煙草糖苷水解酶GH3基因家族鑒定與表達分析

張貞宇 羅正飛 楊帥 顧江南 尹協 韋銀龍 聶瓊

摘要：糖苷水解酶CH3基因家族在植物的糖代謝和生長發育中起著重要作用，而煙草CH3基因家族目前尚未見相關鑒定和分析研究報道。本研究采用生物信息學方法在煙草基因組中鑒定CH3家族基因，并對其在不同組織中及逆境條件下的表達模式進行了分析。結果表明，在普通煙草K326的基因組中共鑒定出35個CH3基因，其中23個被定位在14條染色體上，存在6對共線性基因；CH3家族蛋白均為熱穩定性蛋白，其基因上游啟動子區均包含多個激素和脅迫響應元件。轉錄組數據表明，CH3家族基因大多數在煙苗莖尖高表達，少部分在根和莖中高表達，表達量受光照時間影響；煙苗受到干旱脅迫后CH3家族成員都有不同程度的響應。挑選4個NtCH3基因進行qRT-PCR分析，結果表明，NtCH3-5、NtCH3-19、NtCH3-22、NtCH3-26可能參與響應低溫以及ABA處理。這可為深入了解煙草CH3基因家族及其功能提供依據。

關鍵詞：煙草；CH3基因家族；糖苷水解酶；生物信息學分析；表達模式

中圖分類號：S572：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）04-0009-11

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經濟作物，作為嗜好類用品，香氣是評判其質量和商業價值的重要指標。研究表明，煙草中的致香成分主要以游離態和結合態兩種形式存在，結合態呈香物質沒有香氣，必須經過分解釋放出游離態呈香物質才能產生香氣。結合態潛香物質大部分是以糖苷形式存在，如己醇、苯甲醇、苯乙醇和4-羥基-a-紫羅蘭醇等。糖苷態潛香物質在常溫常壓下雖為非揮發性或半揮發性，但在陳化、加工或燃燒過程中卻能被糖苷水解酶水解釋放揮發性香氣物質，從而影響煙草產品的風味和香氣。

糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）又名糖苷酶，是指能夠水解兩個或兩個以上碳水化合物及碳水化合物和非碳水化合物之間糖苷鍵的一類酶。國際生物化學和分子生物學聯合會（IUBMB）基于底物特異性對糖苷水解酶進行命名，如a-葡萄糖苷酶、B-葡萄糖苷酶、B-木糖苷酶、a-甘露糖苷酶等。碳水化合物活性酶數據庫（Carbohydrate-Active-enZYmes Database，http：//www.CAZy.org）基于糖苷水解酶的氨基酸序列相似性及三維結構性質，將其分為135個家族。其中，糖苷水解酶3家族（GH3）是一類廣泛存在于真核生物和原核生物中的酶，具有B-葡萄糖苷酶和B-木糖苷酶等多種催化活性，能夠催化多種糖苷類化合物的水解反應，參與生物體內的多種代謝過程，如糖類代謝、細胞壁合成、激素合成、植物生長發育及香氣形成等。在擬南芥中，B-葡萄糖苷酶會通過影響ABA含量來改變植株耐旱性；水稻中的Os4BGlu31被證明通過平衡苯丙烯類化合物、類黃酮和植物激素糖綴合物在脅迫適應中發揮作用；將B-葡萄糖苷酶在煙草中過量表達，提高了煙株生物產量，縮短了生育周期。添加B-葡萄糖苷酶有助于茶、果汁、葡萄酒中存在的糖苷類香氣前體水解，進而增加產品的香氣，改善產品的品質；B-木糖苷酶可促進葡萄酒釀造過程中糖基化的萜烯類物質水解，增加香氣。

目前尚未見煙草GH3基因及其相關功能的報道。因此，本研究利用生物信息學方法在普通煙草K326的基因組中鑒定GH3基因家族成員，系統分析其進化關系、理化性質及基因結構，并利用轉錄組數據和qRT-PCR技術分析其時空表達模式和脅迫響應模式，為探究該基因家族在煙草糖代謝和香氣形成方面的功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與處理

