CNV-seq應用于產前診斷及流產物檢測意外發現DMD基因變異臨床分析

［收稿日期］2023-06-26

［基金項目］國家自然科學基金（82201865）；陜西省重點研發計劃項目（2023-YBSF-305）；西北婦女兒童醫院院內科研項目（2020ZD03）

［作者簡介］吳秋華（1984—），女，主管技師，主要從事遺傳檢驗相關研究。

［通訊作者］強" 榮，主任醫師。

［摘" 要］目的" 探討全基因組拷貝數變異測序技術（CNV-seq）應用在產前診斷及流產物檢測中發現Duchenne型肌營養不良癥（DMD）的重要價值。方法" 本研究使用CNV-seq技術對2019年9月至2020年7月來西北婦女兒童醫院進行產前診斷的羊水樣本和流產胎兒樣本共784例進行檢測，對DMD基因變異樣本進一步采用多重連接依賴性探針擴增（MLPA）方法進行驗證。結果" 本研究意外發現3例樣本存在DMD基因的缺失或重復，同時MLPA驗證了這些突變。3例均為女胎，胎兒1為DMD基因64-79號外顯子重復，胎兒2為DMD基因1-7號外顯子重復，這兩例羊水樣本的變異為新發突變；流產胎兒3的變異遺傳自母親，母親檢測為DMD基因45-51號外顯子缺失。結論" CNV-seq技術應用于產前診斷及流產物不僅能檢測染色體片段缺失或重復，還有助于發現基因重復或缺失所致的單基因疾病，提高了染色體及基因異常疾病的檢出率，從而為臨床診斷和遺傳咨詢提供更全面的理論依據。

［關鍵詞］全基因組拷貝數變異測序技術；Duchenne型肌營養不良癥；產前診斷；流產物

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.06.012

［中圖分類號］R173""" ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）06-0075-08

Clinical analysis of accidental discovery of DMD gene variations

in prenatal diagnosis and detection of abortus by CNV-seq

WU Qiuhua，SHI Fengrui，WANG Rui，LIU Yuan，WANG Lin，LOU Chao，QIANG Rong

（Center of Medical Genetics，Northwest Women and Childrens Hospital，Shaanxi Xi′an 710061，China）

［Abstract］ Objective To explore important value of copy number variation sequencing （CNV-seq） technology in identifying Duchenne muscular dystrophy （DMD） in prenatal diagnosis and abortus detection. Methods The amniotic fluid and abortus samples of 784 pregnant women who received prenatal diagnosis in our hospital from September 2019 to July 2020 were examined using CNV-seq technology，and those samples with DMD gene variations were validated further by multiplex ligation-dependent probe amplification （MLPA）. Results DMD gene deletions or duplication in three samples were accidentally discovered，and they were all validated by MLPA.All three samples were female fetuses.The Fetus 1 had duplication of exons 64-79 of the DMD gene and the fetus 2 had duplication of exons 1-7 of the DMD gene.The variations of the DMD gene in the two amniotic fluid samples were De novo （novel） mutations.The variation of the DMD gene in aborted fetus 3 was deletion of exons 45-51 of the DMD gene which inherited from the mother. Conclusion Application of CNV-seq technology in prenatal diagnosis and abortus examination can not only detect deletion or duplication of chromosome segments，but also contribute to identification of monogenic diseases caused by gene duplication or deletions，which improves detection rate of chromosome or gene abnormalities，and thus provides more comprehensive theoretical basis for clinical diagnosis and genetic consultation.

