?湖南省獼猴桃葉片主要真菌病害的rDNA-ITS鑒定及序列分析?

摘要：為了解湖南省獼猴桃葉部真菌病害病原菌的種類和相對多度，在長沙市、邵陽市、常德市、懷化市、張家界市和湘西土家族苗族自治州等地的獼猴桃種植區(qū)采集了‘紅陽’‘米良1號’‘翠玉’等6個(gè)獼猴桃品種的31份感病葉片樣本，對病葉上的病原真菌進(jìn)行分離、篩選和純化。通過rDNA-ITS鑒定，結(jié)合UNITE數(shù)據(jù)庫注釋，統(tǒng)計(jì)分離出的病原真菌的種類和相對多度，比較了不同地區(qū)和不同寄主品種中的致病真菌的種類和相對多度差異。結(jié)果表明：31份感病葉片樣本中共分離出3門25屬75種316株病原真菌，以鏈格孢屬、炭疽菌屬和間座殼屬為主要群體，分別占比36.71%、18.04%和14.56%；按照地區(qū)分布，菌屬數(shù)量懷化市最多、其次是邵陽市和湘西州；按照獼猴桃品種分布，菌屬數(shù)量排名前三的依次為‘紅陽’‘米良1號’和‘翠玉’。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；真菌病害；病原菌；分類鑒定

中圖分類號：S436.634 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）04-0008-07

Identification of Pathogens Causing Major Fungal Diseases of Kiwifruit Leaves in Hunan Province by rDNA-ITS Sequencing

MO Chang-an1，ZHAI Yang2，ZHAO Xin2，PAN Feng3，YANG Yuan-ru2，WANG Hong-ying2，TAN Zhi-jian2，ZENG Liang-bin2

（1. Plant Protection and Inspection Station of Taojiang County， Yiyang 413400， PRC; 2. Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， PRC; 3. Yongshun County Bureau of Agricultural and Rural Affairs， Yongshun 416700， PRC）

Abstract： This study aims to identify the species and reveal the relative abundance of fungal pathogens causing fungal diseases of kiwifruit leaves in Hunan Province. A total of 31 diseased leaf samples were collected from plants of six kiwifruit varieties including 'Hongyang'， 'Miliang No. 1'， and 'Cuiyu' in the kiwifruit planting areas in Hunan Province， and the pathogens were isolated and screened. The species and relative abundance of pathogenic fungi were determined by rDNA-ITS sequencing combined with annotation against the UNITE database. The species and relative abundance of the pathogens were compared among different areas and host varieties. A total of 316 pathogenic fungal strains were isolated from the diseased leaves， belonging to 75 species， 25 genera of 3 phyla. Alternaria， Colletotrichum， and Diaporthe were the dominant genera， with the relative abundance of 36.71%， 18.04%， and 14.56%， respectively. The area with the most pathogen genera was Huaihua City， followed by Shaoyang City and Xiangxi Tujia and Miao Autonomous Prefecture. The top three kiwifruit varieties with the most pathogen genera were 'Hongyang'， 'Miliang No. 1'， and 'Cuiyu'.

Key words： kiwifruit; fungal disease; pathogen; identification

隨著湖南省獼猴桃種植面積的增大，品種單一化且抗病能力不強(qiáng)等問題逐漸顯現(xiàn)，細(xì)菌性病害和真菌性病害時(shí)有發(fā)生，影響獼猴桃安全生產(chǎn)。獼猴桃葉片病害的病原菌種類復(fù)雜，發(fā)病特征相似，并且多數(shù)不僅危害葉片還會(huì)引起果實(shí)軟腐，給獼猴桃采收后的儲(chǔ)藏帶來了極大的不便[1-2]。例如鏈格孢屬（Alternaria）既是引起葉片褐斑病的病原[3]，也是軟腐病的病原之一[4]。目前報(bào)道的軟腐病病原菌以間座殼屬（Diaporthe，擬莖點(diǎn)霉屬的有性態(tài)）[5]、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）[6]等為主，能侵染獼猴桃葉片且致病嚴(yán)重。

基于真菌rDNA-ITS序列差異的鑒定分類和系統(tǒng)發(fā)育分析方法已被廣泛應(yīng)用于微生物屬間及種間群體的系統(tǒng)學(xué)研究[7]。病原真菌物種間的形態(tài)差異較小，以形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類鑒定難度大，耗時(shí)長。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法對獼猴桃葉片病原菌進(jìn)行分類鑒定十分必要。

