中藥活性成分誘導的鐵死亡在骨肉瘤中的研究進展

劉 鑫，黃藝云，楊燕妮，段辛威，鄭春松，3

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是臨床上好發于兒童與青少年長骨干骺端的惡性骨腫瘤，其轉移性患者5年生存率僅約20%，且術后復發率高達70%以上，具有致死率高、易轉移等特點［1-2］。目前骨肉瘤常用的治療手段為手術輔以化療，但遠期效果不理想，且化療過程中存在耐藥性強、毒副作用多等問題，嚴重危害患者身心健康和預后［3］。因此，深入研究骨肉瘤發生發展的分子機制和新的治療方法顯得尤為重要。

研究顯示，鐵死亡作為一種新型細胞死亡方式，與骨肉瘤的發生、發展密切相關，誘導鐵死亡在抑制腫瘤發生發展與逆轉藥物耐藥性等方面有顯著效果，有望成為骨肉瘤治療的新策略［4-5］。一些中藥活性成分（如青蒿素、姜黃素等）可靶向誘導鐵死亡，達到治療骨肉瘤的目的［6-12］。因此，本文針對鐵死亡在骨肉瘤中的作用及中藥誘導鐵死亡治療骨肉瘤進行綜述，旨在為鐵死亡在骨肉瘤的深入研究與藥物研發提供借鑒與參考。

1 鐵死亡

2008年，YANG W S等［13］通過體外篩選抗癌小分子時，發現RSLs和erastin誘導的細胞死亡和常見細胞死亡方式（凋亡、壞死、自噬）不同，這些誘導劑并沒有引發自噬小體及凋亡小體形成，且抑制劑的使用不能逆轉其誘導的細胞死亡。繼而，在2012年DIXON S J等［14］提出了鐵死亡的概念，他們認為這種細胞死亡方式與常見的細胞死亡方式完全不同，是細胞受到鐵離子紊亂的影響，導致細胞內鐵的積累和氧化應激反應增強，最終引發細胞死亡。即鐵死亡作為一種新型的細胞程序性死亡方式，在生物化學成分上以膜脂質過氧化為特征，在細胞形態上以雙層膜變厚及線粒體體積變小為標志。

目前，探索腫瘤發生機制及尋找治療靶點主要在誘導鐵死亡的途徑上［15-16］。誘導鐵死亡的途徑主要包括3類：⑴耗竭/降低谷胱甘肽（Glutathione，GSH）：系統Xc-（跨膜氨基酸轉運體）是由溶質載體家族7成 員11（Recombinant solute carrier family 7, member 11， SLC7A11)和溶質載體家族3成員2（Recombinant solute carrier family 3, member 2， SLC3A2）組成的一種跨膜氨基酸轉運體［17］，阻塞系統Xc-降低還原性GSH合成，促進活性氧（Reacyive oxygen species，ROS）積累，導致鐵死亡［18］。2015年，JIANG L等［19］研究發現，p53蛋白可以抑制SLC7A11表達，影響GSH活性，誘導U2OS細胞發生鐵死亡。⑵直接抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4，GPX4）：對于調控鐵死亡GPX4具有重要作用，直接抑制GPX4可誘導骨肉瘤細胞鐵死亡。LIU Q等［20］發現轉鐵蛋白受體1（Transferrin receptor protein，TFR1）能夠通過抑制核因子E2相關因子（Nuclear factor erythroid，Nrf2）/GPX4信號通路誘導骨肉瘤發生鐵死亡，同時它聯合順鉑和谷胱甘肽過氧化物酶4抑制劑RSL3（鐵死亡激動劑）等能夠降低骨肉瘤細胞對順鉑的耐藥性，有望成為治療骨肉瘤的新靶點［4］。⑶干擾鐵穩態：誘導骨肉瘤細胞鐵死亡與鐵穩態密切相關。TFR1是鐵吸收的主要蛋白，TFR1的表達增加，將會對骨肉瘤細胞的生長和耐藥性產生影響。WU H等［21］發現在骨肉瘤中，TFR1表達明顯增高且高表達的患者預后差，可為TFR1作為未來治療骨肉瘤的靶點提供理論依據。

2 鐵死亡在骨肉瘤中的作用

鐵死亡的相關基因已應用于骨肉瘤研究中，如COL2A4、HOXB5和轉錄激活因子4（Recombinant activating transcription，ATF4）等能夠在骨肉瘤細胞增殖、化療耐藥、轉移、免疫等方面起重要作用，有望為骨肉瘤治療提供新思路［22］。

2.1 抑制骨肉瘤細胞增殖任天豪［23］發現唑來膦酸可通過誘導鐵死亡抑制骨肉瘤細胞增殖。LV H等［24］在探討β-苯乙基異硫氰酸酯（β-Phenethyl isothiocyanate，PEITC）對骨肉瘤的影響時發現，PEITC能夠改變鐵代謝的過程，增加細胞內的不穩定鐵含量，激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，誘導骨肉瘤細胞鐵死亡，抑制骨肉瘤細胞增殖。以上研究均表明鐵死亡可影響骨肉瘤細胞增殖。