［Key words］ copy number variation sequencing;Duchenne muscular dystrophy;prenatal diagnosis;abortus

Duchenne型肌營養不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由位于染色體Xp21.1的抗肌萎縮蛋白的基因（DMD基因）突變和肌營養不良蛋白缺失引起的X連鎖隱性遺傳疾病。大多數DMD患者為男性，女性一般為致病基因攜帶者，在活產男孩中的發病率約1/3 500［1］。DMD基因是人類基因組中最大的基因，其外顯子加內含子總長超過2.2Mb，編碼的肌營養不良蛋白缺乏導致肌纖維膜脆性和壞死，最終引起肌肉退行性變［2］。DMD在兒童早期表現為行走困難，在青少年時期發展為不能行走，并在成年早期導致死亡［3］。約1/3的DMD病例沒有家族史，為基因新發突變，通常在出生前無法被發現［4］。全基因組拷貝數變異測序技術（copy number variation sequencing，CNV-seq）作為近幾年新興發展的技術，與傳統核型技術相比能檢測到更多的染色體異常，然而關于該技術發現單基因疾病的報道甚少。我們通過CNV-seq檢測羊水和流產物樣本，意外發現了3例DMD基因外顯子重復或缺失病例，然后經多重連接依賴性探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）方法驗證使DMD得到了確診。

1資料與方法

1.1研究對象

本研究使用CNV-seq技術對2019年9月至2020年7月來西北婦女兒童醫院進行產前診斷的784例羊水樣本和流產胎兒樣本進行檢測，發現3例樣本存在DMD基因的缺失或重復，同時經MLPA驗證了這些突變。其中2例孕婦分別因血清學唐氏篩查異常和無創提示高風險選擇羊水穿刺產前診斷；1例孕婦因無創提示21三體高風險及B超提示胎兒嚴重異常選擇引產，進行流產胎兒CNV檢測。3例孕婦均無DMD家族史。孕婦基本情況見表1。所有孕婦均簽署書面知情同意書。

1.無創提示胎兒21三體高風險；

2.胎兒全身皮膚水腫、胸腹腔積液、雙側足內翻

流產胎兒皮膚組織

1.2 DNA提取

檢測樣本包括羊水、流產胎兒皮膚組織及孕婦的外周血。提取羊水基因組DNA和流產胎兒皮膚組織中DNA試劑盒分別為德國Qiagen公司的PureGene組織提取試劑盒、DNeasy組織試劑盒。外周血DNA由北京天根生產的血液基因組DNA試劑盒提取。為了確保結果的準確性，使用江蘇蘇州閱微公司生產的熒光標記短片段串聯重復序列（short tandem repeats，STR）復合擴增檢測試劑盒對孕婦外周血及其羊水或流產物樣本中的DNA樣品進行擴增，以分析待檢樣本中是否存在母體細胞污染。

1.3 CNV-seq檢測及分析

使用北京貝瑞和康公司提供的CNV檢測試劑盒KR0040進行文庫構建，方法參考已有文獻［5］：通過限制性內切酶水解50ng DNA，獲得平均大小為200bp的DNA片段，并通過小DNA片段末端填充、連接接頭和PCR擴增建立DNA文庫。在美國Illumina公司生產的NextSeq CN500高通量測序平臺上測定所有序列。將測序結果與人類基因組數據庫hg19進行比較。參考DGV、DECIPHER、ISCA、OMIM、ClinVar、PubMed等公共和實驗室數據庫針對≥100kb的CNVs片段進行致病性分析。

1.4 MLPA檢測及分析

DMD基因檢測試劑盒由荷蘭MRC-Holland公司生產，含有SALSA MLPA P034/P035兩個探針，可檢測DMD基因的79個外顯子是否存在缺失或者重復。檢測方法參考已有文獻［6］。使用美國Thermo Fisher Scientific公司的ABI 3500DX測序儀進行毛細管電泳，使用Coffalyser軟件（http//www.mlpa.com）用于數據分析。探針相對峰面積增加或減少30％分別提示DMD基因外顯子的重復或缺失。

2結果

2.1母源污染檢測結果

所有羊水和流產胎兒皮膚組織樣本均無肉眼可見性母血污染。經STR檢測，3例樣本中均無母源污染，可用于后續檢測。

2.2 CNV-seq及MLPA檢測結果

胎兒1：女胎，CNV-seq提示Xp21.2（30860000-31260000）×3（重復約0.40Mb），MLPA提示DMD基因64-79號外顯子重復；孕婦1 MLPA未檢測出DMD基因變異，見圖1。

胎兒2：女胎，Xp21.1（32820000-33560000）×3（重復約0.74Mb），MLPA提示DMD基因1-7號外顯子重復；孕婦2 MLPA未檢測出DMD基因變異，見圖2。

