miR-130a-5p靶向Runx2對牙槽骨成骨細胞增殖和分化的影響及其調控機制研究

張義林 侯旭 汪莉 朗么磋 李相宜

[摘要]目的：探究miR-130a-5p靶向Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）對牙槽骨成骨細胞（Alveolar osteoblast，AOB）增殖、凋亡、成骨分化的影響及其機制。方法：將AOB分為NC組、miR-NC組、miR-130a-5p組、miR-130a-5p+Runx2組和miR-130a-5p+SHH組。雙熒光素酶報告驗證miR-130a-5p對Runx2、Sonic hedgehog（SHH）的調控關系；CCK-8及EdU染色檢測細胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡能力；ALP染色、茜素紅染色檢測細胞成骨分化能力；RT-qPCR檢測miR-130a-5p、Runx2、SHH、神經膠質瘤關聯癌基因同源物1（Gli1）mRNA水平；Western Blot檢測增殖細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ki67、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨形態發生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2）、Runx2、SHH、Gil1水平。結果：miR-130a-5p靶向調控Runx2、SHH。過表達miR-130a-5p后，細胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU陽性率降低，細胞凋亡率升高，成骨分化能力降低，miR-130a-5p、Bax蛋白水平升高，Runx2、PCNA、Ki67、Bcl-2、ALP、OCN、BMP2蛋白及SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平均降低（P＜0.05）。過表達miR-130a-5p和Runx2或過表達miR-130a-5p和SHH可減弱過表達miR-130a-5p對細胞增殖、凋亡、成骨分化的影響。結論：miR-130a-5p靶向Runx2抑制AOB增殖和成骨分化，并促進AOB凋亡，其可能通過抑制SHH信號通路發揮作用。

[關鍵詞]miR-130a-5p；Runt相關轉錄因子2；牙槽骨成骨細胞；Sonic hedgehog信號通路；增殖；分化；調控機制

[中圖分類號]R783.1? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）06-0051-05

Effects of miR-130a-5p Targeting Runx2 on the Proliferation and Differentiation of Alveolar Bone Osteoblasts and Its Regulatory Mechanism

ZHANG Yilin， HOU Xu， WANG Li， LANG Mecuo， LI Xiangyi

（ Department of Stomatology， West China Airport Hospital， Sichuan University， Chengdu Shuangliu First People's Hospital， Chengdu 610200， Sichuan， China ）

Abstract： Objective? To explore the effect of miR-130a-5p on proliferation， apoptosis and osteogenic differentiation of alveolar bone osteoblasts and its mechanism by targeting Runx2. Methods? AOB was divided into NC group， miR-NC group， miR-130a-5p group， miR-130a-5p+Runx2 group and miR-130a-5p+SHH group. The double luciferase report was used to verify the regulatory relationship of miR-130a-5p on Runx2 and SHH; CCK-8 and EdU staining were used to detect proliferation ability; Annexin V-FITC/PI method was used to detect apoptosis ability. ALP staining and alizarin red staining were used to detect the osteogenic differentiation ability. RT-qPCR was used to detect miR-130a-5p， Runx2， SHH and Gil1 mRNA levels. Western blot was used to detect PCNA， Ki67， Bcl-2， Bax， ALP， OCN， BMP2， Runx2， SHH， Gli1 protein levels. Results? MiR-130a-5p targeted Runx2 and SHH. After overexpression of miR-130a-5p， OD value at 24 h， 48 h and 72 h and EdU positive rate of cells were decreased， and apoptosis rate was increased. The osteogenic differentiation ability was decreased， miR-130a-5p and Bax protein levels were increased， and Runx2， PCNA， Ki67， Bcl-2， ALP， OCN， BMP2 protein levels， SHH， Gil1 mRNA and protein levels were decreased （P＜0.05）. Overexpression of miR-130a-5p and Runx2 or overexpression of miR-130a-5p and SHH could attenuate the effect of overexpression of miR-130a-5p on proliferation， apoptosis and osteogenic differentiation ability. Conclusion? MiR-130a-5p inhibits AOB proliferation and osteogenic differentiation， and promoted AOB apoptosis by targeting Runx2， which may play a role by inhibiting Sonic hedgehog signal pathway.

Key words： miR-130a-5p; Runt-related transcription factor 2; alveolar bone osteoblast; Sonic hedgehog signal pathway; proliferation; differentiation; regulatory mechanism

