桃枝枯病病原菌鑒定及品種（種質）室內抗病性評價

王麗 涂洪濤 侯琿 周貝貝 孟帥 堵墨

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230475

摘??? 要：【目的】明確桃枝枯病的病原菌以及不同桃品種（種質）對枝枯病的抗性。【方法】觀察桃枝枯病田間癥狀。通過組織分離法對病樣進行分離培養，觀察分離物的形態特征，通過擴增測序其ITS、EF-1α和TUB基因序列進行分子鑒定，并對分離物進行致病性驗證。選取優勢病原菌種類，采用離體有傷接種枝條的方法測定37個桃品種（種質）對其的抗性，并根據病斑長度利用系統聚類方法對不同桃品種（種質）對枝枯病的抗性進行分級和評價。【結果】通過組織分離和純化，獲得54株分離物，經形態學觀察和多基因系統發育分析結果顯示，這些分離物有3個種，其中：35株為桃擬莖點霉（Diaporthe amygdali），5株為甜櫻間座殼（Diaporthe eres），14株為葡萄座腔菌（Botryosphaer dothidea）。致病性測定試驗表明，對接種后發病的病斑再分離鑒定，均能得到與原病原菌一致的菌株。抗性測定結果表明，根據病斑長度利用聚類分析將37個桃品種（種質）分為4類，類型Ⅰ有5個、類型Ⅱ有11個、類型Ⅲ有15個、類型IV有6個。抗性評價結果表明：供試品種（種質）中，免疫3個（光核桃、紅花山桃和帚形山桃），占8.10%；抗病2個（白根甘肅桃和紅根甘肅桃），占5.40%；中抗11個，占29.73%；感病15個，占40.54%；高感6個，占16.22%。【結論】無錫桃枝枯病的病原菌有3種分別為：D. amygdali、D. eres和B. dothidea，其中D. amygdali為優勢種，分離頻率為64.81%，不同桃品種（種質）對桃擬莖點霉菌的抗性不同，篩選到2個免疫品種（種質）、3個抗性品種（種質）。

關鍵詞：桃枝枯病；病原菌；鑒定；抗病性；聚類分析

中圖分類號：S662.1；S436.621??????? 文獻標志碼：A??????????? 文章編號：1009-9980（2024）05-0980-10

收稿日期：2023-11-13??????? 接受日期：2024-02-27

基金項目：河南省重點研發專項（221111111800）；中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2023-ZFRI）

作者簡介：王麗，女，副研究員，博士，主要從事果樹病害防控研究。Tel：0371-65330953，E-mail：wangli06@caas.cn

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：2371750064@qq.com

果 樹 學 報 2024，41（5）： 980-989

Journal of Fruit Science

Identification of the pathogen of peach shoot blight and indoor resistance evaluation of peach varieties （germplasms）

WANG Li1， 2， TU Hongtao1， 2， HOU Hui1， ZHOU Beibei1， MENG Shuai4， DU Mo3*

（1Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2Zhongyuan Research Center， CAAS， Xinxiang 453003， Henan， China; 3Wuxi Huishan District Agricultural Development Service Centre， Wuxi 214174， Jiangsu， China; 4College of Forestry and Biotechnology， Zhejiang Agriculture and Forestry University/State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Hangzhou 311300， Zhejiang， China）

