山東省谷子線蟲病的發生狀況和病原鑒定

李廣巖　白興勇　尹傳坤　梁晨　宋雯雯　史倩倩　趙洪海

摘要：近年來，山東省部分地區谷子線蟲病頻繁發生、危害嚴重。為明確山東省谷子線蟲病的病原種類，2021-2022年從山東省收集谷穗樣本9個，采用組織破碎一貝曼漏斗法分離獲得線蟲，利用形態學和分子生物學方法鑒定線蟲種類。結果發現，從臨沂、濟寧、聊城、濟南和濰坊的6個谷穗樣本中分離到植物線蟲，經形態學鑒定為同一物種，并對其為害癥狀和雌、雄蟲主要形態特征進行了描述。同時結合基于rDNA-ITS與28SD2/D3區序列構建系統發育樹和貝西滑刃線蟲（Aphelenchoides besseyi）特異性引物PCR擴增等生物學鑒定方法，最終將為害線蟲鑒定為貝西滑刃線蟲。鑒定結果為山東省谷子線蟲病的發生、分布和危害狀況的研究提供數據參考。

關鍵詞：谷子線蟲病；貝西滑刃線蟲；形態特征；分子鑒定；癥狀

中圖分類號：S435.15 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0125-07

谷子（Setaria italica）系一年生草本植物，果實脫皮后俗稱小米，是我國傳統的糧食作物，耐旱、耐瘠、耐儲存，對種植業結構調整和膳食結構改善具有重要作用。山東省谷子種植面積常年穩定在2.6萬hm2以上，主要集中在魯中山脈周邊及魯東等丘陵山區。谷子線蟲病或谷子不稔線蟲病，又稱紫穗病，俗稱“倒青”，是一種典型的種傳病害。線蟲寄生破壞子房，導致不能開花或花而不實，穎多張開，內含表面光滑有光澤的尖形秕粒，病穗瘦小，直立不下垂。受害谷子產量損失很大，發病嚴重地塊可減產60%-80%，甚至絕收。由于谷子主要種植品種均為感病品種，種子調運頻繁加之抗病品種培育困難，造成線蟲病在我國谷子產區的危害不斷蔓延且存在逐漸加重趨勢。然而，長期以來我國關于谷子線蟲病發生、為害的報道數量有限，且主要集中在河北省，山東省未見報道。

基于生產中臨沂市菖南縣發生疑似谷子不捻線蟲病，導致數個谷子田塊出現不結實的情況，本研究從山東省部分地區收集谷子線蟲病疑似病穗，并對分離到的線蟲進行系統鑒定，旨在確定山東省谷子線蟲病的發生、分布和危害狀況，為其識別診斷和有效防控提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

疑似谷子線蟲病病穗來自臨沂市費縣（LF：樣本標號，下同）、臨沂市莒南縣（LJ）、聊城市高唐縣（LG）、山東省農業科學院濟南農場（JN）、濟寧市鄒城市（JZ）、濰坊市昌邑市（WC）、淄博市臨淄區（ZL）、煙臺市福山區（YF）、德州市樂陵市（DL），共9個樣本。

1.2 研究方法

1.2.1 線蟲分離

將病穗切成小段并將谷粒研磨破碎，采用改良的貝曼漏斗法進行線蟲的定量分離。

1.2.2 線蟲計數

定量分離后，用試管接取線蟲懸浮液10mL，充分搖勻后用移液器吸取0.5mL滴于載玻片上，在解剖鏡下計數液滴中的線蟲數量，重復3次，取平均值后折算出10mL線蟲懸浮液中的線蟲數量，最后計算每克谷穗組織中的線蟲數量，即病穗線蟲群體密度。

1.2.3 形態學鑒定

將線蟲溫和熱殺死后，在O-lympus雙目實體解剖鏡下挑取目標線蟲，以水作浮載劑制成臨時玻片標本，利用Zeiss顯微鏡及配套軟件對線蟲標本進行形態特征觀察、拍照及測量。按照DeMan公式計算比值特征。