煙草K326種子由貴州大學煙草品質重點實驗室提供。2023年4月10日播種，采用烤煙漂浮育苗方式于28℃光照培養箱（16 h光照/8 h黑暗）中育苗培養45天至五葉一心。

1.2煙草GH3基因鑒定及其編碼蛋白理化性質分析

普通煙草基因組序列以及注釋文件通過茄科基因組數據庫（https：//solgenomics.net/）獲得，由PFAM（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載GH3隱馬爾科夫模型（profile hidden markov models，profile HMMs）序列譜（PF00933）。利用HMMER 3.0軟件在K326蛋白組文件中檢索，將得到的GH3候選成員利用SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）進行進一步篩選，最終獲得煙草GH3家族成員。利用在線網站ExPasy（https：／／web.expasy.org/protparam/）對煙草GH3家族成員進行理化性質分析，包括氨基酸數目、分子量、蛋白質疏水性值等指標。

1.3煙草GH3家族成員系統進化分析

通過NCBI下載辣椒（Calxucum annum）和擬南芥（Arabidopsis thatiana）蛋白完整數據，同樣使用HMMER 3.0鑒定和篩選GH3家族蛋白序列，隨后利用MEGA 11對3個物種GH3蛋白進行多序列對比和構建系統進化樹。采用鄰接法，1 000次重復，利用ITOL（https：//itol.embl.de/）進行進化樹美化。

1.4煙草GH3蛋白保守結構域和基因結構分析

將煙草GH3蛋白上傳至MEME（https：//meme-stute.org／meme/tools/meme）網站，保守基序設定為10個，其他采用默認設定。利用軟件TBtools進行保守結構域作圖并使用GFF注釋文件繪制基因結構圖。

1.5煙草GH3基因定位、共線性分析及Ka/Ks計算

煙草CH3基因染色體定位利用TBtools軟件中的Gene Location Visualize功能進行作圖，并顯示各個染色體基因密度。利用TBtools軟件對煙草GH3基因進行復制分析以及與擬南芥、辣椒的共線性分析。擬南芥基因組數據從NCBI上獲得，辣椒基因組數據在Ensemble上獲得。利用KaKs_Calculator v2.0軟件計算復制基因的Ks和Ka。

1.6煙草GH3基因順式作用元件分析

從煙草基因組中獲取每個CH3基因CDS序列上游2 000 bp序列，使用Plant-CARE數據庫（http：//bioinformatics.peb.ugent.be/webtools/plant-care/html/）獲得GH3基因啟動子區的順式作用元件，并通過TBtools進行可視化。

1.7煙草CH3基因轉錄組測序分析

在GEO（https：//www.ncbi.nlm.ruh.gov/geo/）網站下載GSE95717和GSE214048的表達量數據。GSE95717測序背景：煙草在長日照（18h光照/6 h黑暗）條件下生長至8周，收集光照0、6、12、18 h的根、莖、莖尖樣本進行轉錄組測序。GSE214048測序背景：使用200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理五葉一心煙草幼苗，收集處理0、1、2、4、8h的煙葉樣本進行轉錄組測序。采用TBtools軟件歸一化處理后進行可視化作圖，分析煙草GH3基因家族成員的差異表達特征。

1.8煙草CH3基因表達分析

為進一步驗證煙草CH3家族成員是否對低溫和ABA激素進行響應，挑選4個NtGH3基因（NtGH3-5、NtGH3-19、NtGH3-22和NtGH3-26）進行qRT-PCR分析。選擇茁壯且長勢相似的五葉一心幼苗進行處理。ABA處理使用100 umol/LABA溶液：冷脅迫則是將幼苗放置在清水培養盤中，然后放入4℃光照培養箱中進行培養。每個處理20株，3次重復，分別在處理0、2、12、24 h取植株葉片，及時存放于-80℃超低溫冰箱中保存，用于RNA提取。用Plant RNA Kit純植物試劑盒（GenStar，R6827）提取總RNA，使用StarScriptⅡRT Mix with gDNA Remover試劑盒（GenStar，A224）獲得cDNA。使用Primer-Blast（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）進行特異引物設計，引物信息見表1。用L25作為內參基因，每個反應3次重復，采用2-△△ct法計算基因表達量。

