廣西規模水禽養殖場鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

陳曉玉　譚奕舟　莫智杰　胡靜　李軍　李常挺　白慧麗　王樂平　馬春霞　尹楊燕　彭昊　廖玉英

摘要：為了解廣西地區規模化水禽養殖場鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）的流行血清型、耐藥情況及遺傳關系，從廣西南寧、貴港等地規模化水禽養殖場中臨床上疑似感染RA的病死鴨、鵝體內得到5株分離菌，對分離菌進行鑒定，檢測其毒力基因，通過多重PCR檢測方法鑒定血清型，并對其進行耐藥性分析。經試驗得到鑒定結果，RA分離菌株在血瓊脂培養基上呈平滑圓潤、露滴樣，圓形隆起的灰白色菌落；革蘭氏染色呈陰性短桿菌；5株分離菌經16S rRNA 鑒定均為RA，將其命名為2022NNRA01～2022NNRA05；其中，血清鑒定2022NNRA01為血清1型，其余均為血清2型。藥敏試驗結果顯示，5株RA對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻呋、大觀霉素、氟苯尼考、磺氨甲[XCZ1.tif，JZ]唑敏感，對其他抗菌藥物呈不同程度的耐藥。其中，對安普霉素、慶大霉素、卡那霉素氨基糖苷類藥物，四環素類藥物多西環素和利福霉素類藥物利福平的耐藥率為100%。本試驗經分離鑒定成功得到5株RA，且其耐藥性分析結果可為廣西地區RA疾病的疫苗免疫預防選擇以及藥物治療提供依據。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；分離鑒定；血清型；毒力因子；耐藥性；廣西

中圖分類號：S852.6文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0213-06

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是一種由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的敗血癥急性病，病鴨易患纖維性心包炎、腦膜炎、肝周炎和肺泡炎［1］。該病在世界范圍內廣泛流行，主要侵害1～8周齡的雛鴨，除此之外還可感染鵝、火雞等家禽，且感染后發病率和死亡率極高，是一種對水禽業造成嚴重危害的細菌傳染病［2］。

目前，RA病菌主要研究集中于鴨源，但近年來隨著養鵝業的發展，RA的流行情況在鵝群中也有上升趨勢［2-4］。水禽養殖業在廣西養殖業中所占比例不可忽視，廣西地區常見的水禽病有RA、大腸桿菌病、禽流感、病毒性肝炎等，其中RA的發病率在逐漸上升，影響了廣西地區的鴨鵝養殖業乃至整個水禽業的經濟效益，且大部分的調查研究均停留在臨床病例報告，未系統地進行分子流行病學研究［5］，目前廣西地區鴨疫里默氏桿菌病例的流行情況報道甚少，特別是鵝源RA病株；為填補該地區RA病流行病學數據的欠缺，完善我國RA病整體防控方案，本研究對廣西地區部分水禽養殖場流行的RA分離菌進行分離鑒定，并采用血清1型、2型和11型RA多重PCR鑒定方法［6］鑒定分離菌的血清型，對其耐藥性及遺傳關系進行研究，為當地開展針對性的疫苗免疫及臨床用藥選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本

病料樣品來源于2021—2022年廣西壯族自治區南寧市、貴港市規模化水禽養殖場。病禽咳嗽、體型瘦小、精神狀態差、不愿走動、毛色無光澤，解剖病死鴨鵝有較嚴重的包肝、包心；采集病死鴨鵝的腦、肝和心等組織，收集的組織樣本共28份（表1），于-80 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑與儀器

本試驗所用試劑與儀器的主要信息見表2、表3。

1.1.3 引物合成

多重PCR鑒定鴨疫里默氏桿菌血清型引物參考專利［6］合成，引物信息見表4；鴨疫里默氏桿菌毒力基因鑒定引物信息見表5，均由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與培養

無菌環境中，采集病死鴨鵝的腦、內臟組織，將其接種于鮮血瓊脂培養基，再將其放置于厭氧罐中， 37 ℃恒溫培養 24～36 h，觀察培養病原菌的形態特征，挑取符合要求的單菌落進行培養。

