甘草多糖對雞肉品質及其相關候選基因表達的影響

楊又兵　錢凱鳳　盧小寧　婁然　劉永建　任旭鴿　游祥賓　李淦　徐志謙　雷瑩　白俊艷

摘要：為探究甘草多糖對雞肉品質的影響，設計不同水平的甘草多糖添加至日糧中，測定愛拔益加肉雞的肉質性狀和相關基因在肉質中的含量，以此來研究日糧中添加不同水平甘草多糖對其肉質的影響情況；并利用轉錄組測序技術（RNA-SEQ）分析了日糧中添加不同水平甘草多糖飼喂的肉雞胸肌組織樣品的轉錄組，從而篩選出能夠調控肉質性狀的關鍵基因，并利用實時熒光定量PCR技術進行驗證。結果表明，在日糧中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖的試驗組雞的胸肌的肉質指標肉色、pH1、pH24、蒸煮損失和滴定損失與對照組均無顯著差異（P>0.05），但發現隨著日糧甘草多糖的增加，雞的肉質指標有著不同程度的改善。在日糧中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了雞胸肌中LPL基因、PPARγ基因、FABP3基因、CAST基因的相對表達量，在日糧中添加300、600 mg/kg甘草多糖降低了雞胸肌中CAPN2基因的相對表達量；在日糧中添加900 mg/kg甘草多糖降低了LPL基因、PPARγ基因、FABP3基因、CAST基因的相對表達量。

關鍵詞：甘草多糖；肉質性狀；LPL基因；PPARγ基因；CAST基因

中圖分類號：S831.5文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0219-07

近年來，甘草多糖這種活性成分受到許多學者的關注。甘草多糖具有多種生物學功能，如可增強機體免疫力、促進生長發育、抗病毒等，在畜牧業上有廣闊的應用前景。然而，目前國內外有關甘草多糖在雞上的研究寥寥可數，且飼料中合適的添加量沒有明確標準，作為飼料添加劑還不能廣泛應用［1］。

肉質性能是影響養肉雞生產經濟效益的關鍵因素，但雞肉的肉質性能很低，現階段對肉雞肉品質的研究主要還是在常規的肉品質上。目前，氨基酸和核苷酸是影響肉類及肉制品鮮味的2種重要因素，其中，肌苷酸又是影響核苷酸中鮮味最重要的成分。肌苷酸存在于肌肉中，與肉質鮮味的生成有密切關聯［2］。一些研究表明，肌苷酸是影響畜禽肉質鮮味的重要物質，是衡量肉質鮮味的重要指標［3］。國內外學者的大量研究也表明，肌苷酸是影響肉質鮮味特性的關鍵性物質［4］。通過對肉雞肌肉中常規肉品質和風味物質的研究，可為應激管理及應激性家禽生長代謝障礙的精準營養元素調控提供新的思路和方法。

對于甘草多糖免疫功能的研究較多，甘草多糖對動物肉質的影響研究較少，對雞肉品質的影響鮮有研究，本試驗設計不同水平的甘草多糖添加于日糧中，測定愛拔益加肉雞的肉質性狀和影響肉質相關基因的表達量，以此來研究日糧中添加不同水平的甘草多糖對肉質性狀的影響情況，并利用RNA-SEQ分析了日糧中添加甘草多糖飼喂的肉雞胸肌組織樣品的轉錄組，從而篩選調控肉雞肉質的關鍵基因，并利用實時熒光定量PCR技術進行驗證，為愛拔益加肉雞甘草多糖的最適添加量及影響肉質性狀的基因提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

240羽1日齡健康愛拔益加肉雞，采購于洛陽某市場；總RNA反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、SYBR GreenⅡRNA染料、DL 2 000 bp maker、RNAiso Plus、固相Rnase清除劑、6×DNA Loading Buffer、2×Taq PCR MasterMix、Trziol、乙醇、異丙醇，均購自北京寶日醫生物技術有限公司；冷凍高速離心機和Nano Drop 2000C超微量分光光度計，購于武漢塞維爾公司；凝膠成像儀和熒光定量PCR儀，均購于孚約生物科技（上海）有限公司。

1.2 引物設計與合成

參考NCBI數據庫中愛拔益加肉雞同源序列信息，采用Primer 5.0設計引物（表1），送往武漢生物工程有限公司合成。

1.3 試驗方法

2021年6月在河南科技大學動物房進行試驗，將240羽1日齡健康的愛拔益加肉雞，采用抽簽法隨機分為4組，每組6個重復，每個重復10羽雞。分別在基礎日糧中添加0、300、600、900 mg/kg甘草多糖依次設為對照組，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的飼糧，試驗期42 d。