流產胎兒3：女胎，21q11.2q22.3（14300000-48129895）×3（為21-三體綜合征），Xp21.1（31760000-32000000）×1（缺失約0.24Mb），流產胎兒未做MLPA檢測；孕婦3 MLPA提示DMD基因45-51號外顯子缺失，見圖3。

注：（A1）胎兒CNV-seq：seq［hg19］Xp21.2（30860000-31260000）×3；（A2）和（A3）胎兒MLPA：DMD基因64-79號外顯子重復；（A4）和（A5）孕婦1 MLPA未見DMD基因缺失或重復。

2.3妊娠結局

孕婦1經遺傳門診咨詢和慎重考慮后選擇終止妊娠。孕婦2繼續妊娠，我們隨訪至女嬰出生后1年，體檢提示體格及智力發育正常。檢測結果及妊娠結局見表2。

3討論

3.1 DMD的研究現狀

DMD是一種致命的遺傳性肌病，至今尚無特異性治愈方法。盡管國內外報道了各種治療手段，如基因治療、細胞治療和藥物治療等，但也只能暫時減緩疾病進程［7-8］。因此在出生前及時發現并終止妊娠是阻止DMD患兒出生、降低出生缺陷率的關鍵。DMD女性攜帶者一般表型正常，沒有DMD家族史的女性一般不會主動進行DMD基因的篩查，這使得DMD患者尤其是新發病例通常在出生前無法被發現。目前產前診斷仍是防止DMD患者出生的主要手段。

3.2 CNV-seq在染色體及基因疾病診斷中的應用價值

在臨床中，可通過產前篩查并對篩查高危人群進行產前診斷來避免染色體病患兒的出生［9］。隨著高通量測序技術的不斷發展，CNV-seq已廣泛應用于臨床疾病診斷中。向萍霞等［10］提出可將CNV-seq作為高危孕婦的一線產前診斷方法，并作為羊水細胞染色體核型分析的補充診斷工具。CNV-seq可明顯提高羊水染色體嵌合體的診出率，并廣泛應用于平衡易位攜帶者的產前診斷中［11-12］。雖然CNV-seq可識別常規核型分析無法檢測到的微缺失和微復制［13］，但關于該技術發現單基因疾病的報道甚少。本研究中，3例孕婦均存在高危因素，分別為血清學篩查高風險、無創高風險及無創高風險伴B超指標異常，3例胎兒均無DMD相關指征，然而CNV-Seq卻意外檢測出了3例樣本的染色體Xp21.2或Xp21.1區域存在小片段的缺失或重復，此區域覆蓋了DMD基因的外顯子部分片段，MLPA技術驗證結果與之一致。其中流產胎兒還被檢測出21q11.2q22.3區域的重復（即21-三體綜合征）。因此，當孕婦存在產前診斷指征時及時進行羊水染色體和基因診斷，也許會有意想不到的發現。

3.3 DMD的遺傳咨詢

DMD通常影響男性，然而在極少數情況下，女性也會受到影響，約8%的女性DMD攜帶者患有肌無力和心肌病［14］。Takeshita和Chen等［15-16］報道了關于女性攜帶者患DMD的病例。本研究中孕婦1的女性胎兒Xp21.2處存在DMD基因的16個外顯子重復，重復范圍比較大，經遺傳門診咨詢和慎重考慮后，該孕婦選擇了終止妊娠。孕婦2則選擇了繼續妊娠，胎兒出生后一切正常。由于女性攜帶者的發現與咨詢對于DMD的預防非常重要，本研究對比了胎兒和其母親的DMD基因，孕婦1和孕婦2的胎兒為新發突變，考慮兩例孕婦均存在生殖腺嵌合的可能性。孕婦3為DMD攜帶者。高值等［17］提出如果女性存在生殖腺嵌合，再孕時胎兒仍有可能發生DMD基因變異。因此對于有DMD患者妊娠史或生育史的女性，即使本人未攜帶DMD基因變異，我們仍建議其再孕時選擇合適的診斷技術如CNV-seq進行DMD產前診斷。

