春大白菜可溶性糖代謝及轉運相關基因表達模式分析

陳熙　程斐　倪潤茂　劉維信　劉倩倩

摘要：以春大白菜品種‘吉錦和‘華耐為材料，探索了春大白菜從幼苗期到葉球收獲期的整個發育過程中可溶性糖類的積累變化規律及相關代謝酶和轉運蛋白基因的表達模式。結果表明：在春大白菜發育過程中，可溶性總糖和葡萄糖在蓮座期和結球初期快速積累，葡萄糖積累占優勢，果糖則在結球后期結球葉的葉柄中含量快速增加。蓮座葉和結球葉的柄部都是可溶性糖積累的重要部位；蔗糖合酶基因BrSUS1與兩個品種葉柄中可溶性糖積累密切相關。分解蔗糖的酶基因BrSUS5、BrSUS6、BrCINV2及糖轉運蛋白基因BrSUC4、BrTMT1、BrSWEET17、BrERDL6-16均在葉柄部位活躍表達，不同程度參與兩個白菜品種的可溶性糖積累和分布。BrERDL6-16在兩種白菜結球后期多個部位中的表達量急劇升高，可能在促進大白菜葉球發育中發揮特殊作用。本研究結果可為從分子水平調控大白菜可溶性糖積累分配及產量形成提供理論依據。

關鍵詞：春大白菜：可溶性糖代謝與轉運：基因表達

中圖分類號：S634.1：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0019-13

大白菜是十字花科蕓薹屬蔬菜作物，不僅口感好且具有一定藥用價值，在我國各地廣泛栽培。春大白菜是大白菜的重要栽培類型，能夠調節蔬菜的淡季供應，且市場價格高、效益好，但當前春大白菜的營養和風味品質仍不能滿足消費者日益提升的需求。喬旭光等在對大白菜風味相關指標的通徑分析中指出，可溶性糖對大白菜的感官品質影響最大。園藝產品中的甜味主要取決于可溶性糖的類型和組成。蔗糖是可溶性碳水化合物的主要長距離運輸形態，葡萄糖、果糖是參與蔗糖代謝的主要糖類。Liu等研究發現秋冬季收獲的大白菜葉球中葡萄糖、果糖含量高于蔗糖，且果糖的積累量高于葡萄糖。但春大白菜生長前期溫度偏低，后期溫度又快速升高，適合春大白菜生長的時間較短，其可溶性糖類積累可能與秋季播種的大白菜不同。目前對春大白菜的研究主要集中于溫度對生長的影響、耐抽薹品種選育及栽培管理技術的提升等方面，缺少對其碳水化合物積累和分布的系統研究，而明晰春大白菜的可溶性糖代謝及相關基因功能將有助于從生理及分子水平對大白菜葉球產量及品質形成進行調控。

光合產物蔗糖從源到庫的運輸是植物生長的主要決定因素之一，不僅可通過韌皮部運輸實現植物器官之間的碳分配，而且蔗糖在庫端卸載時被酶解為己糖，為植物組織的生長提供動力。因此糖代謝酶及糖轉運相關基因在植物的能量供應和物質存儲中發揮重要作用。大白菜有表面褶皺的葉片及寬大的中脈（葉柄），Lee等通過研究大白菜蓮座葉的葉片和葉柄中淀粉和蔗糖的日分布變化認為，大白菜源庫代謝存在于同一片葉中，除了跨膜運輸，葉柄組織可能直接通過共質體途徑（胞間連絲）獲取部分光合產物。但已有的針對局部組織的研究結果不能從整體上反映大白菜發育過程中糖類的積累和分配。

本研究選取不同結球類型的春大白菜，對幼苗期到收獲期不同位置葉組織中可溶性糖類的積累動態進行探究，并分析蔗糖代謝酶和糖轉運蛋白相關基因在轉錄水平上的變化與大白菜可溶性糖積累的關系，為從分子水平調節大白菜可溶性糖積累與分配進而提升大白菜品質及產量提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和樣品采集