1.2.2 形態鑒定

挑取純化后的單個待檢菌落，按革蘭氏染色操作說明書進行染色，于光學顯微鏡下觀察，鑒定其形態特征。

1.2.3 16S rRNA分子生物學鑒定

取純化的細菌培養液12 000 r/min 離心1 min，去上清液后提取RA病菌的基因組DNA。通用引物序列（表4）進行PCR擴增，PCR反應體系50 μL（表6），PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s，34個循環；72 ℃延伸10 min，擴增結果大小為1 450 bp。

將陽性產物送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序后得到測序結果，在NCBI［BLAST：Basic Local Alignment Search Tool （nih.gov）］上進行比對分析，根據序列間同源性差異，采用MEGAX軟件構建遺傳進化樹，分析并確定分離菌株的類別。

1.2.4 血清型鑒定

參照文獻［6］，通過多重PCR檢測方法鑒定血清型，特異性擴增RA血清1型、2型和11型引物，所用引物信息見表4，實現對RA血清1型、2型和11型的鑒定。PCR反應體系見表6。PCR反應條件：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，57.9 ℃ 30 s退火，72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃延伸10 min［6］。

1.2.5 毒力基因檢測

參照試劑盒說明書提取RA病菌的基因組DNA，PCR擴增RA毒力基因OmpA、CAMP、wza、AS87_04050、Fur、SIP、TbdR1和luxE，所用引物信息見表5。

1.2.6 細菌藥敏試驗

采用K-B紙片法對5株菌株進行抗生素藥物的敏感試驗。無菌操作下，將RA均勻涂布于血瓊脂平板上，貼上藥敏紙片；置于厭氧罐中，37 ℃培養24 h后，測量抑菌圈直徑。根據抑菌圈直徑判斷RA對各種藥物的敏感度，參照美國臨床實驗室標準化委員會抗微生物藥物敏感試驗標準。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離培養

由圖1可知，從多個規模水禽養殖場病死鴨、鵝組織樣本上分離得到5株菌株；5株菌株均在鮮血瓊脂平板上形成平滑圓潤、露滴樣的圓形隆起灰白色菌落。

2.2 鑒定結果

2.2.1 形態鑒定

由圖2可知，對5株分離的RA進行革蘭氏染色，鏡檢為陰性，單個或成雙排列，形態多為短桿狀，少數呈橢圓形狀。

2.2.2 16S rRNA分子生物學鑒定

由圖3可知，5株分離的RA菌株PCR擴增后，獲得大小約1 450 bp目的條帶，得到5株RA的基因序列，與NCBI上20株RA參考株進行比對，相似性≥98%。由圖4可知，2022NNRA01、2022NNRA02、2022NNRA04、2022NNRA05處于同一分支，親緣性較高，而2022NNRA03和云南分離株RA-1親緣關系較近。

2.3 血清型鑒定

經特異性多重PCR方法鑒定5株鴨疫里默氏桿菌分離株得到結果，由圖5可知，電泳圖樣本中有1 114 bp特異性鑒定條帶和269 bp條帶， 則為血清1型RA；有1 114 bp特異性鑒定條帶和671 bp條帶，則為血清2型RA；有1 114 bp特異性鑒定條帶和510 bp條帶，則為血清11型RA［6］。

血清鑒定結果表明，2022NNRA01為血清1型，2022NNRA02、2022NNRA03、2022NNRA04、2022NNRA05為血清11型。其中，血清1型占比20%，血清11型占比80%。

2.4 毒力基因檢測

由圖6可知，5株分離菌經過PCR擴增毒力基因特異性片段，2022NNRA01～2022NNRA05均含毒力基因OmpA（663 bp）、wza（939 bp）、luxE（999 bp），5株分離菌均未擴增出AS87_04050毒力基因條帶，2022NNRA02、2022NNRA03、2022NNRA04未擴增出CAMP、Fur、SIP、TbdR1毒力基因條帶。