研究通過高通量測序手段對具有豐富變異特點(diǎn)的rDNA-ITS序列進(jìn)行測序鑒定，再結(jié)合QIIME Ⅱ工具，使用真菌通用數(shù)據(jù)庫UNITE進(jìn)行注釋，明確湖南地區(qū)獼猴桃葉部真菌病害病原菌的種類和相對多度，比較了不同地區(qū)和不同寄主品種的病原真菌種類和相對多度差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019—2020年，在湖南省長沙市、邵陽市、常德市、懷化市、張家界市和湘西土家族苗族自治州（以下簡稱湘西州）以及陜西省西安市和山東省臨沂市的獼猴桃種植區(qū)，采集了‘翠玉’‘米良1號’‘紅陽’‘楚紅’‘軟棗’和‘綠肉翠香’這6個(gè)獼猴桃品種的感染真菌性病害的葉片，共計(jì)31份樣本，取樣時(shí)間及地點(diǎn)如表1所示。

主要試劑有真菌基因組DNA快速提取試劑盒DN41（北京艾德萊生物科技有限公司），2×Es Taq MasterMix（Dye，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司），通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原真菌的分離與鑒定 采用組織分離法[8-10]

分離病原真菌，具體操作如下：取新鮮病葉樣本沖洗干凈，切取病健交界處的病葉組織20 mm×20 mm，用75%酒精表面消毒20 s，無菌水沖洗1次；2%次氯酸鈉表面消毒30 s，無菌水沖洗3次[11]；用無菌濾紙吸干水分；切取病健交界處組織約2 mm×2 mm大小，接種于PDA培養(yǎng)基，25℃倒置培養(yǎng)觀察；經(jīng)一系列的分離、篩選和純化后，觀察記錄得到的純種病原菌菌落的顏色、形狀、表面特征與生長速度情況，并進(jìn)行鏡檢及甘油凍存。

1.2.2 病原真菌ITS序列的測定 總DNA的提取參照Fungal DNA Kit真菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。ITS區(qū)的擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1和ITS4。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中有DNA模板1 μL，預(yù)混Taq酶12.5 μL，10 μmol/L的正向引物和反向引物各1 μL，雙蒸H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增由變性、退火和延伸3個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃

延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，觀察是否擴(kuò)增到特異性目的片段，PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行雙向測通。

1.2.3 病原真菌ITS序列分析及數(shù)據(jù)處理 將所得序列校對后使用MEGA X（version 10.1.8）中的Clustal W進(jìn)行多序列比對[12-13]，剪除兩端。以UNITE（version"7.2）[14]數(shù)據(jù)庫為參考，使用QIIME Ⅱ（version 2020.8）[15]

工具對序列進(jìn)行注釋；再使用MEGA X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用NJ法（neighbor-joining method）構(gòu)建進(jìn)化樹，用自展法抽值檢驗(yàn)1 000次驗(yàn)證其可靠性[1，16]；在網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de）上美化樹狀圖，采用Microsoft Office 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Gephi 0.9.2繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 所分離病原菌的分類統(tǒng)計(jì)分析

將分離到的病原真菌的ITS序列置于UNITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，得到進(jìn)化樹如圖1所示。31份樣本中共分離出3門25屬75種316株菌株，其中子囊菌門

（Ascomycota）有22屬72種313株，擔(dān)子菌門（Basi-diomycota）有2屬2種2株，毛霉菌門（Mucoromycota）有1屬1種1株。分離菌株相對多度較高的5個(gè)屬依次為鏈格孢屬、炭疽菌屬（Colletotrichum）、間座殼屬、黑孢霉屬（Nigrospora）和葡萄座腔菌屬，分別占比36.71%、18.04%、14.56%、6.01%和5.70%。種水平相對多度較高的3個(gè)種分別為互隔鏈格孢（A. alternata），膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和葡萄座腔菌（Botryo-sphaeria dothidea），分別占比35.76%、12.34%和5.06%，這3種既是獼猴桃葉片病原也是果實(shí)病原[2，17-18]，能夠引起葉斑和果實(shí)腐爛。

目前，研究已報(bào)道的從獼猴桃軟腐病染病果實(shí)上分離出的病原菌有間座殼屬、葡萄座腔菌屬、類擬盤多毛孢菌[包括新擬盤多毛孢屬（Neopestalo-tiopsis）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）][19]和小新殼梭孢菌屬（Neofusicoccum）[20-21]，該試驗(yàn)各分離出46、18、8和3株，總相對多度為23.73%，其中類擬盤多毛孢還會(huì)引起獼猴桃灰斑病[22]。能夠引起獼猴桃葉片褐斑病和黑斑病的病原有黑孢霉屬[23-24]、葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）[25]、亞隔孢殼屬（Didymella）[26]和棒孢菌屬（Corynespora）[27-28]，各分離出19、10、8和3株，總相對多度為12.66%。鏈核盤菌屬（Monilinia）可以引起獼猴桃褐腐病[29]，分離到6株，相對多度為1.90%。其他如鐮刀菌屬（Fusarium，與Gibberella同物異名）分離到10株，相對多度為3.16 %；毛霉屬（Mucor）等12屬病原菌有致病能力[30]但分離菌株數(shù)均為1株，影響輕微，總相對多度為3.80%。