試驗材料為中型結球大白菜‘吉錦和小株型大白菜‘華耐，于2021年3月25日在青島農業大學試驗田露地播種。小區面積160m2（10m×16m），采用隨機區組排列，最終株行距為6cm×6cm。所有材料的水肥、除蟲管理均采用同一標準控制。

根據春大白菜的不同發育階段，分別于幼苗期（播種后26天，記為26DAS）、蓮座期（44DAS）、結球初期（54DAS）、結球后期（67DAS）采集樣本。其中，幼苗期取2-3片幼嫩葉片（L，leaf）；蓮座期、結球初期取由外到內第1-3片蓮座葉的葉片（external leaf，EL）和葉柄（external midrib.EM），以及由內到外第4-6片葉（長度超過3cm）的葉片（internal leaf，IL）和葉柄（internal midrib，IM）；結球后期IL、IM、EL、EM的取樣同蓮座期，另取外部1-3片球葉的葉片（middle leaf，ML）和葉柄（middle midrib，MM）。采樣均在上午10時進行，設3次重復：采集的樣品迅速置于液氮中冷凍，并帶回實驗室在-80℃儲存，以備可溶性糖含量測定和qRT-PCR分析。兩個春大白菜品種不同時期的形態見圖1。

1.2 可溶性糖類含量的測定方法

可溶性總糖含量通過蒽酮比色法測定。蔗糖、葡萄糖和果糖參照Liu等的方法采用高效液相色譜（HPLC）法進行測定，所有樣品均經過冷凍干燥。

1.3 糖代謝及轉運相關基因的表達分析

根據青島農業大學十字花科蔬菜遺傳育種實驗室已獲得的大白菜葉球轉錄組數據，以log2（Fold change）≥1.0和FDR＜0.01為標準，選取在大白菜葉球不同部位表達有差異的23個糖代謝和轉運相關基因進行qRT-PCR分析。使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取樣品的總RNA，取1μg RNA，用Prime ScriptTMRT試劑盒合成cDNA。使用羅氏480實時PCR系統在標準模式下進行qRT-PCR。PCR反應體系為20μL：2xSYBR Creen I Master 10 μL，1：10稀釋的cDNA 2μL，正、反向引物各0.4μL和雙蒸餾水7.2μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃15 s.60℃30 s，72℃30 s，45個循環。選擇延伸因子-1-α（EF-1-α，登錄號為G0479260）作為參考基因。使用軟件Primer Primier 6.0（Premier Biosoft Inc.）設計特異性引物，引物序列見表1。試驗設置3次重復，用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 22.0進行單因素方差分析（ANO-VA），用最小顯著性差異（LSD）法進行多重比較，顯著性水平為0.05。所有圖表均使用OriginPro 8和Microsoft Excel 2010進行繪制。

2 結果與分析

2.1 大白菜發育過程中的可溶性糖類含量變化

‘吉錦和‘華耐不同部位的可溶性總糖含量在整個生育期的變化相似（圖2A、B）。蓮座期至葉球形成階段，葉柄中的可溶性總糖含量均顯著高于相應部位的葉片：結球后期兩個品種外部球葉和內部球葉的葉柄（MM和IM）中可溶性總糖含量達到最高，且差異不顯著。

與葉片相比，兩個春大白菜品種葉柄的葡萄糖和果糖含量也占優勢，表現出部位特異性（圖2C、D、E、F）。幼苗期后，春大白菜中葡萄糖的積累量總體高于果糖。葉柄中的葡萄糖含量均顯著高于相應葉片中的。結球后期，葡萄糖在兩個品種內部球葉的葉片（IL）及‘華耐內部球葉的葉柄中（IM）積累量升高，果糖則在結球后期的內部葉柄（IM）中均顯著上升。

蔗糖含量在兩個大白菜品種整個生長階段均處于極低水平，不超過組織干重的3%，且在最外部蓮座葉的葉片（EL）及內部球葉的葉柄（IM）中含量較高（圖2G、H）。說明蔗糖在大白菜主要光合葉（蓮座葉）中合成，運輸到生長旺盛的部位后被快速利用。