1.3.1 樣品采集

試驗雞飼養至42日齡結束，每重復隨機選2羽雞，宰前禁食12 h，并提供足夠的飲用水。屠宰時采用手術剪剪開體腔，并緩緩分離出左側胸肌，一部分胸肌置于4 ℃用于測定肉質性狀（肉色、pH值、蒸煮損失、滴水損失），一部分置于液氮中冷凍保存，后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.2 肉質性能的測定

1.3.2.1 肉色的測定 取各組屠宰雞的胸肌，采用比色板法，將肉樣與標準肉色譜對照、評分。避免在陽光直射下或在室內陰暗處評定。評分標準為 1～7分，兩級間允許評0.5分。每份樣品測3個點，取其平均值。

1.3.2.2 肌肉pH值的測定 拿各組宰殺后停止呼吸后45 min已經采集好的胸肌樣品，采用酸度計測定pH值，記作pH1；在4 ℃條件下，冷卻保存24 h后測定pH值，記作pH24。每組測定3次，取其平均值。

1.3.2.3 蒸煮損失的測定 取各組已采集好的胸肌樣品，去除肌外膜、脂肪后，稱重Z1（30～50 g）。將肉樣采用細繩綁住懸空吊于80 ℃水浴鍋中保持30 min，細線另一端用透明膠帶固定。30 min 后將肉塊取出，在陰涼通風環境下放置 20 min，稱重Z2。

蒸煮損失=（Z1-Z2）/Z1。

1.3.2.4 滴水損失的測定 取各組胸肌樣品，去除肌外膜、脂肪后，稱重D1（10～20 g）。放入滴水損失測定管置于0～4 ℃冰箱內24 h。24 h后，采用電子天平稱取各肉塊重D2，記錄數據并計算。

滴水損失=（D1-D2）/D1。

1.3.3 總RNA提取

提取RNA，于超凈工作臺內操作，提前采用紫外光燈照射超凈工作臺約30 min，再使用1%固相RNase清除劑噴灑滅菌，采用吸水紙擦干，采用Trizol試劑盒提取胸肌組織總RNA，稀釋完成后，取1 μL放至超微量分光光度計中檢測RNA濃度，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的質量。

1.3.4 總RNA反轉錄cDNA

使用反轉錄試劑盒合成cDNA第1步反應條件是：總RNA 1 μL、gDNA Eraser 1 μL、5gDNA Eraser Buffer 2 μL，補RNase Free dH2O至10 μL，42 ℃ 2 min。第2步的反應條件是：步驟1的反應液 10 μL、RT Primer Mix 1 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 4 μL、RNase Free dH2O 4 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，產物置于-20 ℃保存。

1.3.5 實時熒光定量 PCR

熒光定量的每個樣品均需要設置平行重復，該試驗設置3次重復，保證每次重復所有條件均一致。qPCR反應所需試劑，由表2可知，熒光定量PCR反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40個循環；熔解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃? 15 s，95 ℃ 15 s。

1.3.6 熒光定量結果計算分析

采用2-ΔΔCT 法計算雞肉質相關候選基因的相對表達量，以GAPDH基因作為內參進行標準化，所得試驗數據運用軟件SPSS 25進行分析，并利用軟件Graphpad Prism 9.3作圖。

2 結果與分析

2.1 不同甘草多糖水平對愛益拔加雞肉品質的影響

由表3可知，在日糧中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖的試驗組雞的胸肌肉質指標肉色、pH1、pH24、蒸煮損失和滴定損失與對照組均無顯著差異（P>0.05），但觀察發現隨著日糧甘草多糖的增加，雞的肉質指標有著不同程度的改善。

2.2 總RNA的質量檢測

經Nano Drop 2 000 C超微量分光光度計檢測，提取的總RNA濃度均在2.0～3.5 μg/μL，D260 nm/280 nm≥1.9，D260 nm/230 nm均約為2.2，表明肉雞總RNA無明顯降解，無明顯的蛋白質、DNA及酚等其他物質的污染；1%瓊脂糖凝膠檢測，由圖1可知，RNA條帶清晰明亮，表明所提取的總RNA質量良好。綜上，提取的肉雞總RNA可用于后續試驗。