Abstract： 【Objective】 Peach originated in China and has been cultivated for a long time. In recent years， a shoot blight disease that resulted in brown cankers around buds on shoots or twigs of peach trees has been widely observed in many orchards in Wuxi. This disease could kill shoots and branches and resulted in high yield losses. The study aimed to clarify the pathogens causing peach shoot blight disease and evaluate the disease resistance of the different peach varieties （germplasms）. 【Methods】 Firstly， a field survey was carried out to determine the incidence of peach shoot blight in peach orchards， and types of symptoms were observed. Secondly， the disease samples were used as materials to isolate the pathogenic fungi by the methods of tissue block separation. The isolates were identified by morphological observation combined with analysis of rDNA internal transcribed spacer （ITS）， elongation factor 1-α （EF-1α） and beta-tubulin （TUB） sequences. And the pathogenicity of the isolates was tested based on Koch postulates. Then， wound inoculation method used on detached twigs was used to identify and evaluate the resistance of the 37 peach varieties （germplasms） to shoot blight caused by Diaporthe amygdali. And the system clustering method was adopted to identify the resistance of the different peach varieties （germplasms） to shoot blight based on the disease lesion length data. 【Results】 The disease occurred initially on peach shoots and caused brown canker. Subsequently， the reddish-brown cankers developed on the shoots， and resulted in shoot blight， the disease spot presented gummosis sometimes. Total 54 isolates were obtained through tissue separation. All the isolates were identified as 3 species， including D. amygdali （35 isolates）， D. eres （5 isolates） and Botryosphaer dothidea （14 isolates） by morphological observation and multiple genes. The result of pathogenicity test showed that the isolates could induce lesions on the shoots， and the pathogens isolated from the infected lesions after inoculation were identical with the inoculated isolates. The resistance determination results indicated that 37 peach varieties （germplasms） were divided into 4 types based on the lesion lengths after 7 d inoculation with D. amygdali isolate by the cluster analysis. Guhetao， Honghuashantao， Zhouxingshantao， Baigengansutao and Honggenggansutao were classified into GroupⅠ. Zhongyoupan No. 9， Zhongyoupan No. 7， Zhongyoupan No. 16， Zhongyoupan No. 13， Honghujing， Hujingmilu， Baihua， Zhongtaohongyu， Wanhujing， Zhongtaoziyu and Qingshuibaitao were classified into Group Ⅱ. Fenghuapantao， Jinghong， Xiahui No. 5， Zhongpantao No. 11， Xiahui No. 6， Yuhualu， Wenzhoushuimi， Xiahui No. 8， Zhanglingzaoyulu， Fenghuayulu， Chaohui， Muyangshuimi， Ri No. 89， Gangshan No. 500 and Yingzuitao were classified into Group Ⅲ. Richuanbaifeng， Liutiaobaifeng， Dazenbaochiyue， Benbaifeng， Fenglu and Baifeng were classified into Group Ⅳ. Guhetao， Honghuashantao and Zhouxingshantao performed as immunity， Baigengansutao and Honggenggansutao performed as resistance， 11 cultivars performed as middle resistant， 15 cultivars performed as susceptibility， and 6 cultivars performed as high susceptibility. 【Conclusion】 There were three pathogens （D. amygdali， D. eres and B. dothidea） associated with peach shoot blight in Wuxi. D. amygdali was the dominant pathogen of the disease. The different peach varieties exhibited varying degree of resistance to the shoot blight disease from immunity to high susceptibility.

Key words： Peach shoot blight; Pathogen; Identification; Disease resistance; Cluster analysis

桃（Prunus persica）在中國有著悠久的栽培歷史，至2019年中國桃種植面積達到89.0萬hm2，產量達到1 599.3萬t，面積和產量均居全球首位[1]。然而，近年來隨著桃產業的發展，桃枝枯病在無錫陽山鎮水蜜桃產區發生普遍，果園發病率為30%～50%[2]。該病主要危害新梢和枝條，通常在新梢基部產生褐色病斑，引起葉片枯萎，枝條枯死；枝條發病部位有時伴有流膠產生，隨著病情的發展，整個枝條枯死[3]。

早期研究表明危害桃樹枝干造成枝枯的真菌病原菌有多種，如核果黑腐皮殼菌（Cytospora leucostoma）和蘋果潰瘍病菌（Valsaria insitiva）引起的腐爛病[4]；桃擬莖點霉（Diplodia amygdali）引起的枝枯病[5]；葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、色二孢（Diplodia seriata）以及可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引起的流膠病[6]。近年，紀兆林等[7]和方麗等[8]報道的桃枝枯病菌為D. amygdali。Tian等[9]報道的桃枝枯病菌有D. amygdali和B. dothidea兩種。關于桃枝枯病的病原菌是否存在多樣性，還需進一步研究。目前生產上對桃樹枝枯的防治尚無高效的防治方法，因此，探討評價品種對病害的抗性對防治枝枯病至關重要，亟須開展不同桃樹品種對枝枯菌的抗性評價，為選育和應用抗病品種防治該病害提供技術支撐，對中國桃產業的健康安全發展具有重要意義。

鑒于桃枝枯病危害嚴重，但病原菌報道種類不單一，為近一步厘清其病原菌種類，對桃枝枯病進行病原菌分離純化、形態觀察和致病性試驗，通過形態鑒定和ITS、EF-1α和β-tubulin基因序列比對分析，以確定桃枝枯病的病原菌種類；并對分離到的優勢病原菌，選取37個桃樹品種（種質），采用室內離體有傷接種枝條和系統聚類分析方法，進行室內抗病性評價，以期為科學防控桃枝枯病提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試37個桃品種（種質）：柳條白鳳、白鳳、日川白鳳、本白鳳、雨花露、湖景蜜露、紅湖景、京紅、朝暉、霞暉5號、霞暉6號、霞暉8號、大珍寶赤月、鳳露、奉化玉露、岡山500號、穆陽水蜜、清水白桃、日89號、溫州水蜜、長嶺早玉露、晚湖景、白花、中蟠桃16號、中油蟠7號、中油蟠9號、中蟠桃11號、中蟠桃13號、中桃紅玉、中桃紫玉、鷹嘴桃、奉化蟠桃、帚形山桃、白根甘肅桃、紅根甘肅桃、紅花山桃和光核桃。材料采自江蘇省無錫市陽山鎮桃園和中國農業科學院鄭州果樹研究所桃種質資源圃。