2.2 逆轉骨肉瘤細胞化療耐藥LIU Q等［20］發現，低劑量順鉑可能對順鉑耐藥性骨肉瘤細胞的鐵死亡有一定的作用，鐵死亡誘導劑、信號轉導因子和轉錄活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制劑可以使耐藥細胞內的鐵死亡過程被重新激活，降低細胞對順鉑的耐藥性，其機制與下調Nrf2和GPX4的表達相關。這一發現為骨肉瘤提供了新的研究方向。除此之外，將骨肉瘤順鉑耐藥細胞株用鐵死亡誘導劑處理后發現，GPX4等鐵死亡負調控因子水平顯著下調，ROS等鐵死亡相關因子水平顯著上調，同時還增強了骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性。因此，誘導鐵死亡是逆轉骨肉瘤細胞耐藥性非常有前景的方法。

2.3 抑制骨肉瘤轉移童也等［22］通過基因富集分析等方法探討了與鐵死亡相關基因在轉移性骨肉瘤中的潛在作用機制發現，ATF4是轉移性骨肉瘤中鐵死亡相關基因之一。在骨肉瘤細胞中高表達的ATF4能夠使其黏附力下降，并促進細胞脫落，降低骨肉瘤的轉移，提示ATF4可能在骨肉瘤的發展和轉移中起著重要作用［25］。CHEN M等［26］研究發現，靶向賴氨酸特異性去甲基化酶4A（Recombinant lysine specific demethylase 4A，KDM4A）在體外顯著增加骨肉瘤細胞死亡，并減弱遷移能力，KDM4A缺失在體內顯著抑制骨肉瘤進展和肺轉移。以上研究結果表明，誘導鐵死亡能夠抑制骨肉瘤轉移。

2.4 調節骨肉瘤免疫逃逸免疫細胞能夠識別和攻擊病原體、腫瘤細胞和其他異常細胞，是機體免疫系統發揮作用的一個重要環節。YAO Y等［27］發現，鐵死亡主要拮抗蛋白GPX4在T細胞中的缺失會導致濾泡輔助性T細胞功能喪失和抗體反應低下。ZHENG D等［28］發 現 鐵 死 亡 相 關 基 因COL2A4、HOXB5和UNC5B在骨肉瘤中高表達，并與骨肉瘤細胞免疫逃逸密切相關。SHAO H B等［29］確定了一種與鐵代謝相關的lncRNA信號，該信號在預測骨肉瘤患者的生存預后及其免疫狀況具有良好的性能。

2.5 其他除上述4個方面外，其他因素也會影響骨肉瘤細胞的鐵死亡。轉化生長因子β受體1是TGF-β信號通路的中心傳播因子，它可以通過Nrf2轉錄因子降低促紅細胞生成素的表達，減輕血液黏滯程度，誘導骨肉瘤細胞鐵死亡［30］。ZHAN F等［31］發現YAP敲低結合鐵死亡誘導劑可增加人骨肉瘤細胞（Human osteosarcoma，HOS）對焦磷酸α甲酯介導的光動力療法的敏感性。

3 中藥活性成分干預鐵死亡治療骨肉瘤的應用

根據《靈樞·絕氣》《五十二病方》等古籍相關記載，骨肉瘤在中醫學中被歸屬為“骨瘤”“骨疽”“石疽”“肉瘤”等范疇［32］，近年來圍繞中藥活性成分誘導骨肉瘤細胞鐵死亡取得了一定進展。鐵死亡是調節癌細胞生長的重要因素，中藥活性成分可靶向調節骨肉瘤細胞鐵死亡［33］，起到誘導骨肉瘤細胞凋亡、自噬、抑制增殖、逆轉耐藥等作用，有望為骨肉瘤的治療提供新方向。

3.1 青蒿素類青蒿屬于菊科植物黃花蒿Artemisiaannua L，是一種常見清熱解毒中藥，可從中提取出青蒿素（最早由中國中醫科學院屠呦呦研究員發現），雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）、蒿甲醚、青蒿琥酯等是其主要衍生物［6］。于越［7］將DHA作用于腫瘤細胞，發現其誘導鐵死亡抑制腫瘤細胞增殖的機制可能與GPX4相關。JI Y等［8］發現DHA是以劑量依賴性方式抑制骨肉瘤細胞增殖，表明DHA誘導骨肉瘤鐵死亡可作為一種新的治療方法。ISANI G等［9］在犬骨肉瘤細胞中加入青蒿水醇提取物和青蒿素后發現，D-17細胞中鐵代謝改變（細胞內總鐵顯著減少），脂質氫過氧化物呈鐵依賴性積累，導致骨肉瘤細胞鐵死亡；且青蒿素水醇提取物對D-17犬骨肉瘤細胞系的細胞毒活性強于青蒿素，這些發現為青蒿素和青蒿提取物具有生物活性提供了證據，是一種新型的抗骨肉瘤候選藥物。