2.3 熒光定量 PCR 熔解曲線

由圖2可知，其中，A、B、C、D、E、F、G分別對應GAPDH基因、LPL、PPARγ、FABP3、CAPN2、CAST和UCP3基因的熔解曲線，發現目的基因及內參基因的擴增曲線整體平滑，且出現了“S”形的曲線， 比較符合預期。擴增曲線出現的曲線拐點較為明顯，且平臺期的曲線穩定平滑，無上升趨勢。通過觀察熔解曲線上的拐點，發現目的基因和內參基因的擴增產物Tm值均一，熔解曲線上僅出現1個明顯的單一峰，表明在PCR過程中，所采集的信號均來自于特異性擴增產物。

2.4 雞肉質相關候選基因表達規律分析

2.4.1 LPL基因 mRNA 的表達分析

由圖3可知， 日糧中添加300、 600 mg/kg甘草多糖均增加了雞胸肌中LPL基因相對表達量。日糧中添加600、900 mg/kg甘草多糖LPL基因的相對表達水平差異顯著（P<0.05）。隨著日糧中甘草多糖量的增加，LPL基因的相對表達量先增再降，當添加量為 600 mg/kg 時，基因相對表達水平最高。

2.4.2 PPARγ基因mRNA的表達分析

由圖4可知，日糧中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了雞胸肌中PPARγ基因相對表達量。日糧中添加600、900 mg/kg甘草多糖PPARγ基因的相對表達水平差異顯著（P<0.05）。隨著日糧中甘草多糖量的增加，PPARγ基因的相對表達量先增加再降低，當添加量為600 mg/kg時，基因相對表達水平最高。

2.4.3 FABP3基因mRNA的表達分析

由圖5可知，日糧中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖增加了雞胸肌中FABP3基因相對表達量，隨著日糧中甘草多糖量的增加，FABP3基因的相對表達量先增加后降低。日糧中添加0與600 mg/kg甘草多糖FABP3基因的相對表達水平差異顯著（P<0.05）。添加量為600 mg/kg時，FABP3基因表達水平相對最高。

2.4.4 CAPN2基因mRNA的表達分析

由圖6可知，日糧中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖均降低了雞胸肌中CAPN2基因相對表達量，隨著日糧中甘草多糖量的增加，CAPN2基因的相對表達量先降低再增加。日糧中添加0、600 mg/kg 甘草多糖CAPN2基因的相對表達水平差異顯著（P<0.05）。日糧中添加甘草多糖可降低基因的表達，當添加量為600 mg/kg時，CAPN2基因表達水平相對最低。

2.4.5 CAST基因mRNA的表達分析

由圖7可知，日糧中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖增加了雞胸肌中CAST基因相對表達量，隨著日糧中甘草多糖量的增加，CAST基因的相對表達量先增加后降低。日糧中添加0與600 mg/kg甘草多糖CAST基因的相對表達水平差異顯著（P<0.05），當添加量為600 mg/kg時基因表達水平相對最高。

2.4.6 UCP3基因mRNA的表達分析

由圖8可知，日糧中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖降低了雞胸肌中UCP3基因相對表達量，隨著日糧中甘草多糖量的增加，UCP3基因的相對表達量也在降低。日糧中添加甘草多糖可降低UCP3基因的表達量，隨著甘草多糖量的增加，基因表達水平先降低后升高。日糧中添加0與600 mg/kg甘草多糖UCP3基因的相對表達水平差異顯著（P<0.05），在添加量600 mg/kg時，基因表達水平達最低。

3 討論

3.1 肉雞LPL基因的表達規律分析

脂蛋白酯酶（LPL）是脂肪代謝的關鍵酶，它能夠催化和水解甘油三酯，生成脂肪酸和甘油，提供給機體的各組織利用和儲存［5］。Griffin等的研究表明，肉雞LPL基因的表達影響雞脂肪代謝，認為可將LPL基因作為脂肪調節的候選基因［6］。為進一步研究兩者間的相關性，一些研究者對其做了深入研究，王晶研究發現，隨日齡增長，廣西三黃雞和AA雞胸/腿肌的LPL酶活性逐漸升高，且肌內脂肪含量也隨之增加，兩者間呈正相關［7］。王斌等研究同樣發現，淮南麻黃雞的胸肌和腿肌脂肪含量與LPL基因表達量呈顯著正相關［8-9］

本試驗在日糧中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了雞胸肌中LPL基因相對表達量，900 mg/kg降低，說明在一定范圍內甘草多糖添加量與LPL基因表達水平呈正相關，與前人研究結果一致。