2.2 春大白菜發育過程中蔗糖代謝相關基因的表達模式分析

qRT-PCR分析結果（圖3）顯示，進入蓮座期（44DAS）后，負責蔗糖卸載的蔗糖合酶基因Br-SUS1在兩個春大白菜品種葉柄中的表達均顯著上調，其中，‘吉錦在結球初期（54DAS）的IM中表達量最高，是蓮座期IM中的2.70倍，在結球后期（67DAS）IM中的表達量次之，兩者間差異不顯著：‘華耐則在結球后期IM中的表達量顯著上升。BrSUS5和BrSUS6的表達也表現出一定的組織特異性，在‘華耐中尤其明顯，表現為葉柄中的表達量高于相應部位的葉片，以蓮座期和結球初期蓮座葉的葉柄（EM）中表達量較高。

轉化酶基因BrCWI3、BrINV4和BrINVC在兩個春大白菜品種中的表達呈現不同的變化趨勢，且BrCWI3、BrINV4在‘吉錦中的表達量高于‘華耐，而BrINVC在‘華耐結球后期的表達量較高。其中，BrCWI3分別在‘吉錦結球初期的EL及‘華耐結球后期的MM中顯著上調表達：Br-INV4和BrINVC分別在‘吉錦和‘華耐結球后期的MM和ML中顯著上調表達，而在內部球葉（IL和IM）中的表達量始終保持較低水平。

細胞質中的BrCINV2基因從蓮座期開始在兩個春大白菜品種各部位葉片的葉柄中表達量迅速升高，在結球后期保持較高水平。負責蔗糖合成的BrSPS1和BrSPS4在蓮座葉的葉片（EL）中具有顯著的表達優勢，而在內部球葉的葉柄中幾乎不表達：進入結球后期，兩基因在EL中的表達水平顯著下降，但在ML中的表達量顯著升高，這可能與該時期外部球葉承擔主要的光合作用有關。

2.3 春大白菜發育過程中糖轉運蛋白相關基因的表達模式分析

2.3.1 蔗糖轉運蛋白基因BnSUCs

對大白菜蔗糖轉運蛋白基因（BrSUCs）家族4個成員——BrSUC1、BrSUC2、BrSUC3和BrSUC4的表達情況進行分析，結果如圖4所示?？梢?，BrSUC1在‘吉錦蓮座葉的葉片（EL）中表達量顯著高于同時期其他部位，且在結球初期的表達量最高，是幼苗期葉片（L）中的7.07倍，其次是結球后期（67DAS）；‘華耐中BrSUC1在結球后期的EL中表達量最高，而在內部球葉中的表達水平較低。BrSUC2主要在春大白菜葉片中表達，但在兩品種中的表達水平總體偏低，相較于幼苗期（L），僅‘吉錦蓮座期和葉球形成期EL中的表達量顯著上調，而在內部球葉的葉柄中幾乎不表達。進入蓮座期后，BrSUC3和BrSUC4在‘吉錦各部位的表達量迅速升高，顯著高于幼苗期，且分別在結球后期的ML和結球初期的EM中表達量最高：在‘華耐中，BrSUC3和BrSUC4的表達量在結球初期也開始增加，且均在結球后期的MM中表達量最高。說明蔗糖轉運蛋白能夠加強光合產物的運輸，在大白菜葉球發育過程中發揮作用。

2.3.2 糖轉運蛋白基因BrSWEETs

分析了4個糖轉運蛋白基因BrSWEET1、BrSWEET11、Br-SWEET12、BrSWEET17在兩個春大白菜品種中的表達差異，結果如圖5所示。

SWEET1蛋白具有雙向轉運葡萄糖的功能。BrSWEET1在兩個春大白菜品種中的表達呈現明顯的組織特異性，即在各時期葉片中的表達量均顯著高于葉柄中，且以結球后期內部球葉的葉片中表達水平最高。

