美味獼猴桃MYB家族鑒定及其對水淹脅迫的響應

樂有章 王建軍 戢小梅 遲文超 林之希

摘要：基于美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）二代轉錄組測序數據，通過多種生物信息學手段鑒定和分析了AcMYB家族基因。結果表明，在美味獼猴桃轉錄組數據中共獲得64個具有完整ORF序列的AcMYB家族成員，將其分成4個亞族，其中亞族Ⅰ共34個成員，亞族Ⅱ共18個成員，亞族Ⅲ共10個成員，亞族Ⅳ共2個成員。水淹處理前后表達分析顯示，AcMYB_214187、AcMYB_25788等AcMYB成員美味獼猴桃根中的表達水平明顯降低，快速響應水淹脅迫，而葉中的表達水平差異不明顯。AcMYB_19450、AcMYB_30021等AcMYB成員根中的表達水平差異不明顯，但葉中的表達水平明顯降低，可能原因是根接收到低氧脅迫信號后，將其傳遞到地上部并發揮作用，通過轉錄水平調控美味獼猴桃對低氧脅迫的響應。研究結果為后續開展美味獼猴桃MYB轉錄因子研究、促進抗逆境育種、提高產量提供了依據。

關鍵詞：美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）；AcMYB；鑒定；水淹脅迫；響應

中圖分類號：S663.4???????? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0215-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.037??????????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Identification of the MYB family of Actinidia deliciosa and its response to flooding stress

YUE You-zhang1，WANG Jian-jun2， JI Xiao-mei1， CHI Wen-chao2，LIN Zhi-xi2

（1.Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan? 430075，China；

2. College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing? 210095，China）

Abstract： Based on the second-generation transcriptome sequencing data of Actinidia deliciosa， AcMYB family genes were identified and analyzed using various bioinformatics methods. The results showed that a total of 64 AcMYB family members with complete ORF sequences were obtained from the transcriptome data of Actinidia deliciosa， which were divided into 4 subgroups. Among them， subgroup I had 34 members， subgroup II had 18 members， subgroup III had 10 members， and subgroup IV had 2 members. Expression analysis before and after waterlogging treatment showed that the expression levels of AcMYB members such as AcMYB214187 and AcMYB25788 were significantly reduced in the roots of Actinidia deliciosa， responding quickly to waterlogging stress， while there was no significant difference in expression levels in the leaves. The expression levels in the roots of AcMYB members such as AcMYB19450 and AcMYB30021 were not significantly different， but the expression levels in the leaves were significantly reduced. This might be due to the fact that the roots， upon receiving hypoxic stress signals， transmitted them to the aboveground parts and exerted their effects， regulating the response of Actinidia deliciosa to hypoxic stress at the transcriptional level. The research results provided a basis for further research on MYB transcription factors in Actinidia deliciosa， promoting stress resistance breeding， and improving yield.

Key words： Actinidia deliciosa； AcMYB； identification； flooding stress； response

收稿日期：2023-07-29

作者簡介：樂有章（1966-），男，湖北通山人，高級農藝師，主要從事獼猴桃資源搜集、評價及獼猴桃栽培育種工作，（電話）13986282616（電子信箱）390086056@qq.com；通信作者，王建軍（1969-），男，浙江嵊州人，副教授，碩士，主要從事園藝作物遺傳與育種工作，（電話）13951709767（電子信箱）1991009@njau.edu.cn。

樂有章，王建軍，戢小梅，等. 美味獼猴桃MYB家族鑒定及其對水淹脅迫的響應［J］. 湖北農業科學，2024，63（5）：215-222．

MYB是植物中最大的轉錄因子家族之一，且廣泛存在與真核生物中，功能豐富，參與植物多種生物學途徑的轉錄調控［1］。MYB轉錄因子N端存在高度保守的DNA結合結構域（DNA-binding domain，DBD），該結構域通常由4個約52個氨基酸的不完全氨基酸重復序列（R）組成，這些重復序列被重命名為R1、R2和R3，在植物中，MYB轉錄因子包含1～4個DNA結合重復序列。然而，大多數MYB蛋白包含2個重復序列，屬于R2R3-MYB亞家族［2］。許多植物中的MYB家族成員已被鑒定，擬南芥中共鑒定到196個MYB成員，其中包含126個R2R3-MYB亞家族，水稻中共鑒定到185個MYB成員，包含109個R2R3-MYB亞家族［3］。

多項研究表明，MYB轉錄因子在植物脅迫響應中發揮關鍵作用。過表達OsMYB48-1增強了水稻的耐旱性和耐鹽性，且通過ABA途徑參與干旱和鹽脅迫的調控［4］。R2R3類型的MYB成員OsMYB2可以調控水稻的耐鹽性、耐旱性和耐冷性［5］。過表達獼猴桃中AcMYB3R增強了擬南芥轉基因植株的耐旱性和耐鹽性［6］。