1.2.4 分子生物學鑒定

參考容萬韜等的方法提取單條線蟲的DNA，以引物D2A/D3B擴增線蟲28S rRNA D2/D3區片段，以引物TW81/AB28擴增線蟲rDNA ITS區片段。PCR反應體系為25μL：線蟲DNA模板2μL，10xPCR Buff-er（Mg2+）2.5μL，dNTP MIX 2μL，上、下游引物各2μL，ddH2O 14μL，rTaq酶0.5μL。PCR擴增程序參照文獻[13]。PCR擴增產物經回收克隆后交由上海生工青島分公司測序。

1.2.5 系統發育分析

將測序后的結果在NCBI數據庫中進行Blast分析，下載序列。運用MECA 7.0軟件中的ClustalW進行序列比對，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.6 特異性引物檢測

參照林宇等的方法，用貝西滑刃線蟲28S rRNA D2/D3區特異性引物GU-F（5'-GACACTGCAATCGCTTCGAC-3）與GU-R（5-ATCCGCAACCACAACTCACA-3'）對供試線蟲群體的DNA進行PCR擴增。PCR反應體系同1.2.4，其中GU-F和GU-R各2μL。PCRkuo增程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，35個循環：72℃7min；4℃保存。以貝西滑刃線蟲DNA為陽性對照，燕麥真滑刃線蟲（Aphelenchus avenae）DNA為陰性對照，ddH2O為空白對照。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2003對數據進行整理，利用SPSS軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 線蟲分離

從LJ、LF、LC、JN、JZ和WC共6個樣本中分離出植物線蟲，初步觀察發現均屬于滑刃線蟲屬（Aphelenchoides），其他樣本中未分離出植物線蟲。6個樣本問線蟲群體密度存在很大差異，從大到小依次為JN、LG、WC、LF、IJJ和JZ（表1）。

2.2 癥狀觀察

受害較輕的谷穗，部分穎殼松裂，局部呈紫紅色，穗部頂端瘦小、蓬松，部分籽粒癟秕，成熟期在田間一般下垂。受害較重的谷穗，整體短小、蓬松，頂部蓬松尤其嚴重：大部分谷粒癟秕，秕粒尖形、光滑、有光澤：穎殼開張，呈紫紅色：與健康谷穗相比重量明顯較輕，成熟期在田間常常直立（圖1）。

2.3 形態學鑒定

通過系統的形學觀察和測量，發現6個線蟲群體的形態特征基本一致，初步鑒定為貝西滑刃線蟲（A.besseyi Christie，1942）。雌蟲和雄蟲的測量數據及其與原始文獻數據和國內學者測量數據的比較分別見表2和表3。

雌蟲形態特征（圖2）：經溫和熱殺死后蟲體略向腹面彎曲，蟲體細長，平均長度約為720μm（圖2A），側區約占蟲體寬度的1/4，具有4條側線（圖2C）。唇區嘲，稍有縊縮，口針稍細弱，長度約為12μm，基部球小。中食道球大而明顯，近長方形，長約14μm，寬約9μm，瓣門明顯，位于中食道球中部偏后。食道腺長葉狀，從背面覆蓋腸（圖2B）。陰門橫裂且陰門唇稍凸起。單卵巢，受精囊長卵圖形。后陰子宮囊窄而長，長度約為陰門處體寬的2.5-3.5倍（圖2E）。尾長約為40μm，尾呈圓錐形，末端腹突具有3-4個細小的星狀尖突（圖2D）。

雄蟲形態特征（圖3）：經熱殺死后蟲體略向腹面彎曲，體長較雌蟲短，平均約550μm（圖3A）。蟲體前部特征與雌蟲基本相似（圖3B）。交合刺呈玫瑰刺狀，長約16μm，基部無頂尖，喙突中等發達，尾末端具有2-3個星狀尾尖突，尾部具3對尾乳突（圖3D）。