BrSWEET11和BrSWEET12主要負責在韌皮部裝載蔗糖向外輸出。兩個基因在‘吉錦蓮座期和結球初期的EL中大幅上調表達，相對表達量顯著高于幼苗期。Br.SWEET11在蓮座期和結球初期表達量分別是幼苗期的36.68倍和43.57倍，而BrSWEET12則分別達到57.67倍和81.51倍，表明兩基因在‘吉錦，快速生長期將光合產物從源葉輸出的過程中發揮重要作用。在小株型春大白菜‘華耐中，BrSWEET11和BrSWEET12也在光合葉片（EL和ML）中表達占優勢，但相比于幼苗期，BrSWEET11在蓮座期和葉球形成期顯著下調表達，BrSWEET12在蓮座期和結球初期的EL和結球后期的ML中顯著上調表達，在ML中的表達量最高，但僅是幼苗期的1.96倍。

BrSWEET17定位在液泡膜上，能夠向液泡外輸出果糖，從而維持細胞內部果糖的穩態。Br-SWEET17在兩個春大白菜品種快速生長期（蓮座期和結球初期）的蓮座葉葉柄（EM）中大量表達，尤其在結球初期的EM中，表達量可達幼苗期L的140倍（‘吉錦）和70倍（‘華耐）。在結球后期，該基因的表達量迅速下降，但仍以葉柄中的表達量高于葉片中。說明BrSWEET17對果糖的分配調節在大白菜生長及葉球形成過程中也發揮著重要作用。

2.3.3 單糖轉運蛋白相關基因

單糖轉運蛋白STP1主要在葡萄糖吸收中發揮作用，H+/葡萄糖同向轉運體ERDL6負責向液泡膜或質膜外輸出葡萄糖，PGLCT4則參與葡萄糖輸出：TMT是液泡膜單糖轉運蛋白，能夠將己糖和蔗糖轉入液泡。對這些單糖轉運蛋白基因在兩個春大白菜品種中的表達模式進行分析，結果（圖6）顯示，BrSTP1在兩個品種蓮座葉和外部球葉的葉片中表達量上升。BrPGLCT4在‘吉錦，快速生長期的EL中表達量增加幅度較大，而在‘華耐中則是葉球形成期IL中的表達量較高，兩者分別在蓮座期的EL和結球初期的IL中達到最高。BrTMT1在兩個品種快速生長期的EM中表達量較高：對于‘華耐，內部球葉葉柄中的表達水平也有升高：結球后期葉球內部各組織中該基因的表達量較幼苗期顯著上升。BrTMT2在‘吉錦蓮座葉片（EL）及外部結球葉（ML和MM）中的表達量顯著升高，其余部位較幼苗期表達水平變化不大：而在‘華耐各組織中，BrTMT2表達量相對較低，且整個發育時期相對穩定。BrERDL6-4在‘吉錦不同生長時期的表達變化無明顯組織特異性，在結球初期的EL、蓮座期的EM和結球后期的ML中表達量顯著高于幼苗葉中：而在‘華耐中，幼苗期后該基因在植株中的表達量顯著降低，尤其結球后期在各部位的表達均處于極低水平。BrERDL6-16在兩個品種結球后期的EM、ML、MM中表達量超過幼苗期的1000倍以上，其中，‘吉錦ML和‘華耐EM中的表達量分別是幼苗期葉片中的2772倍和4060倍，IM中的表達量也升高了3（X）-500倍：在‘吉錦蓮座期和結球初期的EM中，BrERDL6-16表達量也顯著升高，較幼苗期分別增加了90.48倍和226.56倍。