3.2 肉雞PPARγ基因的表達規律分析

PPARs能夠調控許多細胞內的代謝過程，在已發現的3種亞型中，PPARγ與脂肪細胞的增殖分化有密切的聯系。杜琛等通過構建絨山羊shRNA-PPARγ慢病毒載體試驗，研究發現沉默PPARγ基因后，脂肪細胞分化受到顯著影響［10］。白曉蘇等研究同樣發現，在3T3-L1脂肪細胞分化過程中PPARγ表達增加［11］。本試驗在日糧中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了雞胸肌中PPARγ基因相對表達量，900 mg/kg降低，說明在一定范圍內甘草多糖添加量與PPARγ基因表達水平呈正相關。

3.3 肉雞FABP3基因的表達規律分析

脂肪酸結合蛋白（FABPs）主要存在于動物細胞質中，它在動物體內脂肪的合成與降解中扮演重要角色，在脂肪轉運過程中發揮著重要作用［12］。此外，畜禽FABP3基因還能通過影響肌內脂肪的含量，進而影響肌肉嫩度和風味水平，是影響肉質性狀的關鍵候選基因［13］。本試驗在日糧中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了雞胸肌中FABP3基因相對表達量，900 mg/kg降低說明在一定范圍內甘草多糖添加量與FABP3基因表達水平呈正相關。

3.4 肉雞CAPN2基因的表達規律分析

CAPN1和CAPN2的表達量均與肌原纖維水解有著密切聯系，在畜禽肉的嫩化發揮著關鍵性作用［14］。目前，國內外有關CAPN2基因的研究還較少。本試驗在日糧中添加300、600、900 mg/kg水平的甘草多糖可降低雞胸肌中CAPN2基因相對表達量，甘草多糖添加量與CAPN2基因表達水平呈負相關。

3.5 肉雞CAST基因的表達規律分析

CAST基因不僅調控肌肉中蛋白質新陳代謝過程，還影響畜禽肉品質的嫩度，是作為影響肉質性狀的關鍵候選基因［15］。目前，CAST基因作為嫩度候選基因主要在豬、牛、羊上研究較多，而在雞上的研究寥寥可數。本試驗在日糧中添加300、600 mg/kg 甘草多糖均增加了雞胸肌中CAST基因相對表達量，900 mg/kg降低，說明在一定范圍內甘草多糖添加量與CAST基因表達水平呈正相關。

3.6 肉雞UCP3基因的表達規律分析

張繼等研究UCP2和UCP3基因表達對豬肉質的影響中發現，在豬的背最長肌和腰大肌中，UCP2表達量的增加不利于肌肉內脂肪沉積，降低肉的品質，UCP3對肉質的關聯則與UCP2相反［16-17］。由此推測，肉雞UCP3基因可能也影響著肉雞的脂肪代謝，可能UCP3表達量的增加或減少影響雞肉的肌內脂肪沉積，并影響雞的肉品質。本試驗從研究甘草多糖對肉雞肉質的影響，結合研究甘草多糖對肉雞肉質相關基因UCP3基因表達的影響，來驗證和推測甘草多糖對肉雞作用、肉雞UCP3基因及肉品質的相關性，結合甘草多糖對肉質影響結果和甘草多糖對肉雞UCP3基因的表達影響結果，觀察推測甘草多糖可能影響雞的脂肪代謝。

4 結論

本試驗通過在日糧中分別添加0、300、600、900 mg/kg 甘草多糖，測定愛拔益加肉雞的肉質指標肉色、pH1、pH24、蒸煮損失和滴定損失及肉質相關基因表達量，通過對比4種甘草多糖水平組的肉質指標，得到4種甘草多糖水平組的差異均不顯著，但以600 mg/kg甘草多糖水平的肉質指標最好。通過對比4種甘草多糖水平組的基因表達量，得到 600 mg/kg 甘草多糖組的LPL、PPARγ、FABP3和CAST基因表達量顯著高于對照組（P<0.01）；600 mg/kg 甘草多糖組的CAPN2、UCP3基因表達量顯著低于對照組（P<0.01）。600 mg/kg甘草多糖對雞肉質指標和肉質相關基因表達的影響最顯著。通過向日糧中添加不同水平的甘草多糖，探究愛拔益加肉雞肉質性狀和相關基因的表達情況，期望為以后肉雞肉品質和候選基因的研究提供理論基礎。

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收稿日期：2023-05-09

基金項目：河南省科技攻關項目（編號：222102110477）；河南省高校國家級大學生創新創業訓練計劃重點支持領域項目（編號：202210464064）。

作者簡介：楊又兵（1977—），男，湖北黃岡人，博士，副教授，研究方向為動物遺傳育種和動物遺傳資源保護與開發利用。E-mail：yangyoubing@sina.com。

通信作者：白俊艷，博士，教授，研究方向為動物分子育種。E-mail：junyanbai@163.com。