2結果與分析

2.1煙草GH3家族成員鑒定及編碼蛋白的理化性質分析

通過HMMER 3.0軟件在煙草基因組數據庫中檢索得到CH3家族成員，去除重復和冗余序列，經在線數據庫SMART復篩，共鑒定得到35個煙草GH3家族成員，將其依次命名為NtGH3-I-NtCH3-35（表2）。其中23個成員分別被定位在14條染色體上。

蛋白理化性質分析結果（表2）表明，煙草GH3家族成員的蛋白序列長度在339-2259個氨基酸之間，分子量為37.2-248.9 kDa，其中Nt-GH3-18的氨基酸數量最少，分子量最小：NtGH3-12的氨基酸數量最多，分子量最大。煙草GH3成員中有20個屬于堿性蛋白，15個屬于酸性蛋白，其中NtGH3-18的等電點最高（9.14），NtGH3-13的等電點最低（4.94）。煙草GH3蛋白的不穩定系數為26.79-43.32，僅NtGH3-11的不穩定系數大于40，較為不穩定，其余均為穩定蛋白。煙草GH3蛋白的脂肪族氨基酸指數為82.05-95.84，表明該類蛋白的熱穩定性較好。同時煙草GH3蛋白親水系數為-0.214-0.056，其中NtGH3-15、NtGH3-18、NtGH3-22、NtGH3-25、Nt-GH3-26為疏水性蛋白，其余30個蛋白均為親水性蛋白。

2.2煙草GH3家族成員的系統進化分析

使用HMMER 3.0軟件分別在擬南芥和辣椒中鑒定出30、51個GH3基因，使用MEGA 11軟件采用最大似然（ML）法構建其與煙草GH3蛋白的鄰接（NJ）系統進化樹。結果（圖1）顯示，116個GH3蛋白可分為4類，其中，I類包括4個煙草成員、13個擬南芥成員和5個辣椒成員：Ⅱ類成員最多，包括15個煙草成員、8個擬南芥成員和22個辣椒成員：Ⅲ類成員最少，包括6個煙草成員、2個擬南芥成員和13個辣椒成員：Ⅳ類包括10個煙草成員、7個擬南芥成員11個辣椒成員。同時又可將I和II類分為編碼B-葡萄糖苷酶類，Ⅲ、Ⅳ類分為編碼B一木糖苷酶類。每一類都包含了3個物種的GH3家族成員，說明GH3家族成員的分化早于3個物種的分化。辣椒家族成員數量較多，說明GH3家族成員在該物種形成后可能經歷了多次復制事件。

2.3煙草GH3基因家族成員序列分析及啟動子分析

序列相似的基因一般具有相似的生物學功能，為此本研究采用在線網站MEME對煙草GH3家族成員的保守基序進行了分析，結果（圖2A）表明NtGH3家族成員均包含4-10個基序，除Nt-GH3-2/和NtGH3-32外均含有Motifl和Motif2，表明這兩個基序是GH3家族成員的保守序列。CD Search分析（圖2B）顯示，NtGH3成員含有糖苷水解酶家族3的保守結構域（Glyco_hydro_3_C），其中16個NtGH3蛋白還含有與木聚糖降解相關的PLN03080保守結構域，19個NtGH3蛋白含有參與葡萄糖降解的PRK15098保守結構域，可據此將其分為B-葡萄糖苷酶和B-木糖苷酶兩類，前者的保守基序中多出現Motif5和Motif6，推測這兩種保守基序可能決定了糖苷水解酶的功能。NtGH3基因結構分析（圖2C）表明，除NtCH3-12外顯子為18個以外，其余成員均含有4-12個外顯子。