2.4 可溶性糖積累和糖代謝及轉運相關基因的相關性分析

基于上述基因表達結果，進一步利用Pearson相關性分析方法研究這些酶和轉運蛋白基因的表達與大白菜發育過程中可溶性糖含量變化之間的關系。結果（圖7）顯示，兩春大白菜品種的果糖、葡萄糖均與總可溶性糖積累呈極顯著正相關（P<0.01）。在‘吉錦中，BrSUS1與總可溶性糖含量的變化呈極顯著正相關，BrSUS1和BrSWEET17與葡萄糖含量的變化呈顯著正相關（P<0.05）；此外，部分酶基因（BrSUS5、BrSUS6、BrINV4、BrCINV2）與轉運蛋白基因（BrSUC3、BrSUC4、BrT-MT1、BrERDL6-16）的表達也與可溶性總糖含量變化存在正相關關系。在‘華耐中，BrSUS1的表達與可溶性總糖及各組分含量的正相關性均達到極顯著水平，BrSUS5、BrTMT1與可溶性總糖、葡萄糖和蔗糖含量變化均顯著正相關，BrSUS6、BrCINV2與可溶性總糖和蔗糖含量變化顯著正相關，BrSUC3、BrSUC4則均與可溶性總糖含量的變化顯著正相關。綜合來看，在兩個品種春大白菜生長發育過程中，BrSUS1與可溶性糖卸載與積累密切相關，其余代謝酶及蔗糖和單糖轉運蛋白基因也不同程度參與大白菜葉片發育過程中糖的轉化與運輸，但這些基因在在不同結球類型的白菜中發揮作用的階段和程度存在差異。

3 討論與結論

3.1 春大白菜發育過程中可溶性糖的積累特征

植物通過光合作用將無機碳同化為糖類來滿足生長發育的能量需要。本研究對中型結球春大白菜‘吉錦和小株型春大白菜‘華耐生長發育過程中糖類的積累及分布規律進行分析發現，在大白菜的快速生長階段（蓮座期和結球初期），可溶性總糖含量在葉柄部位均快速積累，而能夠進行光合作用的葉片部位如EL、IL中的可溶性總糖含量始終穩定在較低水平。說明大白菜光合組織中固定的碳大部分輸出到生長旺盛的部位用于組織的生長發育，這與擬南芥中的報道相似。在去除水分的組織樣品中，蓮座葉的葉柄（EM）與內部球葉的葉柄（IM）都是可溶性總糖分布的優勢部位，在快速生長期EM中的含量甚至超過內部組織。這與前期我們以新鮮樣品獲得的研究結果不同，這主要是因為EM和MM中含水量可達90%，因此在葉球形成過程中相應的可溶性糖含量的鮮重占比遠低于內部球葉，不超過1.5%。從碳水化合物的積累來說，本研究結果進一步反映出大白菜外部葉柄作為庫組織的重要地位。大白菜葉柄部著生于短縮莖上，短縮莖先端是細胞分裂及葉形態建成最活躍的區域。光合葉片合成的蔗糖能夠在同一片葉的柄部快速卸載，并近距離轉運到短縮莖及根部，因此蓮座葉包括外部結球葉的葉柄既是庫組織，也是糖類向其他異養組織輸出的重要部位。

兩個春大白菜品種整個生長過程中以葡萄糖和果糖積累為主，葡萄糖積累占優勢，蔗糖積累則始終保持在較低水平。而在擬南芥中，蔗糖是蓮座葉中的主要糖類，其次為葡萄糖。大白菜植株體積大，葉片多，生長周期短，推測光合組織中合成的蔗糖被快速輸出的同時，蓮座葉自身生長也會消耗大量光合產物，因此蔗糖在整個時期積累量較低。在兩個春大白菜品種蓮座期至結球后期（收獲期）的葉柄中葡萄糖始終保持穩定的含量，可占到干重的20%。葡萄糖是經植物光合作用產生的可直接利用的糖類，也是儲存能量的重要來源。本研究結果顯示，葡萄糖在春大白菜蓮座期、結球期初期和后期的葉柄中均具有較高的積累量，可為生長發育旺盛的庫組織提供持續的能量供給。果糖作為蔗糖分解的另一種己糖產物，在收獲期春大白菜葉球組織中的含量顯著升高?？扇苄钥偺窃诮Y球后期的球葉柄部（MM和IM）積累量達到最高水平，推測與該時期果糖迅速積累相關。成熟期果糖的積累對桃果實甜度起著重要的作用。因此，若要提升大白菜葉球的甜度口感，可以針對葉球中果糖的代謝調節展開研究。

