巴西橡膠樹HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鑒定

杜曉愚　趙一杰　張世鑫　田維敏　晁金泉

關鍵詞：巴西橡膠樹；HbPSKR2；酵母雙雜交；熒光素酶互補成像；互作蛋白

中圖分類號：S794.1 文獻標志碼：A

磺肽素（phytosulfokine， PSK）是一種高等植物特有的小肽類激素，廣泛參與植物的生長發育、分裂分化、逆境脅迫等生物學過程[1-3]。磺肽素基因編碼的前體多肽長度約為80～110 個氨基酸，通過翻譯后剪切形成5 個氨基酸的小肽（ Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln），而后在酪氨酸硫化轉移酶的作用下對其第1 位和第3 位的酪氨酸（tyrosine， Tyr）發生特異的磺基化修飾，最終形成有活性形式的磺肽素[4-5]。與其他植物激素一樣，磺肽素信號傳導也依賴于細胞膜定位的受體蛋白。磺肽素受體（phytosulfokine receptor， PSKR）是一種典型的跨膜蛋白，其膜外的亮氨酸重復元件（leucine richrepeat， LRR）主要用于感知磺肽素信號，而膜內的激酶結構域主要用于下游信號的傳導[6-7]。PSKR 在植物中一般有2 個成員，目前對其功能的研究還比較少。ZHANG 等[8]發現番茄的SlPSKR1和SlPSKR2 均可與PSK 結合，并且證明PSKR1通過促進鈣調素與生長素合成蛋白YUC 的互作進而激活番茄對疫霉病的響應。HOLZWART 等[9]報道擬南芥的PSKR1 可以和RLP44 蛋白互作，在調控形成層向木質部分化過程中起關鍵作用。

天然橡膠是一種重要的工業原料，在醫療衛生、交通運輸、航空航天等領域具有廣泛應用[10-11]。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg）原產南美洲亞馬遜雨林地區，是當前世界天然橡膠的主要來源[12]。位于橡膠樹樹皮內層的次生乳管是天然橡膠合成和貯存的主要場所。橡膠樹膠乳本質上是乳管細胞的細胞質部分，含30%～50%的天然橡膠[13]。生產上人們通過割膠的方式收集從被切斷乳管中流出的膠乳用于天然橡膠加工，因此橡膠樹的次生乳管是決定天然橡膠產量的結構基礎。前人研究表明，橡膠樹次生乳管由形成層分化而來，茉莉酸信號途徑在該過程中起關鍵作用[14-15]。最近課題組研究發現磺肽素參與了茉莉酸誘導次生乳管分化[16]。本研究克隆了橡膠樹磺肽素受體HbPSKR2，并對其互作蛋白進行篩選和鑒定，為深入揭示橡膠樹乳管分化分子機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹形成層區cDNA、橡膠樹形成層區酵母雙雜交文庫、酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7、pCAMBIA1300-nLUC、pCAMBIA1300-cLUC 均由本實驗室保存；本生煙播種于中國熱帶農業科學院橡膠研究所植物培養室，培養至4～7 葉期備用；農桿菌菌株GV3101、酵母菌株Y187、酵母菌株AH109、大腸桿菌DH5α 感受態細胞均購自上海唯地生物技術有限公司；橡膠樹全基因組序列從NCBI 下載（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LVXX00000000.1）；組織特異性及割膠前后膠乳的轉錄組原始數據從國家基因組數據中心下載（https：//ngdc.cncb.ac.cn），GSA 編號為CRA004268；冠菌素（COR）處理形成層的轉錄組原始數據從NCBI 下載（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/s），數據編號分別為SRR3423347～SRR3423350。