1.2 病害癥狀觀察

2022年和2023年在江蘇省無錫市惠山區桃園中采集桃枝枯病枝條（表1），并將采集發病枝條帶回實驗室，觀察記錄病害癥狀。

1.3 病原菌的分離培養

采用組織分離法分離病原菌[10]，具體操作方法如下，剪取桃樹枝條病健交界處病組織數塊，置于0.5%的次氯酸鈉溶液中消毒60 s，然后用無菌蒸餾水洗3次，在超凈工作臺中用無菌濾紙片吸干水分后移至PDA平板培養基上，于26 ℃恒溫培養箱中培養5 d。選取代表性菌落在顯微鏡下挑取單菌絲尖端置于PDA平板培養基上培養7 d，得到純菌株，保存在PDA斜面，放置于4 ℃冰箱備用。然后，將菌株活化轉接到PDA平板上，于26 ℃恒溫培養箱中培養，觀察菌落顏色、形狀和質地等，產生孢子后，觀察分生孢子的顏色、大小和形態特征等。

1.4 病原菌分子鑒定

將活化后的代表性菌株接種到鋪有玻璃紙的PDA平板上，于26 ℃恒溫培養箱中培養7 d，長出大量菌絲后用滅菌牙簽刮取菌絲，放到1.5 mL離心管中，使用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，按照試劑盒說明書操作。PCR擴增：采用引物對ITS1/ITS4[11]、Bt2a/Bt2b[12]、EF1-728F/EF1-986R[13]（表2）分別對各菌株所提取的DNA進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系和擴增程序參考前人的方法[11-13]，擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序；通過軟件SnapGene4.1.9對基因序列進行處理和拼接后，在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）網站上利用Blastn軟件進行序列的同源性比對；用軟件MEGA11.0構建鄰接系統發育樹，自展（bootstrap）循環抽樣檢測1000次。

1.5 病原菌致病性測定

選取桃品種湖景蜜露1年生枝條，經清水和無菌水清洗，再用75%乙醇表面消毒后，晾干備用。參照Tian等[9]的接種法并稍作修改，具體步驟為：病原菌接種于PDA培養基上，26 ℃培養7 d后，用直徑5 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅用于桃枝條接種。用消毒刀片在枝條上刻出傷口，每枝條刻1～2個傷口。將準備好的菌餅放在沾有無菌水的脫脂棉上，接種在枝條的傷口處，并用封口膜包好，以接種無菌PDA培養基菌餅為對照，并做好標記。再將接種枝條放到鋪有濕濾紙的保鮮盒內，放到培養箱內保濕培養[26 ℃（白天）和18 ℃（晚上）]。每處理接種10個點，3次重復，以空白PDA培養基接種作為對照。7 d后觀察發病情況，根據Kochs法則，對發病部位進行再分離鑒定。

1.6 不同品種（種質）對枝枯病的室內抗性測定

根據病原菌分離鑒定結果，D. amygdali為優勢種，因此對37個桃品種（種質）進行D. amygdali的抗性測定試驗。具體操作為：選取不同品種的桃1年生健康綠枝條，去除葉片，剪成長約20 cm的枝條，用75%乙醇表面消毒后，晾干備用。按照1.5的方法進行接種和培養。接種后每天觀察發病情況，在接種7 d后，用游標卡尺測量病斑直徑。

1.7 病害調查與統計分析

將調查所得的數據，用Excel進行處理，使用DPS軟件進行系統聚類分析，聚類方法采用組間連接法，聚類距離采用平方歐式距離，并根據聚類分析結果進行抗性評價。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

如圖1所示，2022年和2023年對江蘇省無錫市惠山區桃園調查，發現該病害主要危害枝條，多發生于嫩枝。發病初期形成褐色病斑，隨后病斑擴展，發病后期病斑褐色至暗褐色，受害嚴重植株的大多數枝條甚至整株枯死。發病部位有時伴有流膠，發病較重植株樹勢衰弱。