2.2 不同地區(qū)和不同品種間病原菌屬多樣性差異分析

對不同地區(qū)分離獲得的病原真菌屬進(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)懷化市有15屬81株，邵陽市有11屬84株，湘西州有11屬51株，張家界市有9屬39株，常德市有5屬23株，長沙市有5屬16株，西安市有3屬6株，臨沂市有2屬16株。在相對多度排名前三的病原真菌中，鏈格孢屬菌株在8個(gè)地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，間座殼屬在臨沂以外的其他7個(gè)地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，炭疽菌屬在臨沂和常德以外的其他6個(gè)地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。

對6個(gè)獼猴桃栽培品種分離獲得的病原真菌屬進(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖3所示，‘紅陽’分離出18屬177株，‘米良1號’分離出15屬67株，‘翠玉’分離出11屬51株，‘軟棗’分離出4屬5株，‘綠肉翠香’分離出3屬6株，‘楚紅’分離出3屬10株。在6個(gè)品種中均分離出鏈格孢屬和炭疽菌屬菌株，除‘軟棗’外的其他品種中均分離出間座殼屬菌株。

2.3 基于ITS序列進(jìn)化樹的優(yōu)勢菌屬菌株分析

2.3.1 基于ITS序列進(jìn)化樹的鏈格孢屬菌株分析 基于ITS序列對116株鏈格孢屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）表明，116株菌株中有113株互生鏈格孢（A. alternata）、2株甜葉菜鏈格孢（A. betae-kenyensis）和1株稻毛錐孢菌（A.padwickii）。互生鏈格孢和甜葉菜鏈格孢差異較小，二者聚為一類，表明這115株親緣關(guān)系非常近；稻毛錐孢菌單獨(dú)一類，與其他2種菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3.2 基于ITS序列進(jìn)化樹的炭疽菌屬菌株分析 基于ITS序列對57株炭疽菌屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）表明，57株菌株被分為4個(gè)類群，第一類為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），有46株；第二類共有7株，分別為5株C. citricola、1株C. oncidii和1株C. cymbidiicola；第三類共6株，分別為5株君子蘭刺盤孢（C. cliviae）和1株C. sojae；第四類共5株，分別為3株C. citri和2株松針刺盤孢（C. fioriniae）。

3 討論與結(jié)論

該研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對湖南省等地的獼猴桃葉部真菌病害病原菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)合軟件QIIME Ⅱ和數(shù)據(jù)庫UNITE構(gòu)建了基于ITS序列的進(jìn)化樹。結(jié)果表明，共分離到316株菌株，分別涉及3門25屬75種，其中鏈格孢屬、炭疽菌屬和間座殼屬菌株為優(yōu)勢種，是造成獼猴桃褐斑病、炭疽病和軟腐病的主要病原菌。

分離的病原菌相對多度在地區(qū)分布上與種植面積相關(guān)，在單一品種大面積種植區(qū)分離的病原菌數(shù)量和種類更多；在獼猴桃品種分布上與抗病能力相關(guān)，在易感病獼猴桃品種上分離的病原菌數(shù)量和種類更多。種植品種單一化在帶來更高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也為病害的發(fā)生提供了條件，獼猴桃葉部真菌病害除直接危害葉片外，多數(shù)病原菌還會(huì)導(dǎo)致果實(shí)軟腐，影響獼猴桃的采后儲(chǔ)藏。儲(chǔ)藏期病害主要為獼猴桃軟腐病，該病在采收期無明顯的癥狀，儲(chǔ)藏期才顯現(xiàn)病癥，且發(fā)病迅猛，是獼猴桃產(chǎn)業(yè)中影響最嚴(yán)重的真菌性病害[19-20]，能引起獼猴桃軟腐病的病原有互隔鏈格孢、間座殼屬、葡萄座腔菌屬、類擬盤多毛孢菌和小新殼梭孢菌屬等[1，19-20]。

對湖南省內(nèi)采樣地區(qū)和寄主獼猴桃品種進(jìn)行病原菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在湖南省6個(gè)地區(qū)、5個(gè)品種中均分離出鏈格孢屬、炭疽菌屬和間座殼屬菌株，且占比較高，表明褐斑病、炭疽病和軟腐病為該區(qū)域生產(chǎn)中主要的真菌病害。按照地區(qū)分布，病原菌菌屬數(shù)量排序?yàn)閼鸦校旧坳柺?湘西州＞張家界市＞常德市=長沙市，數(shù)量分布與省內(nèi)各獼猴桃種植區(qū)面積分布大致相同；按照獼猴桃品種分布，病原菌菌屬數(shù)量排序?yàn)椤t陽’＞‘米良1號’＞‘翠玉’＞‘軟棗’＞‘楚紅’。

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（責(zé)任編輯：王婷）

基金項(xiàng)目：湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021NK2003）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IBFC07）

作者簡介：莫長安（1982—），男，湖南桃江縣人，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)作物病蟲害統(tǒng)防統(tǒng)治。

通信作者：曾糧斌