2.5 藥敏試驗

由表7可知，本試驗分離得到的5株RA對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻呋、大觀霉素、氟苯尼考和磺氨甲[XCZ1.tif；%120%120，JZ]唑8種抗菌藥物敏感，對其他7種抗菌藥物呈不同程度的耐藥。其中，對安普霉素、慶大霉素、卡那霉素氨基糖苷類藥物，環丙沙星、恩諾沙星喹諾酮類藥物，四環素類藥物多西環素和利福霉素類藥物利福平均表現出高度耐藥。

3 討論

本研究分離得到的5株RA中，1株分離自病死鵝，RA是當前危害養鵝業的重要傳染病之一，雛鵝感染后發病率極高，病死率在10%～40%，最高可達90%［7］，10周齡時仍能感染發病，種鵝和成年鵝不易感染。本研究收集不同水禽養殖場發病鴨、鵝的病料，發病雛鵝生活環境較差，雛鵝群在舍內平地圈養，保溫設施少、通風差、氨氣重，雛鵝群于約15日齡出現發病死亡的嚴重情況，養鵝場應當密切關注并重視RA病菌的預防，改善鵝場的飼養條件，加強鵝場通風和保濕，在鵝的免疫計劃中也應考慮到對RA病菌的免疫。

5株菌均從病樣的腦部分離得到，有研究發現病禽感染鴨疫里默氏桿菌后，腦組織神經細胞變大，這與腦部神經細胞受損有關［8］。通過分析分離菌的遺傳進化關系發現， 分離自南寧地區的4株鴨疫里默氏桿菌之間的親緣關系最近，貴港分離株2022NNRA03和同處于西南地區的云南分離株RA-1親緣關系較近，說明病菌的流行可能和種鴨種鵝的貿易、運輸有關，因此該病的檢疫工作應引起重視；2022NNRA01與2022NNRA05親緣關系較近，但分別來自于鴨源和鵝源，可能存在鴨、鵝混合感染的情況，因此鵝養殖地要遠離鴨舍、雞舍，避免雞、鴨、鵝混養。長期以來在養殖生產中，針對RA病菌是采用疫苗免疫預防、藥物治療相結合的方法進行防控，而效果并不理想。一方面，RA病菌在自然界血清型眾多，至少擁有21個血清型，且不同血清型間無交叉免疫保護作用［9］；另一方面，當前市面上銷售的滅活疫苗并未覆蓋所有血清型，這使得疫苗的免疫作用受到限制。

目前，鴨疫里氏桿菌在全國范圍內流行，其中廣東地區RA以1型為優勢血清型，2、3、4、8、10、15也均有流行［10-12］；貴州省養鴨業的重點養殖基地三穗地區以2型為主要流行血清型，11型也有流行［13-14］；福建省血清型為2型和11型所占比例最高［15］。血清1、2、10、11型在廣西桂林地區均有流行，以1型最為多發，百色市分離菌株血清型全為1型［16-17］。本研究采用血清1型、2型和11型RA病菌多重PCR鑒定［6］，5株分離株以血清11型所占比例最高。該方法實現對RA病菌血清1型、2型和11型的精確、簡便、穩定、高特異和高靈敏性檢測，和常規鑒定方法不同，此檢測方法降低了勞動成本，成本相對較低，前景好。分析以往廣西地區所報道的RA病菌的流行情況，血清型11型可能在南寧的流行趨勢相較往年有所上升，該調查有助于了解該地區RA的優勢血清型，為進一步選擇相應的疫苗提供依據。