利用Plant-CARE在線軟件對NtGH3基因家族成員上游2 000 bp序列進行分析，發現上游序列中有多個與激素響應、光響應和脅迫響應相關的順式作用元件（圖3）。其中，與光反應相關的元件有ACE、G-box、MRE、Spl和GTl-motif；與激素反應相關的元件有：CGTCA-motif、TGACG-mo-tif（MejA）、ABRE（ABA）和P-box（GA3）等；還有與非生物脅迫相關的TC-rich repeats、LTR和MBS等元件。與茉莉酸甲酯（MejA）相關的CGT-CA-motif基序和TGACG-motif以及與脫落酸（ABA）相關的ABRE存在于大多數家族成員中，這意味著大多數NtGH3成員可能參與這兩類激素信號傳導。

2.4煙草GH3基因定位與共線性分析

染色體定位結果（圖4）表明，有23個NtGH3基因分布在14條染色體上，其中12、19、22、23號染色體上各有3個成員，17號染色體上有兩個成員，1、2、3、4、7、8、13、14、16號染色體上各有1個成員，12個NtGH3基因未能定位到染色體上。

共線性分析結果表明：23個NtGH3成員中共有6對共線性基因（圖5A），主要為大片段復制，沒有串聯復制的基因對：通過計算，6個復制基因對的Ka/Ks都遠小于1（表3），主要為同義替換。煙草分別與擬南芥、辣椒GH3成員的共線性分析發現：9個CaGH3基因與13個NtGH3基因共組成13個基因對，2個AtGH3基因與3個NtGH3基因共組成3個基因對（圖5B），說明基因復制可能是煙草基因組GH3基因擴增和進化的動力。

2.5煙草GH3家族基因表達分析

生長8周的煙草幼苗光照0、6、12、18 h的根、莖、莖尖的轉錄組數據表明，NtGH3基因在不同部位和不同光照時間差異表達（圖6A）。NtGH3-2、NtGH3-16、NtGH3-31主要在根中高表達，光照后表達量降低：NtGH3-6、NtGH3-10和NtGH3-11主要在莖中表達，表達高峰分別出現在光照12、12、0h：其余NtGH3基因在莖尖中高表達，表達量隨光照時間延長呈先上升后下降的趨勢。

使用200 mmol/L甘露醇模擬干旱處理后，煙草幼苗的轉錄組數據中共檢測到23個NtGH3成員（圖6B）。干旱脅迫后，NtGH3-2、NtGH3-3、Nt-GH3-5、NtGH3-11、NtGH3-16的表達量下調，Nt-GH3-1、NtGH3-4、NtGH3-6、NtGH3-7、NtGH3-10、NtGH3-12、NtGH3-13、NtGH3-18、NtGH3-19的表達量呈現增加趨勢，NtGH3-14、NtGH3-17、NtGH3-20、NtGH3-22的表達趨勢為先增加后下降，NtGH3-15、NtGH3-8的表達量表現為先降低后升高又降低的趨勢，NtGH3-9、NtGH3-21、Nt-GH3-23表達量不受干旱脅迫的影響。

2.6低溫和ABA對部分NtGH3基因表達的影響

對NtGH3家族基因的啟動子元件分析發現，大多數基因上游含有低溫和ABA響應元件。因此，本試驗對煙草幼苗進行24 h低溫（4℃）和ABA處理后，分析NtGH3-5、NtGH3-19、NtGH3-22、NtGH3-26四個基因的表達變化。結果（圖7）顯示，低溫脅迫下，4個基因表現出了不同的變化，較長時間的低溫處理（24h）使NtGH3-5的表達顯著下調，而使NtGH3-22、NtGH3-26的表達顯著上調：NtGH3-19的表達量則隨處理時間延長呈現先升高后降低的趨勢。ABA處理后，NtGH3-5和NtGH3-19的表達量表現出先下降后升高的趨勢，而NtGH3-22表現出先升高后降低的趨勢，在12h時表達量達到峰值。NtGH3-26對ABA非常敏感，ABA處理后其表達明顯受到抑制，僅為處理前的30%。表明這4個基因可能參與了低溫和ABA的響應。