1.2 方法

1.2.1 HbPSKR2 基因的克隆 以擬南芥AtPSKR2蛋白序列對橡膠樹基因組進行BLASTn 搜索，得到含橡膠樹完整HbPSKR2 序列的scaffold0093_1558507。根據序列信息設計擴增HbPSKR2 完整開放閱讀框的特異性引物HbPSKR2-F 和HbPSKR2-R（表1），以橡膠樹形成層區cDNA 為模板進行PCR 擴增。擴增體系為：2×PCR buffer 10 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板1 μL，ddH₂O 7 μL；擴增程序為：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共設置33 個循環；最終72 ℃延伸10 min。擴增產物用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（天根生化科技有限公司）進行回收純化，通過pEASYBluntCloning Kit（全式金生物科技有限公司）連接載體并轉化大腸桿菌DH5α。過夜培養后挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.2 HbPSKR2 的生物信息學分析 利用在線工具Compute pI/Mw（ http：//web.expasy.org/compute_pi/）分析HbPSKR2 的分子量和等電點；利用在線結構域分析工具SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析HbPSKR2 的結構域；利用DNAMAN 軟件分析HbPSKR2 與其他植物同源蛋白間的序列比對；利用在線工具iTQL（https：//itol.embl.de/） 繪制HbPSKR2 與其他植物同源蛋白間的系統發育樹；利用依托單位服務器，采用Tophat 軟件將所下載的轉錄組原始數據比對到橡膠樹基因組上，根據Cufflink 軟件計算基因的FPKM 值。

1.2.3 HbPSKR2 的自激活檢測 以測序正確的pEASY-HbPSKR2 質粒為模板，用特異性引物pGBDKT7-HbPSKR2-F 和pGBDKT7-HbPSKR2-R擴增目的片段，采用ClonExpress Ultra One StepCloning Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）同源重組方法構建pGBDKT7-HbPSKR2 的Bait 載體。將測序正確的質粒轉化至酵母Y187菌株，涂布于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 固體培養基上，30 ℃倒置培養3 d 觀察菌落生長情況。

1.2.4 HbPSKR2 的酵母雙雜交文庫篩選 將pGBDKT7-HbPSKR2 和橡膠樹形成層酵母cDNA文庫分別轉化至Y187 和AH109 酵母感受態細胞中，分別涂布于SD/-Trp 和SD/-Leu 篩選平板，30 ℃恒溫培養3～4 d。用涂布棒刮取上述Prey 菌株和Bait 菌株，分別接種于相應篩選培養基中，30 ℃振蕩培養至OD₆₀₀=0.8。離心收集菌體，用YPDA 液體培養基重懸菌體并調整至細胞密度大于1×10⁸mL^–1。將二者等體積混勻，接種于YPDA液體培養基中擴大培養。在相差顯微鏡下觀察酵母菌液產生合子后收集菌體，涂布SD/-Leu/-Trp篩選平板置于30 ℃倒置培養。挑取候選陽性菌落分別點板SD/-Leu/-Trp 二缺和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 四缺篩選平板，30 ℃倒置觀察菌落生長情況。挑選四缺平板陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.5 熒光素酶互補驗證 用特異性引物HbPSKR2-nLUC-F 和HbPSKR2-nLUC-R 擴增測序正確的pEASY-HbPSKR2 質粒并連接pCAMBIA1300-nLUC 載體；用特異性引物HbPBL8- cLUC-F/HbPBL8-cLUC-R 和HbPIX13-cLUC-F/HbPIX13-cLUC-R 分別擴增測序正確的陽性酵母菌株并連接pCAMBIA1300-cLUC 載體。將連接好的載體轉化大腸桿菌DH5α 過夜培養并送樣測序，將測序正確的pCAMBIA1300-HbPSKR2-nLUC、pCAMBIA1300-HbPBL8-cLUC 、pCAMBIA1300-HbPIX13-cLUC 質粒分別轉化農桿菌GV 3101 感受態，并于YEB 液體培養基中28 ℃過夜培養。離心收集菌體，用培養液調整OD600=1.0，通過注射法注射煙草葉片。注射后的煙草暗培養24 h 后在相同注射部位注射熒光素酶底物D-熒光素鉀鹽溶液，置于活體成像系統中觀察。

2 結果與分析

2.1 HbPSKR2 基因克隆及其編碼蛋白分析

以HbPSKR2 開放閱讀框引物對橡膠樹形成層區cDNA 擴增，獲得一條與預期大小一致的條帶。測序結果顯示，擴增產物長度為3159 bp，編碼1052 個氨基酸（圖1A）。HbPSKR2 的理論分子量為114.84 kDa，理論等電點為6.34。蛋白結構域分析顯示HbPSKR2 是個典型的跨膜蛋白，其中前640 個氨基酸是由22 個LRR 結構域組成的膜外天線，第692 個氨基酸至第714 個氨基酸是跨膜結構域，第765 個氨基酸至第1052 個氨基酸是介導膜內信號途徑的激酶結構域（圖1B）。