2.4 系統發育分析

采用線蟲ITS區通用引物TW81/AB28雙向測序后進行序列拼接，比對后得到序列長度約為825bp，上傳至CenBank獲得登錄號OQ476763、OQ711739。采用28S D2/D3區引物雙向測序后進行序列拼接，比對后得到序列長度為787bp，上傳至GenBank獲得登錄號OQ476877、OQ723791。基于ITS和28S D2/D3序列構建的系統發育樹（圖4）表明，山東谷子滑刃線蟲群體與GenBank數據庫中已登錄的5個貝西滑刃線蟲的序列聚于同一個大的分支，相似度均為100%。

2.5 特異性引物檢測

采用貝西滑刃線蟲特異性引物GU-F/GU-R對山東谷子滑刃線蟲群體與貝西滑刃線蟲群體進行PCR擴增（圖5），結果顯示，山東谷子滑刃線蟲群體擴增條帶為279bp，符合貝西滑刃線蟲特異性引物擴增條帶長度，而陰性對照燕麥真滑刃線蟲與空白對照（ddH2O）則無條帶出現。最終將山東谷子線蟲群體鑒定為貝西滑刃線蟲。

3 討論與結論

貝西滑刃線蟲是一種葉芽線蟲，以外寄生的方式取食植物地上部分，是對水稻最具破壞性的植物線蟲之一，常被稱為水稻干尖線蟲。其寄主范圍廣，包括水稻、谷子、草莓、大豆等200多種植物，被認為是世界十大最重要的植物寄生線蟲之一，是非常重要的植物檢疫病蟲，被世界70個國家列為限定性有害生物20。20世紀50年代到60年代，陳善銘等對北京市和河北省定縣、安國縣谷子線蟲病的病原線蟲種類、寄生方式、生活史等進行了較為系統的研究，指出我國谷子線蟲病的最早記載可追溯到1916年。20世紀70年代，谷子線蟲病在京津冀地區有零星發生，由于長期種植感病品種，又逢發病適宜氣候條件，1982年，河北青縣和天津武青縣谷子線蟲病大發生，造成嚴重產量損失。王金成等對從河北省谷子中分離的滑刃線蟲種群進行了形態學和分子生物學鑒定，提供了河北谷子中貝西滑刃線蟲的分子數據。Chen等首次對分離白河南省谷子的貝西滑刃線蟲進行了報道。目前，對山東省谷子線蟲病較為系統的調查研究和報道近乎空白。

貝西滑刃線蟲在谷子播種后主要在種殼和秕粒內活動，少量進入胚根和幼芽，拔節期后轉移到葉鞘進行繁殖，待幼穗形成后轉移至穗部為害并進行大量繁殖。目前認為，寄生谷子和水稻的貝西滑刃線蟲是同種線蟲的2個不同的生理型。高丙利研究表明，寄生水稻的貝西滑刃線蟲可在田間的谷殼內存活4個月，但不能在土壤中長時間存活。白峰、劉維志和張麗英等認為寄生谷子的貝西滑刃線蟲可以在土壤中存活。根據Christie的研究，在美國北卡羅來納州貝西滑刃線蟲的草莓型也可以在土壤中存活。陳善銘等用兩種線蟲在谷子和水稻上進行交互接種試驗，發現原寄生于谷子上的貝西滑刃線蟲對水稻侵染較少，原寄生于水稻上的貝西滑刃線蟲對谷子的侵染也較少。因此關于貝西滑刃線蟲不同生理型之間的關系、土壤存活性以及葉穗寄生偏好性的差異等問題尚需進一步研究。

本研究對從山東部分地區谷子病穗中分離得到的線蟲群體通過形態學與分子生物學相結合的方法進行了鑒定，明確了山東省谷子線蟲病的基本發生狀況和病原種類，屬首次針對山東省谷子線蟲病的調查研究和報道。山東省是我國重要的谷子產區，本研究結果為山東省谷子線蟲病的鑒定診斷提供了較為詳細的數據信息，可為谷子線蟲病的科學認識和防控提供指導。

基金項目：山東省重點研發計劃（重大科技創新工程）項目專題（2022CXGC020710-6）；黃三角國家農高區省級科技創新發展專 項資金項目（2022SZX23）