3討論與結論

本研究在普通煙草K326的全基因組范圍內鑒定到35個NtGH3基因，根據保守結構域類型可將其分為B-木糖苷酶和B-葡萄糖苷酶兩類。NtGH3成員均為熱穩定性蛋白，這與在棘孢木霉中的預測結果相似。在擬南芥和辣椒基因組中也分別鑒定到30個和51個GH3家族成員。系統發育樹和共線性分析表明，NtGH3成員中有6對共線性基因，復制方式主要為大片段復制。Ka/Ks表示的是異義替換（Ka）和同義替換（Ks）之間的比例，共線性基因對中Ka/Ks都小于0.5，表明NtGH3基因家族進化過程受到了純化作用。GH3家族的分化可能早于3個物種的形成，但后期辣椒GH3家族成員的分化與煙草的親緣關系更近。辣椒GH3成員個數明顯多于煙草，從染色體數目來推測辣椒CH3家族的復制事件多于煙草。

啟動子的作用對于基因表達至關重要，決定了特定蛋白質在特定細胞或組織中何時產生，因此，對啟動子序列進行分析，可以揭示基因表達調控的分子機制。NtGH3家族成員上游含有較多的激素響應位點、逆境脅迫應答元件和光反應元件識別位點，推測NtGH3可通過激素調控對外界環境變化做出響應。前人研究發現，植物產生脫落酸和茉莉酸甲酯可作為激活防御機制的信號，而且脫落酸和茉莉酸甲酯與植物香氣的形成密切相關。NtGH3家族的大多數成員都含有脫落酸和茉莉酸甲酯響應元件，表明NtGH3可能通過產生茉莉酸甲酯和ABA來響應外界環境變化和促進香氣物質的形成。

長日照下不同部位的轉錄組數據分析發現，大部分基因在煙草幼苗各部位均有表達，但部分成員表達量極低：各部位基因表達量存在差異，大部分成員在莖尖中高表達，少部分在莖與根中高表達。表明NtCH3成員的表達受到日照時間的調控。而NtGH3-21和NtGH3-23可能為煙草GH3基因家族擴張中出現的不進行表達的“假基因”。

滲透調節是植物應對逆境脅迫的重要途徑。研究表明糖苷水解酶可提高耐輻射球菌的滲透耐受性。本研究發現煙草GH3基因家族成員包含許多逆境脅迫應答元件，因此探究了NtGH3家族基因在非生物脅迫下的表達模式，結果表明，大多數基因對干旱存在應答，呈現隨著脅迫時間延長而上調、下調及先上調后下調表達3種情況：在低溫和ABA處理下，NtGH3家族4個基因均有不同程度的響應，變化趨勢存在差異，其中NtGH3-22在低溫下隨處理時間延長表達量逐漸升高，NtGH3-26對外源ABA敏感，短時間內表達量就顯著降低。

綜上，本研究從煙草基因組中鑒定出GH3基因家族的35個成員，并對其進行了生物信息學分析，確定了煙草GH3家族成員分屬于B-葡萄糖苷酶和B-木糖苷酶，在干旱、低溫等逆境脅迫響應方面發揮作用。因此，NtGH3基因家族可以作為研究煙草糖代謝和逆境脅迫響應機制的候選基因。本研究結果可為煙草的遺傳改良及優良品種選育提供理論基礎。

作者貢獻：張貞宇是實驗的設計和執行人：羅正飛、揚帥及顧江南完成數據分析和論文初稿的寫作：尹協參與實驗設計和實驗結果分析：聶瓊是項目的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析和論文寫作與修改。全體作者都已閱讀并同意最終的文本。