落邊緣呈白色且比較平整，8-34、9-1和8-46菌落邊緣呈灰色波浪狀；9-1和8-46菌落伴有大量白色絨毛狀氣生菌絲；9-15菌株生長最快，8-34菌株生長最慢。

2.3.2? 病原菌在PDA培養基上的產孢表型

從圖3可以看出，3種鏈格孢在PDA培養基上的產孢表型存在一定差異，其中喬木鏈格孢菌株8-34、9-15不產孢；喬木鏈格孢9-53、黑斑鏈格孢9-1、棉鏈格孢8-46均可產生分生孢子，分生孢子著生在氣生菌絲上。喬木鏈格孢9-53產生分生孢子鏈，是在1根分生孢子梗上形成多個樹狀分枝，鏈長 1～11個孢子；梨黑斑鏈格孢9-1形成分生孢子短鏈，這些短鏈能多次分枝且形成在1根分生孢子梗上，鏈長1～4個孢子；棉鏈格孢8-46形成不分枝的分生孢子長鏈，鏈長3～11個孢子。

2.3.3? 分生孢子形態觀察

3種鏈格孢分生孢子形態觀察結果（圖4）顯示，喬木鏈格孢分生孢子橫隔數為1～4個，縱隔數為0～1個，主要呈卵形，梨黑斑鏈格孢分生孢子橫隔數1～4，縱隔數0～2，主要呈闊倒棒狀或倒梨形，棉鏈格孢分生孢子橫隔數2～3，縱隔數1～2，主要呈梨形。

2.4? 病原菌的致病力分析

2.4.1? 病原菌對梨葉的致病力分析

將喬木鏈格孢菌株8-34、9-15、9-53，梨黑斑鏈格孢9-1，棉鏈格孢8-46離體接種于翠玉梨葉片上。從圖5可以看出，病斑為褐色或黑褐色，形態為圓形斑點，周圍具淡黃色暈圈，拓展后呈近圓形，有時也呈不規則狀，中間灰褐色，邊緣黑褐色，呈黑斑病的典型癥狀。接種5 d后，喬木鏈格孢8-34致病力最強，病斑直徑為1.06 cm；梨黑斑鏈格孢9-1次之，病斑直徑為0.99 cm。

2.4.2? 病原菌對梨果的致病力分析

將鑒定出的菌株喬木鏈格孢8-34、9-15、9-53，梨黑斑鏈格孢9-1，棉鏈格孢8-46離體接種于庫爾勒香梨果實上，培養6 d后發現，果面出現淺褐色或黑褐色圓形病斑，病斑略凹陷，果肉軟腐，對照果實未發病。根據病情指數得到的病果分級標準，喬木鏈格孢 8-34病斑直徑為2.1 cm，屬于3級病斑，致病力最強；其他菌株病斑直徑為1.4～1.6 cm，屬于2級病斑，致病力較弱。由于果實病斑為曲面且不規則，因此為了表示更為準確，柱形圖使用病斑面積（圖6）。

2.5? 梨黑斑病菌對4種常用殺菌劑的敏感性測定結果

選取生產上4種常用殺菌劑嘧菌酯、咪鮮胺、苯醚甲環唑和吡唑醚菌酯，測定5株梨黑斑病菌對藥劑的敏感性（表4）。嘧菌酯對5株黑斑病菌的EC50值分別為332.175 4、1.533 0、127.427 5、24.777 9、140.739 3 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對嘧菌酯最敏感，昆明喬木鏈格孢菌株8-34對嘧菌酯最不敏感；咪鮮胺對5株黑斑病菌的EC50值分別為0.216 7、0.051 8、1.001 0、0.294 4、0.773 8 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對咪鮮胺最敏感，碭山喬木鏈格孢菌株9-53對咪鮮胺最不敏感；苯醚甲環唑對5株黑斑病菌的EC50值分別為0.221 4、0.093 0、0.899 9、0.328 8、0.768 6 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對苯醚甲環唑最敏感，碭山喬木鏈格孢菌株9-53對苯醚甲環唑最不敏感；吡唑醚菌酯對5株黑斑病菌的EC50值分別為0.778 1、0.131 3、10.114 7、0.612 2、1.823 2 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對吡唑醚菌酯最敏感，碭山喬木鏈格孢菌株9-53對吡唑醚菌酯最不敏感。