2.2 HbPSKR2 系統進化及多序列比對分析

選取擬南芥（Arabidopsis thaliana， At2g02220，At5g53890）、櫻桃（Prunus persica， XP_007227028.1）、榴蓮（Durio zibethinus， XP_022776608.1 ）、蓖麻（Ricinus communis， XP_002518809.2， EEF34126.1）、柚子（Citrus clementina， XP_024035321.1， XP_006451809.1）、樹棉（Gossypium arboretum， XP_017632150.1 ）、油菜（ Brassica napus， XP_013707217.1， XP_022546871.2）、毛果楊（Populustrichocarpa， XP_002312507.3， XP_002317487.3）8種雙子葉植物和水稻（Oryza sativa， LOC_Os02g41890.1， LOC_Os04g57630.1）、玉米（Zea mays，AQK72791.1， NP_001340572.1）、高粱（Sorghumbicolor， XP_002454207.1， XP_021318925.1）、小麥（ Triticum aestivum， XP_044413269.1， XP_044335016.1）4 種單子葉植物的PSKR 序列，與HbPSKR2 共同構建系統發育樹。結果顯示所有PSKR 成員可以劃分為4 個類群：Group I 類群由雙子葉植物PSKR1 構成；Group II 類群由雙子葉植物PSKR2 構成；Group III 類群由單子葉植物PSKR1 構成；Group IV 類群由單子葉植物PSKR2構成（圖2A）。其中HbPSKR2 屬于Group II 類群，且與來自蓖麻的RcPSKR2 親緣關系最接近。

作為跨膜受體蛋白，PSKR 的膜內激酶結構域是介導信號傳導的關鍵部分。采用DNAMAN軟件對HbPSKR2 的膜內激酶結構域以及擬南芥和水稻的PSKR 同源蛋白的膜內激酶結構域進行多重比對，結果顯示均存在ATP binding site、CaMbinding site、Activation segment、GC Centre 等保守性位點（圖2B）。

2.3 HbPSKR2 基因表達模式分析

組織特異性分析顯示，HbPSKR2 在橡膠樹各個組織中均有表達，其中在形成層、雌花、雄花中表達豐度較高，而在膠乳、葉片、樹皮中表達豐度較低（圖3A）。冠菌素（coronatine， COR）是一種茉莉酸類似物，可以有效誘導橡膠樹形成層分化次生乳管。HbPSKR2 的表達量在冠菌素處理前期（COR-A）較對照（CK-A）有顯著上升，而在處理后期（COR-B）與對照（CK-B）相比則差異不顯著（圖3B）。割膠是收獲天然橡膠的唯一方式。與未開割樹相比，HbPSKR2 在開割樹膠乳中的表達量極顯著上升（圖3C）。

2.4 HbPSKR2 誘餌載體自激活檢測及互作蛋白篩選

采用重組法構建pGBKT7-HbPSKR2 誘餌載體。自激活實驗結果顯示，含pGBKT7-53 陽性對照載體的酵母菌在SD-TL 二缺培養基和SDTLHA四缺培養基上均可以生長，并且加入x-gal后菌落變藍。而含pGBKT7-Lam 陰性對照載體的酵母菌以及含pGBKT7-HbPSKR2 載體的酵母菌只能在SD-TL 二缺培養基上生長（圖4A），表明HbPSKR2 無細胞毒性及自激活活性，可以用于酵母文庫篩選。

將含橡膠樹形成層區酵母cDNA 文庫質粒的酵母AH109 菌株和含pBGKT7-HbPSKR2 的酵母Y187 菌株共培養，鏡檢發現合子后收集菌體涂布至SD-TL 二缺平板進行培養，挑選陽性菌落接種于SD-TLHA 四缺平板進行進一步篩選。最終得到12 個陽性克隆（圖4B）。對陽性克隆插入片段進行測序，測序結果在橡膠樹數據庫進行BLASTx同源比對，鑒定到2 個核糖體相關成員、2 個泛素化相關成員、2 個生長發育相關成員、2 個蛋白激酶、1 個RNA 聚合酶、1 個幾丁質酶以及2 個功能未知蛋白（表2）。