3.2 類黃酮補骨脂二氫黃酮（Bavachin）屬于類黃酮，是從補骨脂中提取的生物活性化合物，被證明可以通過STAT3/P53/SLC7A11軸誘導骨肉瘤細胞鐵死亡，P53（腫瘤抑制蛋白）通過觸發鐵死亡來抑制骨肉瘤細胞生長，能夠負調節SLC7A11并在Bavachin誘導的骨肉瘤細胞鐵死亡中起促進作用，即Bavachin能抑制MG-63和HOS細胞活性，同時增加Fe2+水平、ROS積累、丙二醛過表達并耗竭谷胱甘肽。此外，去鐵胺（鐵螯合劑）、維生素E（抗氧化劑）和鐵死亡抑制劑（Liproxstatin-1和Ferrostatin-1）等可逆轉Bavachin誘導的細胞死亡。Bavachin還能改變骨肉瘤細胞線粒體形態，體現在線粒體更小、膜密度更高及嵴減少［10］。以上顯示Bavachin具有誘導骨肉瘤細胞鐵死亡的作用。

3.3 姜黃素類姜黃素是從姜科植物姜黃Curcumalonga L.中分離出的一種二酮類的化學物質。YUAN C等［11］研究發現，姜黃素通過調控Nrf2/GPX4信號通路誘導骨肉瘤細胞鐵死亡，從而抑制骨肉瘤細胞生長。LIN H等［12］研究發現，姜黃素類似物EF24能上調骨肉瘤細胞的細胞內鐵離子、ROS和脂質氧化水平，這種效應可被鐵死亡抑制劑逆轉，而無法被細胞凋亡、細胞焦亡、細胞自噬抑制劑逆轉，提示EF24誘導骨肉瘤細胞鐵死亡。姜黃素及類似物EF24可能成為治療骨肉瘤患者的潛在藥物。

3.4 茶多酚類茶黃素-3，3'-沒食子酸（Theaflavin-3，3′-digallate，TF3）是從漆樹、五倍子、茶等植物中提取出的有效成分，是目前最有前途的純天然多酚類化合物之一。HE T等［34］研究發現，TF3在處理MG-63和HOS細胞后線粒體出現鐵死亡特征表現，呈濃度依賴性方式抑制細胞增殖、降低細胞活力并導致G0/G1細胞周期停滯；當使用鐵死亡抑制劑（Fer-1）時，TF3治療后對細胞活力的損害也有所減輕；TF3還改變了骨肉瘤中鐵儲存的穩態機制，導致過量不穩定鐵的產生，通過減少GSH耗竭、ROS積累和芬頓反應引起氧化應激，激活ROS和MAPK信號通路，觸發細胞鐵死亡。因此，TF3有望成為一種安全且有潛力的骨肉瘤治療藥物。

3.5 異硫氰酸酯類PEITC是存在于十字花科蔬菜中的一種天然異硫氰酸酯化合物，對腫瘤具有化學預防的作用，對于骨肉瘤的作用也在不斷被挖掘中。LV H等［24］研究發現，PEITC通過降低GSH水平和增加ROS水平誘導骨肉瘤細胞氧化應激反應，降低細胞活力，通過鐵死亡抑制骨肉瘤細胞增殖。

3.6 五環三萜類中華獼猴桃中的熊果酸（Ursolic acid，UA）是一種天然的五環三萜類抗癌藥物，UA可以通過多重靶點效應激活鐵蛋白的自噬過程，增加細胞中的鐵離子含量，誘導鐵死亡，增強抗化療耐藥的作用。此外，在小鼠骨肉瘤異種移植模型中，低劑量順鉑聯合UA可顯著抑制腫瘤生長，且能增強順鉑對骨肉瘤細胞DNA損傷作用［35］。表明UA可降低骨肉瘤細胞對順鉑的耐藥性，并產生協同作用，即UA與順鉑的聯用有望成為骨肉瘤的治療新策略。

4 小結與展望

通過對鐵死亡及其在骨肉瘤治療中的應用進行分析，發現誘導鐵死亡可以通過逆轉化療藥物的耐藥性、抑制骨肉瘤細胞增殖和轉移、降低免疫逃逸等對骨肉瘤產生作用，可為骨肉瘤提供新的干預方法和治療策略。中藥含有具有抗骨肉瘤作用的化學成分，可以通過多種途徑誘導鐵死亡。但目前仍有一些局限性待解決：①誘導鐵死亡抗骨肉瘤的機制尚未完全清楚；②中藥化合物鐵死亡誘導劑在骨肉瘤臨床中尚未得到驗證；③中藥化合物鐵死亡誘導劑與其他死亡方式的誘導劑聯用協同抗骨肉瘤研究未見報道；④中藥化合物鐵死亡誘導劑減毒增效的藥理作用機制不清。因此仍需進一步探究和闡明鐵死亡在骨肉瘤中的應用，深入探索中醫藥調控鐵死亡的機制，為未來中醫藥防治骨肉瘤提供新的理論支撐和科學依據。