牙周疾病是常見的口腔疾病，能夠引起由牙周組織（如牙齦、牙槽骨）缺損導致的牙齒缺失，甚至嚴重危害口腔健康，而牙周組織缺損又會造成牙齒修復和種植困難[1]。牙槽骨是牙齒修復的基礎，成骨細胞是骨形成的主要細胞[2]。因此AOB的增殖、凋亡及成骨分化對牙槽骨的骨形成具有重要意義。微小RNA（miRNA）通過負調控靶mRNA的表達參與成骨細胞的增殖、凋亡及成骨分化等多種生物學過程[3]。一些研究表明miR-130a的異常表達與成骨分化有關[4]。如老年骨折患者血清中miR-130a表達升高，低表達miR-130a通過提高Runx2水平促進骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的成骨分化[5]。抑制miR-130a-3p水平能夠促進骨關節炎軟骨細胞的增殖和分化[6]。降低miR-130a-5p水平能夠改善因產前地塞米松暴露引起的后代大鼠的成骨分化障礙[7]。Runx2是Runx家族成員，能夠調控成骨相關基因表達和成骨細胞的增殖和分化，在骨形成和發育中起重要作用[8]。SHH信號通路在骨組織發育及細胞定向分化中扮演重要角色。研究發現Sonic hedgehog信號通路能夠促進成骨細胞和MSCs的成骨分化[9]。如敲除SHH能夠抑制BMSCs的成骨分化[10]。miR-874通過激活SHH信號通路提高骨質疏松癥大鼠BMP2、Runx2、ALP、PCNA、Bcl-2水平，降低Bax水平，從而促進骨質疏松癥大鼠成骨細胞的增殖和分化[11]。通過生物信息學分析，發現miR-130a-5p和Runx2、SHH間均存在結合位點。然而miR-130a-5p是否通過調控Runx2及SHH信號通路影響AOB增殖、凋亡及成骨分化尚不清楚。因此本研究擬探究miR-130a-5p靶向Runx2對AOB增殖、凋亡、成骨分化的影響及其機制，以期為牙槽骨缺損治療提供新的策略。

1? 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 AOB樣本來源：樣本采集對象為四川大學華西空港醫院口腔科就診患者。納入標準：①阻生牙、正畸拔除牙者；②無牙周、根尖病變及牙槽骨吸收；③未患骨代謝疾病者；④未服用影響骨代謝藥物者。患者均自愿提供牙槽骨標本。本研究經過四川大學華西空港醫院倫理委員會批準（20210213）。標本采集：取牙槽窩內壁少量牙槽骨，置于含1%青鏈霉素的低糖DMEM培養液中保存備用。

1.1.2 主要試劑和儀器：胎牛血清（美國Gibco公司）；DMEM培養基（美國Hyclone公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；ALP（上海翊圣生物科技有限公司）；過表達慢病毒質粒pHRi-miR-130a-5p及其陰性對照（pHRi-miR-NC）（上海吉瑪制藥技術有限公司）；PCNA、Ki67、OCN、SHH、神經膠質瘤關聯癌基因同源物1（Glioma associated oncogene homolog 1，Gli1）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；蛋白電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 AOB的培養和鑒定：取牙槽骨組織，經PBS溶液沖洗，剪碎（體積為1 mm3），胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅱ型膠原酶消化，離心收集骨粒。用含10%胎牛血清的DMEM培養基接種骨粒，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養，每隔72 h換液一次，當密度達到80%時，胰蛋白酶消化傳代，用反復貼壁法進行純化，取第3代AOB進行實驗。ALP染色：取第3代AOB常規培養，待細胞爬滿玻片時，加入ALP固定液孵育3 min，ALP孵育液孵育20 min，光學顯微鏡（100×）下觀察染色情況。茜素紅染色：取第3代AOB常規培養，待細胞爬滿玻片時，加入Genmed固定液孵育10 min，加入Genmed染色液孵育至橙紅色，光學顯微鏡（100×）下觀察染色情況。

1.2.2 細胞轉染與分組：將AOB分為NC組（不轉染）、miR-NC組（轉染pHRi-miR-NC）、miR-130a-5p組（轉染pHRi-miR-130a-5p）、miR-130a-5p+Runx2組（轉染pHRi-miR-130a-5p和pHRi-Runx2）、miR-130a-5p+SHH組（轉染pHRi-miR-130a-5p和pHRi-SHH）。根據LipofectamineTM3000說明書，將質粒和Lipofectamine 3000混合溶液加入AOB細胞。轉染4 h后更換培養基，24 h后通過RT-qPCR檢測是否轉染成功。

1.2.3 靶基因預測及雙熒光素酶實驗：使用Target Scan數據庫預測miR-130a-5p和Runx2、SHH的結合位點，分別構建野生型質粒psi-CHECK-Runx2-WT、psi-CHECK-SHH-WT和突變型質粒psi-CHECK-Runx2-MUT、psi-CHECK-SHH-MUT。利用LipofectamineTM3000分別將兩種質粒與miR-130a-5p mimic及miR-NC mimic混合物轉染至AOB細胞，轉染48 h后檢測熒光素酶活性。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力：將各組AOB細胞培養24 h、48 h、72 h后，將原培養液更換成含有10% CCK-8溶液的新鮮培養基。并置于37℃下孵育1 h。檢測樣品在450 nm處的吸光度。