2.2 病原菌分離和形態特征

從47份樣品中，共獲得54株分離物，根據形態特征，將其分為3組（圖2）。其中第1組有35株分離物，分離頻率為64.81%，分離物在PDA平板上培養，菌落白色至乳白色，毛氈狀，邊緣鋸齒狀，中央區域菌絲濃密，霉層密實，表面出現3～4道界限明顯的環痕。培養后期菌落上出現的分生孢子器，分生孢子器產生兩種類型分生孢子：α型孢子，無色，單孢，梭形，大小為（5.2～9.4）μm×（2.3～3.8）μm；β型孢子，無色，單孢，線形，彎曲呈鉤狀，大小為（18.6～36.7）μm×（0.9～2.8）μm。第2組有5株分離物，分離頻率為9.25%，分離物在PDA平板上培養，菌落白色，邊緣規則，分生孢子形態和第1組接近。根據形態學特征，初步確定第1組和第2組病原菌為間座殼屬真菌（Diaporthe sp.）。第3組有14株分離物，分離頻率為25.93%，分離物在PDA平板上培養，菌落初期為白色，后期灰棕色，產生分生孢子器。分生孢子器產生分生孢子，分生孢子梭形、透明或淺棕色，大小為（19.4～31.7）μm×（5.7～8.6）μm。根據形態學特征，初步確定該病原菌為葡萄座腔菌屬真菌（Botryosphaeria sp.）。

2.3 病原菌的分子鑒定

每組分離菌株選取代表性菌株擴增其ITS、EF-1α和TUB基因并測序，測序結果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）網站上進行BLAST比對分析，下載相關菌株序列，構建基于ITS、EF-1α和TUB基因的NJ系統發育樹（圖3），結果顯示，菌株PA-1、PA-2與D. amygdali聚在同一支，DE-1與D. eres聚在同一支，BD-1、BD-2與B. dothidea聚在同一支。結合形態學分析，確定引起桃枝枯病的病原菌有3種，分別為D. amygdali、D. eres和B. dothidea。

2.4 病原菌的致病性測定

通過有傷接種法回接分離到的菌株，結果表明，離體桃枝條經有傷接種3種菌株5 d后，均產生明顯的褐色病斑，隨后病斑緩慢擴展，有時伴有不明顯環狀紋（圖4）。對照組不發病。根據柯赫氏法則，對接種后發病的病斑再分離鑒定，均能重新得到與原病原菌一致的菌株，證實了D. amygdali、D. eres和B. dothidea是引起桃枝枯病的病原菌。

2.5 不同品種（種質）對桃擬莖點霉菌的抗性測定

將桃枝枯病菌優勢種D. amygdali代表性菌株PA-1接種不同品種（種質）桃枝條，調查病斑長度，將37個供試桃樹品種（種質）枝條的病斑長度進行聚類分析，對桃擬莖點霉的抗性進行評價。結果表明，在接種后3 d逐漸開始發病，且隨著時間的增加病斑不斷擴大，7 d時調查不同桃品種（種質）對枝枯病的抗性不同，病斑直徑在0～62.69 mm之間，聚類分析將37個桃品種（種質）分為4類，類型Ⅰ包含5個：光核桃、紅花山桃和帚形山桃不發病，白根甘肅桃和紅根甘肅桃病斑擴展長度分別為7.06 mm和9.22 mm。類型Ⅱ包含11個：中油蟠9號、中油蟠7號、中蟠桃16號、中蟠桃13號、紅湖景、湖景蜜露、白花、中桃紅玉、晚湖景、中桃紫玉和清水白桃，病斑擴展長度在18.07～25.37 mm之間。類型Ⅲ包含15個：奉化蟠桃、京紅、霞暉5號、中蟠桃11號、霞暉6號、雨花露、溫州水蜜、霞暉8號、長嶺早玉露、奉化玉露、朝暉、穆陽水蜜、日89號、岡山500號和鷹嘴桃，病斑擴展長度在27.18～42.00 mm之間。類型Ⅳ包含6個：日川白鳳、柳條白鳳、大珍寶赤月、本白風、鳳露和白鳳，病斑擴展長度在47.26～62.69 mm之間（表3、圖5）。4個類型的抗性依次為：類型Ⅰ＞類型Ⅱ＞類型Ⅲ＞類型Ⅳ。

