北京地區侵染茄子的番茄斑萎病毒分子鑒定與分析

摘要

調查發現北京地區一溫室栽培茄子Solanum"melongena"L.出現嚴重病毒病。利用基于小RNA的高通量測序技術和RTPCR方法，明確了引起茄子病害的病毒種類為番茄斑萎病毒，將其命名為TSWVeggplant分離物。進一步克隆了該病毒的基因組全長（S"RNA、M"RNA、L"RNA），并構建其系統發育樹。結果表明，該分離物的S"RNA與美國分離物親緣關系較近，M"RNA與中國分離物親緣關系較近，而L"RNA與韓國分離物親緣關系較近。因此，本研究發現的TSWV分離物與國內已發生報道的分離物不同，該分離物是否存在不同分離物之間基因組的重組需要進一步研究。

關鍵詞

番茄斑萎病毒;"茄子;"高通量測序

中圖分類號：

S"436.41

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023040

Molecular"identification"and"analysis"of"tomato"spotted"wilt"virus"on"eggplant"in"Beijing

TIAN"Wen1，2，"QIU"Yanhong1*，"QIN"Wentao3，"ZHANG"Haijun1，"WANG"Dexin1，"LI"Longfei4，JIA"Zhiyang4，"XU"Xiulan1*

（1."Vegetable"Research"Institute，"Beijing"Academy"of"Agriculture"and"Forestry"Sciences，"Beijing"100097，"China;"

2."Institute"of"Microbiology，"Chinese"Academy"of"Sciences，"Beijing"100101，"China;"3."Institute"of"Plant"

Protection，"Beijing"Academy"of"Agriculture"and"Forestry"Sciences，"Beijing"100097，"China;"4."Jingyan"

Yinong"（Beijing）"Seed"SciTech"Co."Ltd.，"Beijing"100097，"China）

Abstract

In"this"study，"serious"viral"disease"was"found"on"Solanum"melongena"L."in"a"greenhouse"in"Beijing."With"highthroughput"sequencing"technology"based"on"small"RNAs"and"RTPCR"methods，"it"was"confirmed"that"the"eggplants"were"infected"by"tomato"spotted"wilt"virus"and"named"as"TSWVeggplant"isolate."Complete"genome"sequence"of"the"TSWV"S"RNA，"M"RNA，"L"RNA"was"further"cloned"and"the"phylogenetic"tree"was"also"constructed."The"results"showed"that"the"S"RNA"of"TSWVeggplant"was"closely"related"with"isolates"from"America，"M"RNA"was"closely"related"with"isolates"from"China，"while"L"RNA"was"closely"related"with"isolates"from"Korea."So"the"TSWV"isolate"in"this"study"was"different"from"isolates"reported"in"China"and"whether"the"genome"of"the"isolate"was"recombined"from"different"isolates"was"needed"to"be"further"studied.

Key"words

tomato"spotted"wilt"virus;"eggplant;"highthroughput"sequencing

茄子Solanum"melongena"L.屬茄科Solanaceae，是我國重要的蔬菜作物，在全國各地區均有種植，也是我國北方設施栽培的主要蔬菜之一［1］。近來，茄子病毒病發生嚴重，多種病毒可侵染茄子［2］，如番茄褪綠病毒（tomato"chlorosis"virus，ToCV），可引起茄子葉片出現褪綠黃化癥狀［3］，煙草輕型綠花葉病毒（tobacco"mild"green"mosaic"virus，TMGMV）和番茄斑駁花葉病毒（tomato"mottle"mosaic"virus，ToMMV）共同侵染引起茄子花瓣深紫色斑駁癥狀［4］。

番茄斑萎病毒（tomato"spotted"wilt"virus，TSWV）屬于番茄斑萎病毒科Tospoviridae，正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus，基因組由3條單鏈RNA組成，包含L"RNA（8.9"kb）、M"RNA（4.8"kb）、S"RNA（2.9"kb）［56］。其中，L"RNA的互補鏈編碼依賴于RNA的RNA聚合酶RdRP;M"RNA編碼非結構蛋白NSm，其互補鏈編碼兩個重要的糖蛋白Gn和Gc;S"RNA編碼非結構蛋白NSs，其互補鏈編碼核衣殼蛋白N［7］。其中，核衣殼蛋白N的氨基酸序列是正番茄斑萎病毒屬的重要分類依據，通常氨基酸同源性在90%以上為同種病毒［56］。TSWV寄主范圍廣泛，可侵染1"090多種植物［8］，是危害農業生產的一種全球性重要病毒，也是世界十大嚴重危害性植物病毒之一［9］。

近幾年，北京地區番茄斑萎病毒發生嚴重，在番茄［10］、辣椒［1011］、萵苣［12］、水芹［13］以及菊花［14］上均有發生。2021年，北京市海淀區一溫室內的茄子上出現疑似病毒侵染癥狀。本研究利用基于小RNA的高通量測序技術以及RTPCR方法鑒定了危害茄子的病毒種類;并進一步對該病毒的基因組序列進行了分析。本研究為有效防控茄子病害提供理論基礎。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