1.2.5 ALP染色、茜素紅染色檢測細胞成骨分化能力：取各組AOB細胞，利用ALP染色、茜素紅染色檢測細胞成骨分化能力，方法同1.2.1。

1.2.6 RT-qPCR檢測細胞miR-130a-5p、Runx2、SHH、Gil1 mRNA水平：采用Trizol試劑從AOB細胞中提取總RNA并反轉錄為cDNA，使用SYBR Green法進行擴增，U6、GAPDH作內參。使用2－ΔΔCT公式計算miR-130a-5p、Runx2、SHH、Gil1 mRNA相對表達水平。

1.2.7 Western Blot檢測細胞PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、ALP、OCN、BMP2、Runx2、SHH、Gil1水平：取各組AOB胞，提取、測定并分離蛋白，轉至PVDF膜，用脫脂牛奶封閉2 h，分別加入PCNA、Ki67、Bcl-2、Bax、ALP、OCN、BMP2、Runx2、SHH、Gil1一抗（1∶2 000）4℃過夜，二抗（1∶10 000）4℃孵育2 h，ECL顯色劑顯色，凝膠成像儀拍照，分析各組蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析：使用SPSS 16.0軟件對數據進行分析。計量數據以（x?±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，多組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 AOB形態觀察和鑒定：P3代AOB形態呈三角形或梭形，形態逐漸一致。ALP染色顯示AOB產生藍紫色染色結節。茜素紅染色顯示AOB產生橙紅色鈣化結節。說明分離培養的細胞為AOB。

2.2 miR-130a-5p靶向調控Runx2：Target Scan結果顯示，miR-130a-5p與Runx2存在結合位點。熒光素酶報告基因實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組野生型Runx2熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而突變型Runx2熒光素酶活性沒有明顯變化（P＞0.05）。RT-qPCR和Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組miR-130a-5p水平明顯升高，Runx2 mRNA和蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與miR-130a-5p組相比，miR-130a-5p+Runx2組和miR-130a-5p+SHH組miR-130a-5p水平明顯降低，Runx2 mRNA和蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

2.3 miR-130a-5p靶向Runx2對AOB增殖的影響：CCK-8和Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組細胞24 h、48 h、72 h OD值及PCNA、Ki67蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與miR-130a-5p組相比，miR-130a-5p+Runx2組和miR-130a-5p+SHH組細胞24 h、48 h、72 h OD值及PCNA、Ki67蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

2.4 miR-130a-5p靶向Runx2對AOB凋亡的影響：Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組細胞Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與miR-130a-5p組相比，miR-130a-5p+Runx2組和miR-130a-5p+SHH組Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

2.5 miR-130a-5p靶向Runx2對AOB成骨分化的影響：ALP染色和茜素紅染色結果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組細胞藍紫色結節和橙紅色結節明顯減少，ALP、OCN、BMP2蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與miR-130a-5p組相比，miR-130a-5p+Runx2組和miR-130a-5p+SHH組細胞藍紫色結節和橙紅色結節明顯增加，ALP、OCN、BMP2蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

2.6 miR-130a-5p抑制Sonic hedgehog信號通路：Target Scan結果顯示，miR-130a-5p與SHH存在結合位點。熒光素酶報告基因實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組野生型SHH熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而突變型SHH熒光素酶活性沒有明顯變化（P＞0.05）。RT-qPCR和Western blot結果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-5p組SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與miR-130a-5p組相比，miR-130a-5p+Runx2組和miR-130a-5p+SHH組SHH、Gil1 mRNA和蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

3? 討論

越來越多的證據表明miRNA在成骨細胞的增殖、凋亡及成骨分化等多種生物學過程發揮重要作用[12]。研究發現，在骨關節炎軟骨細胞中，miR-130a-3p水平明顯升高，抑制miR-130a-3p水平能夠促進骨關節炎軟骨細胞的增殖和分化[13]。在骨質疏松癥小鼠BMSCs中，miR-130a水平明顯升高，抑制miR-130a水平能夠促進BMSCs的成骨分化并降低其成脂分化[14]。然而miR-130a-5p對AOB影響研究較少。本研究構建了過表達miR-130a-5p的AOB細胞模型，發現在細胞增殖和凋亡方面，與miR-NC組相比，過表達miR-130a-5p后，細胞24 h、48 h、72 h OD值及EdU陽性率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，PCNA、Ki67、Bcl-2蛋白水平明顯降低，Bax蛋白水平明顯升高。說明過表達miR-130a-5p能夠抑制AOB增殖，并促進其凋亡。在成骨分化方面，ALP是成骨分化早期標志物，能夠促進AOB礦化，直接反映成骨細胞的活性和功能情況。OCN是成骨分化晚期標志物，能夠反映成骨細胞的活性和保持骨的轉化速率。BMP2不僅能夠促進AOB分化，而且還能通過誘導AOB分泌OCN促進AOB礦化。本研究ALP染色和茜素紅染色結果顯示，過表達miR-130a-5p能夠抑制AOB細胞藍紫色結節和橙紅色結節產生，抑制ALP、OCN、BMP2蛋白表達，說明miR-130a-5p能夠抑制AOB各階段的成骨分化。