綜上所述，CNV-seq作為近年來新興發展的技術，應用于羊水及流產物檢測有助于發現包括非整倍體在內的染色體異常，還可能檢測出意想不到的染色體片段缺失或重復所致的單基因病，提高了染色體異常疾病的檢出率，為全面評估胎兒提供理論依據，同時有助于臨床醫生給有再孕需求的不良孕產史婦女提供更好的生殖遺傳咨詢。

［參考文獻］

［1］Fortunato F，Farnè M，Ferlini A.The DMD gene and therapeutic approaches to restore dystrophin［J］.Neuromuscul Disord，2021，31（10）：1013-1020.

［2］Keegan N P.Pseudoexons of the DMD Gene［J］.J Neuromuscul Dis，2020，7（2）：77-95.

［3］Nascimento O A，Medina C J，Camacho S A，et al.Consensus on the diagnosis，treatment and follow-up of patients with Duchenne muscular dystrophy［J］.Neurologia （Engl Ed），2019，34（7）：469-481.

［4］楊李，許曉燕，朱靜，等.Duchenne肌營養不良家系臨床表型及遺傳學分析［J］.中國當代兒科雜志，2020，22（8）：867-873.

［5］馬韻翼.孕早期自然流產組織基因組拷貝數變異分析［D］.鄭州：鄭州大學，2019.

［6］徐曉昕，徐志勇，王勤，等.結合多重連接探針擴增技術與第二代測序技術建立假性肥大型肌營養不良產前診斷技術平臺［J］.中華檢驗醫學雜志，2018，41（1）：70-72.

［7］Elangkovan N，Dickson G.Gene therapy for Duchenne muscular dystrophy［J］.J Neuromuscul Dis，2021，8（s2）：S303-S316.

［8］Hanson B，Wood M J A，Roberts T C.Molecular correction of Duchenne muscular dystrophy by splice modulation and gene editing［J］.RNA Biol，2021，18（7）：1048-1062.

［9］朱若男，時盼來，趙軍紅，等.20 038例羊水染色體核型與不同產前診斷指征關系的分析［J］.中華醫學遺傳學雜志，2021，38（3）：300-302.

［10］向萍霞，劉翎，胡晞江，等.CNV-seq在高危孕婦產前診斷中的應用價值［J］.中華醫學遺傳學雜志，2023，40（1）：17-20.

［11］高明雅，柴玉瓊，王亞男.核型分析聯合CNV-seq技術在羊水染色體嵌合體檢測中的應用［J］.檢驗醫學與臨床，2022，19（15）：2082-2085，2090.

［12］屈素真，時盼來，張田園，等.CNV-seq與染色體核型分析在平衡易位攜帶者產前診斷中的應用［J］.中華醫學遺傳學雜志，2022，39（4）：366-369.

［13］Luo S，Chen X，Yan T，et al.Application of copy number variation sequencing in genetic analysis of miscarriages in early and middle pregnancy［J］.Cytogenet Genome Res，2020，160（11-12）：634-642.

［14］Silva T H D，Anequini I P，Fávero F M，et al.Functional performance and muscular strength in symptomatic female carriers of Duchenne muscular dystrophy［J］.Arq Neuropsiquiatr，2020，78（3）：143-148.

［15］Takeshita E，Minami N，Minami K，et al.Duchenne muscular dystrophy in a female with compound heterozygous contiguous exon deletions［J］.Neuromuscul Di-sord，2017，27（6）：569-573.

［16］Chen J，Zheng H，Wang Z，et al.A female carrier of a novel DMD mutation with slightly skewed X-chromosome inactivation shows a suspected case of Becker muscular dystrophy in a Chinese family［J］.Mol Genet Genomics，2021，296（3）：541-549.

［17］高值，劉莉娜，王艷麗，等.中原地區67個DMD家系產前診斷結果的分析［J］.中華醫學遺傳學雜志，2022，39（7）：669-673.

［專業責任編輯：童國慶］

［中文編輯：郭樂倩；英文編輯：楊周岐］