2.5 HbPSKR2 與蛋白激酶HbPBL8 和HbPIX13 的互作驗證

蛋白激酶在信號傳導中起重要作用。在HbPSKR2互作蛋白中鑒定到2 個蛋白激酶HbPBL8 和HbPIX13，推測其可能介導橡膠樹PSK 的信號傳導。分別構建HbPSKR2-nLUC 載體、HbPBL8-cLUC 以及HbPIX13-cLUC 載體，采用LCI 技術在煙草葉片中驗證HbPSKR2 與HbPBL8 和HbPIX13的互作關系。結果顯示共轉HbPSKR2-nLUC/HbPBL8-cLUC 和HbPSKR2-nLUC/HbPIX13-cLUC 可以檢測到強烈的熒光信號（圖5A），進一步證明HbPSKR2 在體內可以與HbPBL8 激酶和HbPIX13激酶互作。

2.6 HbPBL8 和HbPIX13 響應COR 處理的表達模式分析

通過分析COR 處理的橡膠樹形成層區轉錄組數據，HbPBL8 表達量在COR 處理前期和后期均較對照顯著上調，而HbPIX13 表達量則在COR處理前后均無差異（圖5B）。

3 討論

PSKR 是PSK 的直接受體，在PSK 信號傳導中起重要作用[6-7] 。本研究克隆了橡膠樹的HbPSKR2 基因。序列分析顯示，HbPSKR2 是一個跨膜蛋白，含有PSKR 蛋白典型的膜外LRR 結構域和膜內激酶結構域。組織特異性分析顯示HbPSKR2 在橡膠樹形成層區域相對表達豐度最高，并且在COR 處理早期被顯著誘導。課題組前期研究發現茉莉酸信號在誘導形成層分化次生乳管過程中起重要作用[14-15]，近期已有研究證明PSK 參與了茉莉酸誘導乳管分化過程[16]。鑒于HbPSKR2 在形成層區域高豐度表達，且可被茉莉酸類似物誘導，因此推測該基因可能參與了橡膠樹的乳管分化。

酵母雙雜交文庫篩選是鑒定互作蛋白的常用方法[17]。本研究構建了HbPSKR2 誘餌表達載體，對橡膠樹形成層區域酵母雙雜交文庫進行篩選，共得到12 個候選蛋白，測序分析顯示這些成員涉及初生代謝、生長發育、信號傳導等多個生物學途徑。蛋白質是生命活動的主要承擔者，其生物合成和降解過程直接關系著生命活動的進行[18]。核糖體是真核生物中與蛋白質合成密切相關的細胞器，由不同大小的亞基組成[19]。泛素化是真核生物普遍存在的翻譯后修飾方式，通過將靶標蛋白標記泛素標簽進而啟動蛋白質的降解[20-21]。本研究從HbPSKR2 互作蛋白中發現2 個核糖體相關成員和2 個泛素化相關成員，表明PSK 信號途徑可能直接參與橡膠樹蛋白質合成和降解過程。

蛋白激酶是一種催化蛋白質發生磷酸化修飾的酶[22]。生物體內的蛋白磷酸化是調控蛋白活力和功能的重要機制之一，在細胞信號傳導過程中起重要作用[23-25]。作為一種受體蛋白，已有報道PSKR 可以和多種激酶互作，參與不同的生物學過程。如WANG 等[26]報道擬南芥中PSK 與PSKR互作后可以改變結合位點附近的空間構象，促使PSKR 與體細胞胚胎發育受體激酶（somatic embryogenesisreceptor kinase，SERK）發生互作；HOLZWART 等[9]報道擬南芥的受體蛋白RLP44可以介導油菜素內酯關鍵成員BRI1-ASSOCIATEDKINASE 1（BAK1）與PSKR1 互作，以復合體的形式介導形成層分化木質部。本研究中通過熒光素酶實驗證明2 個蛋白激酶HbPIX13 和HbPBL8 與HbPSKR2 之間存在強烈互作，基因表達模式分析顯示HbPBL8 可被COR 顯著誘導，推測HbPSKR2-HbPBL8 信號通路可能在橡膠樹乳管分化過程中起一定作用。揭示HbPBL8 的靶標蛋白將是下一步的工作重點。