2.6 37個桃品種（種質）對桃擬莖點霉菌的抗性評價

根據病斑長度結合聚類分析結果，制定桃品種（種質）對桃擬莖點霉菌的抗性等級標準，評估供試桃品種（種質）的抗病水平，分級標準見表4。依據抗性級別劃分標準，獲得37個供試桃品種（種質）對桃擬莖點霉菌的抗性鑒定結果：免疫3個（光核桃、紅花山桃和帚形山桃），占8.10%；抗病2個（白根甘肅桃和紅根甘肅桃），占5.40%；中抗11個（中油蟠9號、中油蟠7號、中蟠桃16號、中蟠桃13號、紅湖景、湖景蜜露、白花、中桃紅玉、晚湖景、中桃紫玉和清水白桃），占29.73%；感病15個（奉化蟠桃、京紅、霞暉5號、中蟠桃11號、霞暉6號、雨花露、溫州水蜜、霞暉8號、長嶺早玉露、奉化玉露、朝暉、穆陽水蜜、日89號、岡山500號和鷹嘴桃），占40.54%；高感6個（日川白鳳、柳條白鳳、大珍寶赤月、本白風、鳳露和白鳳），占16.22%。

3 討 論

筆者在本研究中通過癥狀觀察、形態學鑒定結合ITS、EF-1α和TUB多基因鑒定確認引起無錫桃枝枯病的病原菌有3種，分別為D. amygdali、D. eres和B. dothidea，分離頻率分別為64.81%、9.25%、25.93%。Phomopsis amygdali是D. amygdali的曾用名，在Index fungroum里P. amygdali現用名為D. amygdali，因此筆者在本文中將P. amygdali統一為D. amygdali。D. amygdali的同物異名還包括Fusicoccum amygdali，最早在1905年，Delacroix等[14]研究表明，F. amygdali是引起法國桃樹和杏樹潰瘍病的病原菌，之后美國等地報道的類似枝枯病癥狀的桃樹病害，其病原菌都是D. amygdali[15-17]。2013年以前，中國的研究報道認為D. amygdali引起的桃枝干病害為桃潰瘍病[18-20]，之后，學者認為D. amygdali是浙江嘉興和江蘇無錫桃枝枯病的病原菌[7-8，21]。本研究結果也表明，D. amygdali是無錫桃枝枯病的優勢病原菌，與前人的研究結果一致。Tian等[9]研究報道D. amygdali和B. dothidea是引起江蘇省無錫市陽山桃枝枯病的病原菌，其中D. amygdali的分離頻率高于B. dothidea，本研究結果再次證實了這一結論。Tian等[9]認為D. amygdali只引起病斑壞死癥狀，而B. dothidea引起的病斑伴有輪紋癥狀，本研究中B. dothidea引起的病斑上并無明顯的輪紋癥狀，具體原因有待進一步研究。Prencipe等[22]報道D. eres在意大利能引起桃樹枝干潰瘍病，Xiao等[23]報道D. eres在中國能引起黃桃采后軟腐病，但尚未有關于該病原菌引起中國桃樹枝枯病的報道。本研究首次發現D. eres是引起中國桃枝枯病的病原菌之一，這一發現對了解桃枝枯病的發生和流行具有重要意義，要密切關注桃枝枯病病原菌種類的變化，合理優化調整用藥種類，制定桃枝枯病的科學防控策略。

病害的發生與品種的抗性等密切相關[24]，董京萍等[25]評價了桃樹不同品種對細菌性穿孔病的抗性，鄭鵬華等[26]報道了5個桃樹品種對流膠病的抗性，然而關于桃樹品種（種質）對枝枯病的抗性評價目前尚未見報道。本研究中，采用室內離體有傷接種法評價了37個桃樹品種（種質）對枝枯病原菌優勢種D. amygdali的抗性，發現免疫3個（光核桃、紅花山桃和帚形山桃），占8.10%；抗病2個（白根甘肅桃和紅根甘肅桃），占5.40%；中抗11個，占29.73%；感病15個，占40.54%；高感6個，占16.22%。研究結果為桃樹品種的推廣、選育和枝枯病防控提供了重要的依據。雖然生產上抗病性不是選擇桃品種的唯一指標，但是由于選育各方面均良好的品種較困難，故而對于桃枝枯病發生嚴重的地區可以根據其對病原菌抗性判斷適合本地區栽植的品種。此外，由于桃枝枯病的病原菌有3種，病原菌在不同地區可能存在地理差異，因此，在進行桃枝枯病抗病育種和品種推廣時，要根據當地的病原菌優勢種進行工作。

4 結 論

引起無錫桃枝枯病的病原菌有3種，分別為D. amygdali、D. eres和B. dothidea，其中D. amygdali為優勢種，分離頻率為64.81%。不同桃樹品種對枝枯病的抗性不同，免疫3個（光核桃、紅花山桃和帚形山桃），占8.10%；抗病2個（白根甘肅桃和紅根甘肅桃），占5.40%；中抗11個，占29.73%；感病15個，占40.54%；高感6個，占16.22%。

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