RA病菌的致病機理研究發展十分緩慢，本試驗中的5株分離菌均含毒力基因OmpA、wza、luxE，但均不含AS87_04050。膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分，參與物質跨膜運輸、傳導信號、合成能量物質等生命過程［18］。本試驗證明，5株基因的表達情況影響RA的感染能力，從而影響宿主對入侵細菌的免疫情況。OmpA為外膜蛋白的主要蛋白，Hu等通過試驗評價RA病菌OmpA缺失株Th4ΔOmpA的毒力，結果顯示，Th4ΔOmpA的黏附、侵襲能力及對雛禽的致病性明顯減弱，證明OmpA參與RA的黏附過程，OmpA基因缺失株Th4ΔOmpA對10日齡櫻桃谷鴨致病力大幅度減少，是一種重要的毒力因子［19］。袁彪研究發現，wza基因與莢膜的形成有關，wza基因的缺失導致鴨疫里默氏桿菌生物膜形成能力增加以及表面疏水性升高，RA CH-1Δwza毒力約下降421倍［20］。岳嘉蘋研究發現，luxE基因缺失株Yb2ΔluxE對Vero細胞的黏附侵襲能力均較親本株顯著降低，進而導致細菌的入侵力減弱，該基因缺失后導致鴨疫里默氏桿菌脂蛋白酰化缺陷，致病力相較野生株Yb2顯著下降［21］。在本試驗5株分離株的檢測中，均未出現AS87_04050基因的目的條帶；AS87_04050基因與細菌脂多糖的合成和致病性有關，王小蘭通過轉座子插入誘變技術構建AS87_04050基因缺失株RA2640，研究發現基因缺失株RA2640合成細菌脂多糖受阻，進而感染過程受阻，且毒力下降10萬倍以上［22］。

另外，由于在飼養和臨床治療中長期連續使用或不規范使用抗生素，導致RA的耐藥譜越來越廣。研究表明，不同地區分離的RA病菌對抗生素的敏感程度不同［23］。本研究調查采樣的養殖場常使用安普霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環素、磺胺嘧啶等藥物，藥敏試驗結果顯示，5株RA分離菌多重耐藥，對臨床常見抗菌素均呈不同程度的耐藥性，其中，對上述常見抗生素的耐藥率為100%。因此，在臨床上選擇藥物治療時，應當先檢測病菌對抗生素敏感性，為廣西藥物RA疾病治療提供試驗依據，合理使用抗生素，盡最大可能避免藥物的不當使用，控制鴨疫里默氏桿菌出現多重耐藥性的發展態勢。

4 結論

本研究從廣西壯族自治區部分地區的幾個規模水禽養殖場中多羽具有典型臨床癥狀的病死鴨、鵝腦組織上分離得到5株鴨疫里默氏桿菌，經分離純化后通過菌落形態鑒定及分子生物學鑒定，確定5株分離菌均為鴨疫里默氏桿菌，說明該菌在廣西地區鴨群、鵝群中有流行的趨勢。其中，4株為血清11型，1株為血清1型。藥敏試驗結果表明，5株鴨疫里默氏桿菌均出現多重耐藥性，但對青霉素類藥物青霉素、氨芐西林、阿莫西林，頭孢菌素類藥物頭孢氨芐、頭孢噻呋和酰氨醇類藥物氟苯尼考及氨基糖苷類藥物大觀霉素敏感。本研究結果可為廣西地區RA疾病的疫苗免疫預防的選擇、藥物治療提供依據。

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收稿日期：2023-07-11

基金項目：廣西重點研發計劃（編號：AB21238003、AB21220005-4）；國家水禽產業技術體系建設專項（編號：CARS-42）；廣西獸醫研究所基本科研業務費（編號：桂科專項22-6、桂科專項23-5）；廣西農業農村廳科技項目（編號：Z202218、Z202219）；廣西南寧市良慶區重大科技專項（編號：202118）；廣西防城港市重點研發計劃（編號：AB21014016、AB20014028）；廣西桂林市重點研發計劃（編號：20220136-5）；廣西南寧市武鳴區重點研發計劃（編號：20210102）；廣西南寧市江南區重點研發計劃（編號：20220620-2）；廣西南寧市青秀區重點研發計劃（編號：2022004）。

作者簡介：陳曉玉（2000—），女，黑龍江賓縣人，碩士研究生，主要從事獸醫藥理病理研究。E-mail：cxy13766902977@163.com。

通信作者：彭 昊，博士，高級獸醫師，主要從事動物疫病防控與病原分子生物學研究，E-mail：hpeng2006@163.com；廖玉英，研究員，主要從事畜禽生態養殖研究，E-mail：315951610@qq.com。