結果表明，昆明喬木鏈格孢菌株9-15對4種殺菌劑都最敏感，昆明喬木鏈格孢菌株8-34、碭山喬木鏈格孢菌株9-53、成都梨黑斑鏈格孢9-1及貴陽棉鏈格孢8-46對嘧菌酯敏感性較差，對咪鮮胺、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯敏感性較好。

3? 討論與結論

梨黑斑病是我國梨樹的主要真菌病害之一，由鏈格孢屬真菌引起，可侵染危害梨樹葉片、果實和新梢，發病嚴重時影響梨果的品質和產量，導致巨大經濟損失。目前，梨黑斑病仍是生產上亟待解決的問題。

鏈格孢屬在早期分類系統中屬于半知菌類，在新的分類系統中屬于真菌界子囊菌門座囊菌綱格孢腔菌目格孢腔菌科。初期鏈格孢屬真菌的分類鑒定主要依據形態學特征、寄主專一性、分子標記，但這些分類標準存在一些不足。鏈格孢屬的形態特征隨著營養、溫度、光照、pH值等條件的不同，會發生變化，因此，不能通過形態特征來準確鑒定鏈格孢菌的種類［21］。寄主專一性也不能作為分類標準，是因為鏈格孢通常是多種復合侵染，難以判斷寄主范圍和專一性。單個的分子標記在現代分子生物學中應用比較廣泛，可以區分遺傳距離較遠的鏈格孢種，但無法區分親緣關系較近的種。2013年，Lawrence等應用gpd、Alt a1、ACT、ATP、CAL等5個核酸蛋白質編碼位點，將鏈格孢屬劃分為8個組群［14］。多基因聯合構建系統發育進化樹的精準度高于基于單基因構建的系統發育進化樹，目前在分類研究中被普遍應用［22-23］。本研究通過對5株鏈格孢菌多基因聯合構建系統發育進化樹，明確1株屬梨黑斑鏈格孢、3株屬喬木鏈格孢、1株屬棉鏈格孢。采用這分屬3個種的5個菌株接種翠玉梨葉片和庫爾勒香梨果實，結果均表現致病性。對翠玉葉片，8-34 菌株致病力強，9-1致病力中等，其他菌株致病力較弱；對香梨果實，8-34菌株致病力最強，與葉片致病性測定結果一致。

在明確致病類型和分類地位的基礎上，測定5株代表性菌株對生產上常用的4種殺菌劑的敏感性，結果發現，來源于昆明的喬木鏈格孢菌株9-15對4種殺菌劑都最敏感，來源于昆明的喬木鏈格孢菌株8-34、碭山的喬木鏈格孢菌株9-53、成都的梨黑斑鏈格孢菌株9-1及貴陽的棉鏈格孢菌株 8-46 對嘧菌酯敏感性較差，對咪鮮胺、苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯敏感性較好。來自不同地區分屬于3個種的5株梨黑斑病菌對苯醚甲環唑均有較好敏感性，EC50值為0.093 0～0.899 9 mg/L，與付余波等的報道［24］一致。各菌株對不同藥劑的敏感性差異可能與菌株的遺傳背景和當地的歷史用藥有關。該研究結果可為梨黑板病菌的分離鑒定和藥劑的科學選擇提供試驗依據，對4個梨產區黑斑病的防治具有一定的指導意義。

參考文獻：

［1］劉亞慧，戴德江，沈? 瑤，等. 梨黑斑病菌抗藥性檢測及其對啶酰菌胺的敏感性基線［J］. 農藥學學報，2015，17（3）：274-278.

［2］Baudry A. First report of Japanese pear black spot caused by Alternaria kikuchianain in France［J］. Plant Disease，1993（4），77：428B.