獼猴桃因富含高維生素C而享譽全球，廣受消費者的喜愛。近年來，隨著中國獼猴桃產業的不斷發展，其栽培面積和產量居世界前列。獼猴桃對澇害脅迫敏感［7］，同時由于南方年均降雨較多，北方短期內強降雨導致積水，在獼猴桃種植過程中易發生澇害，嚴重阻礙了獼猴桃穩定生產［8］。通過深入研究獼猴桃耐澇性的生理和分子機制，可以減少澇害造成的損失［9］。因此，通過生物信息學分析手段挖掘獼猴桃對水淹脅迫的響應基因，對培育耐澇獼猴桃品種具有重要意義。本研究基于美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）的轉錄組分析鑒定AcMYB家族成員，并分析水淹處理后AcMYB的逆境響應模式，對后續開展AcMYB轉錄因子功能研究，推進獼猴桃抗逆境育種，提高獼猴桃產量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

獼猴桃品種為美味獼猴桃；對美味獼猴桃水淹處理2周左右，收集根和葉片組織，置于液氮快速冷凍，-80 ℃中保存用于RNA提取。

1.2 RNA-Seq測序

按照Trizol試劑盒說明書提取美味獼猴桃各組織的總RNA，經檢測合格后等量混合，基于Illumina公司 Hiseq 4000（Illumina， San Diego， USA）平臺進行轉錄組測序，并采用Trinity軟件［10］拼接獲取Unigenes。

1.3 AcMYB轉錄因子基因篩選

利用EMBOSS軟件［11］預測美味獼猴桃Unigenes的開放閱讀框（ORF），獲取美味獼猴桃Unigenes編碼蛋白質數據。從EMBL-EBI網站（https：//pfam.xfam.org/）下載MYB保守域種子序列（序列號PF000249），利用HMMER 3.0軟件建立隱馬可夫模型（Profile HMM），檢索美味獼猴桃Unigenes編碼蛋白質數據庫。根據MYB保守結構域序列覆蓋度和E值等參數，利用Perl腳本篩選獲得覆蓋度高、置信度高的AcMYB轉錄因子序列。

1.4 AcMYB轉錄因子的系統進化分析

運用MEGA-X對篩選到的AcMYB轉錄因子蛋白序列進行多重比對，采用鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統進化樹（參數設置：Poisson model、Pairwise deletion和Bootstrap，1 000次重復）。

1.5 AcMYB蛋白序列保守結構域分析

利用DNAMAN 7.0軟件對篩選到的AcMYB蛋白序列進行多序列比對，獲得保守結構域區域。利用MEME（http：//meme-suite.org/）和WebLogo 3（http：//weblogo.threeplusone.com/）對AcMYB保守結構域序列標簽進行分析。

1.6 AcMYB理化性質分析

AcMYB氨基酸序列長度、分子大小和理論等電點等信息采用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）分析。二級結構采用SOPMA（htttp：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps）獲取相關信息。

1.7 AcMYB基因的逆境響應模式分析

利用Bowtie 2.0軟件（http：//bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）將下載的轉錄組reads數據與篩選到的AcMYB基因進行映射分析。使用Trinity包的Perl腳本語言，計算每個AcMYB基因的FPKM（Reads per kilobase of exon model per million mapped reads），分析AcMYB基因家族在水淹處理前后對水淹脅迫響應的表達水平。

2 結果與分析

2.1 RNA-Seq測序及組裝

通過Illumina HiSeq？對混合RNA樣品進行二代轉錄組測序，經組裝、聚類后得到美味獼猴桃轉錄組數據，其中Unigenes為541 285條，總長度為275 938 171 bp，如表1所示。

2.2 AcMYB家族成員鑒定與系統進化分析

541 285條美味獼猴桃Unigenes經預測獲取了170 578條蛋白序列（長度≥150 aa），利用Pfam獲取MYB轉錄因子保守結構域序列，序列號為PF00249。共篩選到64條AcMYB蛋白序列。

利用MEGA-X對AcMYB蛋白序列進行多序列比對，使用Neighbor Joining法構建系統進化樹。根據AcMYB家族成員的親緣關系和保守結構域將64個AcMYB成員分成4個亞族。亞族Ⅰ共34個成員，亞族Ⅱ共18個成員，亞族Ⅲ共10個成員，亞族Ⅳ共2個成員，如圖1所示。

2.3 AcMYB保守結構域分析

對美味獼猴桃AcMYB轉錄因子進行保守結構域分析，共預測到3個保守結構域，分別為AcMYB domain1、AcMYB domain2、AcMYB domain3。AcMYB domain1成員共27個，該結構域由29個氨基酸組成，其中有非常保守的甘氨酸（G）、脯氨酸（P）、甲硫氨酸（M）、絲氨酸（S）、組氨酸（H），以及較保守的賴氨酸（K）、亮氨酸（L）、纈氨酸（V）；AcMYB domain1主要存在于亞族Ⅰ。AcMYB domain2成員共29個，由15個氨基酸組成，其中色氨酸（W）和苯丙氨酸（F）較保守；AcMYB domain2主要存在于亞族Ⅰ和亞族Ⅱ。AcMYB domain3成員共6個，該結構域由50個氨基酸組成且大部分氨基酸極為保守，如圖2所示。