3.2 蔗糖代謝相關酶基因及轉運蛋白基因在春大白菜生長發育過程中的作用差異

負責蔗糖合成、分解的相關酶類在光合產物轉化及利用中起到關鍵作用。在梨和葡萄中，SUS1主要在未成熟果實中負責蔗糖分解，并為細胞壁構建或糖酵解提供底物。與大白菜秋季結球過程中的表達模式相似，BrSUS1作為重要的蔗糖庫端卸載酶，在春大白菜葉柄中有顯著的上調表達，并與可溶性糖積累顯著正相關，因此，調控BrSUS1的表達，可能對調節大白菜葉球發育及產量產生重要影響。多個蔗糖轉化酶基因在兩個春大白菜品種中的表達模式不同，但除胞質轉化酶基因BrCINV2外，其余轉化酶基因在內部球葉組織（IL和IM）中的表達量均較低，與SUS基因發揮作用的部位存在差異。進入蓮座期后，BrCINV2在兩個春大白菜品種葉柄及內部球葉的葉中表達量均快速升高，推測其在維持大白菜光合產物卸載利用中也具有積極意義。在擬南芥中，AtCINV2可能在維持植株正常生長并將固定的碳向非光合組織供應方面發揮重要作用。因此，BrCINV2對春大白菜生長發育的影響值得進一步研究。

糖從源到庫的運輸以及胞內糖的分配利用也是植物生長的主要決定因素之一。整個植物體碳水化合物的分配需要膜上特定糖轉運蛋白發揮作用，蔗糖轉運蛋白SUCs以及SWEETII和SWEET12主要負責蔗糖的韌皮部裝載及轉運。在本研究中，在春大白菜快速生長期，BrSUC1-BrSUC4、SWEET11和SWEET12在外部葉組織中表達水平升高，可能不同程度地參與了蔗糖的源端裝載。隨著春大白菜植株的不斷生長，上述基因表達量在‘吉錦中上升的幅度均大于小株型白菜‘華耐，推測葉球較大的白菜類型需要更高效的蔗糖裝載及輸出才能滿足植株快速發育的需求，這為后續大白菜生長發育調控的研究提供了一個新的角度。進入結球后期，BrSUC4在‘吉錦外部和內部不同葉組織中表達水平都有提升，在‘華耐中也整體升高。AtSUC4在擬南芥源葉的次級葉脈中高水平表達，負責該部位蔗糖的高通量裝載與運輸，在庫端組織如幼葉、花和果實中也表達活躍，負責蔗糖吸收。BrSUC4可能在大白菜結球過程中發揮著多方面的作用。

在負責己糖轉運的蛋白中，SWEET17能在液泡膜上順濃度梯度輸出果糖，調節胞質中的果糖穩態，而TMT1是胞質葡萄糖穩態所必需的，參與液泡單糖轉運。BrSWEET17和BrTMT1在快速生長期的春大白菜葉柄部位表達量占優勢，可能在大白菜庫組織的己糖儲存與利用中發揮作用。ERDL6-16屬早期響應干旱類似蛋白（ERDL6）家族，是液泡膜上的另一類糖轉運蛋白，該類蛋白主要負責液泡中葡萄糖的外排，參與植物響應脅迫及體內糖的穩態和積累。BrERDL6-16在兩個類型春大白菜結球過程中均有異?；钴S的表達，尤其在結球后期的EM、ML、MM中表達量上調1000-4000倍，推測其可能對葉球發育過程中的能量分配與利用具有重要影響。

綜上所述，蓮座葉和結球葉的葉柄是春大白菜重要的庫器官。葡萄糖在葉柄中快速積累，保證了生長旺盛的庫組織的穩定能量供給：成熟期果糖的積累提升了春大白菜葉球可溶性糖的總含量；蔗糖分解酶和糖轉運蛋白都參與了大白菜可溶性糖的代謝，但發揮作用的階段和程度存在差異。本研究結果可為大白菜品質及產量調控提供理論依據。

基金項目：中央引導地方科技發展專項計劃項目（23-1-3-5-zvvd-nsh）；山東省重點研發計劃項目（2019GNC106009）；山東省農 業良種工程項目（2019LZGC006）