［3］Simmons E G. Alternaria：an identification manual［M］. The Netherlands：CBS Fungal Biodiversity Centre Utrecht，2007：1-780.

［4］Yu S H. Korean species of Alternaria and Stemphylium［M］. Suwon：National Institute of Agricultural Science and Technology，2001.

［5］Simmons E. Alternaria themes and variations（63-72）［J］. Mycotaxon，1993（48）：91-107.

［6］張志銘，宋? 福，孫淑貞，等. 河北鴨梨黑斑病病原菌的鑒定［J］. 植物檢疫，2003，17（4）：212-214，258.

［7］張天宇. 中國真菌志：第十六卷? 鏈格孢屬［M］. 北京：科學出版社，2003：1-281.

［8］宋? 博，朱曉鋒，徐兵強，等. 庫爾勒香梨果萼黑斑病病原鑒定及其ITS、GPD和EF-1α序列分析［J］. 園藝學報，2016，43（2）：329-336.

［9］常有宏，劉永鋒，王? 宏，等. 梨黑斑病病菌的致病條件［J］. 江蘇農業學報，2008，24（3）：316-320.

［10］劉新偉，陳? 巖，宋? 福，等. 我國梨和部分國外梨果實上鏈格孢菌的鑒定研究［J］. 植物檢疫，2009，23（5）：1-5.

［11］Roberts R G. Alternaria yaliinficiens sp.nov. on Ya Li pear fruit：from interception to identification［J］. Plant Disease，2005，89（2）：134-145.

［12］Roberts R G. Two new species of Alternaria from pear fruit［J］. Mycotaxon，2007，100：159-167.

［13］White T J，Bruns T D，Lee S B，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//PCR protocols.New York：Academic Press Inc.，1990：315-322.

［14］Lawrence D P，Gannibal P B，Peever T L，et al. The sections of Alternaria：formalizing species-group concepts［J］. Mycologia，2013，105（3）：530-546.

［15］Hong S G，Cramer R A，Lawrence C B，et al. Alt a1 allergen homologs from Alternaria and related taxa：analysis of phylogenetic content and secondary structure［J］. Fungal Genetics and Biology，2005，42（2）：119-129.

［16］Peever T L，Su G，Carpenter-Boggs L，et al. Molecular systematics of citrus-associated Alternaria species［J］. Mycologia，2004，96（1）：119-134.

［17］Berbee M L，Pirseyedi M，Hubbard S. Cochliobolus phylogenetics and the origin of known，highly virulent pathogens，inferred from ITS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene sequences［J］. Mycologia，1999，91（6）：964-977.

［18］宋? 聰，宋水山，關軍鋒. 梨采后黑斑病拮抗菌J18的鑒定及防治效果的初步研究［J］. 現代食品科技，2011，27（1）：6-10，25.

［19］田雪蓮，尹顯慧，李榮玉，等. 幾種殺菌劑對番茄枯萎病的毒力及田間防效［J］. 農藥，2015，54（2）：143-145，149.

［20］付余波. 我國四省區梨主要病害的病原鑒定、分子檢測與藥劑篩選研究［D］. 南京：南京農業大學，2010：1-81.

［21］Rotem J. The genus Alternaria：biology，epidemiology，and pathogenicity［M］. St Paul，Minnesota：American Phytopathological Society Press，1998.

［22］Andrew M，Peever T L，Pryor B M. An expanded multilocus phylogeny does not resolve morphological species within the small-spored Altemrnaria species complex［J］. Mycologia，2009，101（1）：95-109.

［23］Woudenberg J H C，Truter M，Groenewald J Z，et al. Large-spored Alternaria pathogens in section Porri disentangled［J］. Studies in Mycology，2014，79：1-47.

［24］付余波，錢國良，胡白石，等. 21種殺菌劑對梨炭疽病菌、輪紋病菌、黑斑病菌的室內毒力測定［J］. 江蘇農業科學，2011，39（2）：178-180.