隨后對AcMYB家族中不同成員的保守基序（motif）進行分析，共預測到19個motif，其中27個AcMYB成員都包含motif5，17個成員都包含motif2，13個成員都包含motif8（圖3），表明motif5、motif2、motif8對AcMYB的功能起較為關鍵的作用。

2.4 AcMYB蛋白序列的理化性質分析

對AcMYB蛋白序列的理化性質進行分析，結果（表2）表明，不同亞族之間的等電點、相對分子質量和氨基酸長度等理化性質存在差異。亞族Ⅲ與其他亞族之間的差異較大，其等電點較低、相對分子質量較大、氨基酸長度較長、α-螺旋占比較高、β-折疊占比較低。亞族Ⅰ和亞族Ⅱ的蛋白序列具有較高的相似性。

2.5 AcMYB家族對逆境脅迫的響應模式

為了探究AcMYB家族基因對水淹脅迫的表達模式，對美味獼猴桃水淹處理前后的根、葉進行轉錄組分析。美味獼猴桃中大多數AcMYB轉錄因子在水淹處理后均顯示差異表達，說明AcMYB家族作為上游調節因子在水淹低氧脅迫中發揮重要功能。對差異表達基因進行聚類分析，結果（圖4）顯示，聚類Ⅰ中AcMYB轉錄因子主要在根中高表達，主要包括AcMYB_288897、AcMYB_159495、AcMYB_29425等亞族Ⅰ成員，AcMYB_44795、AcMYB_38321等亞族Ⅱ成員和少部分AcMYB_37746、AcMYB_22621等亞族Ⅲ成員。通過水淹處理后，聚類Ⅰ中AcMYB成員在根中表達明顯降低。

在水淹處理后，聚類Ⅱ中AcMYB_1672/AcMYB_2171等AcMYB成員根、葉的表達水平明顯升高，可能在低氧脅迫中發揮正調節作用。在水淹處理后，聚類Ⅲ中AcMYB_1002、AcMYB_20041、AcMYB_15669等AcMYB成員根中的表達水平明顯降低，而在葉中的表達水平明顯升高；在水淹處理后，聚類Ⅲ中AcMYB_214187、AcMYB_25788等AcMYB成員根中的表達水平明顯降低，而葉中的表達水平差異不明顯。在水淹處理后，聚類Ⅳ中AcMYB_37906、AcMYB_17409、AcMYB_28885等AcMYB成員根、葉中的表達水平明顯降低；聚類Ⅳ中AcMYB_19450、AcMYB_30021等AcMYB成員根中的表達水平差異不明顯，但葉中的表達水平明顯降低，可能原因是根接收到低氧脅迫信號后，將其傳遞到地上部并發揮作用，通過轉錄水平調控獼猴桃對低氧脅迫的響應。

以上結果表明，美味獼猴桃中的大部分AcMYB轉錄因子均參與水淹脅迫響應，有些AcMYB成員在根中快速響應水淹脅迫，有些AcMYB成員在葉中接受到來自根的脅迫信號后產生相應的響應。

3 小結與討論

水淹脅迫本質是根系缺氧誘發的一系列生理變化，如光合作用抑制、無氧呼吸［12，13］。長時間的厭氧呼吸會導致有害物質（如乙醛、乙醇和重金屬離子）在根際中積累，導致根部損傷甚至植物死亡［14，15］。擬南芥中VII族乙烯響應因子（ERF-VIIs）參與水淹脅迫信號傳遞的內在機制逐漸被解析［16］。同時，SR1-WRKY33-RAP2.2模塊開關與N端降解因子（N-degron）途徑存在串擾，調節擬南芥對水淹脅迫的響應［17，18］。獼猴桃中耐澇相關基因的鑒定集中于ERF家族。通過轉錄組分析，獼猴桃KR5中鑒定了131個ERF基因，發現ERF-VIIs中6個AvERF基因在水淹處理12 h后表達顯著上升［19］。有研究發現ERF-VIIs亞家族的2個成員AcERF75和AcERF1直接調控乙醇脫氫酶AcADH74的表達［20］。然而關于MYB參與水淹脅迫響應的研究較少。

本研究基于轉錄組數據從美味獼猴桃中篩選鑒定出了64個AcMYB家族成員。通過生物信息學分析，明確了64個AcMYB基因家族成員的基本信息，包括保守結構域、蛋白理化特性等，并初步獲得了參與水淹脅迫響應的成員，為進一步研究這些響應基因的功能奠定了基礎。轉錄組測序的深度、拼接效果等諸多原因可能會導致MYB家族成員鑒定的缺失，其準確性還有待進一步的驗證。

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