2021年，從北京海淀區一溫室大棚采集了8份疑似感染病毒的茄子樣品，拍照后保存于-80℃冰箱備用。陽性對照樣本由北京市農林科學院蔬菜研究所實驗室保存。

Trizol"Reagent"購自英濰捷基（上海）貿易有限公司;"一步法RTPCR試劑盒"［HiScript"Ⅱ"One"Step"RTPCR"Kit（Dye"Plus）］和5"min"TA/BluntZero"Cloning"Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Prime"ScriptTM"Ⅱ"High"Fidelity"One"Step"RTPCR"Kit"購于寶日醫生物技術（北京）有限公司;瓊脂糖凝膠快速回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2"高通量測序與小RNA分析

利用Trizol法對所采集的8份茄子病樣進行植物總RNA提取。利用NanoDrop"2000C紫外分光光度計（賽默飛世爾科技公司）測定RNA濃度，并選取3個濃度較高的RNA樣品混合后作為一個模板，委托華大基因進行文庫構建和高通量測序。測序平臺為Illumina"Hiseq"2000。將測序數據（raw"data）經過過濾、組裝所獲得的contigs與NCBI數據庫進行比對分析;短序列采用Velvet軟件（kmer值設為17）［15］進行組裝拼接。

1.3"RTPCR檢測

以提取的葉片總RNA為模板，利用TSWV特異性檢測引物，采用HiScriptⅡ"One"Step"RTPCR"Kit（Dye"Plus）對所采集的樣品進行RTPCR檢測。具體引物信息見表1。

1.4"全長克隆及測序

以茄子樣品的總RNA為模板，根據小RNA測序拼接得到的病毒核苷酸序列設計TSWV引物，利用Prime"ScriptTM"Ⅱ"High"Fidelity"One"Step"RTPCR"Kit對TSWV的S"RNA、M"RNA和L"RNA進行擴增，具體引物信息見表1。其中，S"RNA"采用TSWVSF/TSWV861R"進行全長擴增;M"RNA采用2對引物分段進行擴增，分別為TSWVMF/TSWVM1560R和TSWVM1560F/TSWVMR，L"RNA同樣也采用2對引物分段進行擴增，分別為TSWVLF/TSWVL4600R和TSWVL4600F/TSWVLR，擴增后進行序列拼接。擴增產物用瓊脂糖凝膠快速回收試劑盒純化，并克隆至載體pCE2"TA/BluntZero上，轉化至感受態細胞FastT1"competent"cell（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）中;將菌液PCR鑒定為陽性的樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.5"序列分析

利用DNAMAN"8軟件對序列進行分析和拼接。利用BLAST進行同源序列檢索。采用Clustal"W算法進行多序列比對，并利用MEGA"7.0軟件基于鄰接法（neighborjoining，NJ）構建系統發育樹，Bootstrap值設為1"000。

2"結果與分析

2.1"田間病株癥狀以及高通量測序結果

2021年3月，在北京海淀區的一個溫室內發現很多茄子植株出現矮化癥狀，葉片上伴隨著褪綠、斑駁和花葉等癥狀，且一些發病植株的茄子果實表面凹凸不平（圖1a）。隨機采集發病的茄子植株8份，帶回實驗室進行檢測。

通過高通量測序后，獲得原始數據13"515"309條;經過過濾接頭以及去除低質量序列等，共獲得長度介于18～30"nt的小RNA"12"583"651條。其中，24"nt的小RNA最多（4"523"787條），其次為21"nt的小RNA（2"008"507條）（圖1b）。經過序列組裝以及比對分析發現有93條拼接序列（contigs）與TSWV的基因組具有同源性。

2.2"RTPCR檢測結果

為進一步明確高通量測序結果，采用TSWV的特異性引物TSWV861F/R對8個茄子樣品進行RTPCR檢測。結果表明，所采集的8個茄子樣品均擴出預期大小條帶（圖2）。通過對PCR產物測序分析，發現所擴增的PCR產物與已報道的TSWV分離物序列的相似性在98.7%以上，進一步證明了引起茄子相關癥狀的為番茄斑萎病毒，且該病毒為TSWV的一個新的分離物，命名為TSWVeggplant。

2.3"基因組克隆與分析

根據表1中的引物進一步克隆了TSWV全長序列，并向NCBI提交了該分離物的S"RNA，"M"RNA和L"RNA序列（GenBank序列登錄號分別為OM154966、OM154967和OM154968）。其中，TSWV的S"RNA大小為2"958"bp，編碼的非結構蛋白NSs基因大小為1"404"bp，其互補鏈編碼的外殼蛋白N基因大小為777"bp;TSWV的M"RNA大小為4"776"bp，編碼的非結構蛋白NSm基因大小為909"bp，其互補鏈具有一個大的開放閱讀框，基因大小為3"408"bp，編碼2個糖蛋白GN和GC。TSWV的L"RNA大小為8"913"bp，編碼的RdRp基因大小為8"640"bp。

進一步對TSWVeggplant分離物與其他已知TSWV分離物的序列同源性進行分析，BLAST比對結果顯示TSWVeggplant的S"RNA序列與其他TSWV分離物序列一致性在98.6%以上，M"RNA序列一致性在98.8%以上，L"RNA序列一致性在97.3%以上。其中，S"RNA與菊苣Cichorium"intybus分離物（GenBank"No."MG593199）的序列一致性最高（99.6%），M"RNA與番茄分離物（GenBank"No."KU179570）的序列一致性最高（99.1%），L"RNA與菊苣分離物（GenBank"No."MG593197）的序列一致性最高（98.8%）。

2.4"系統進化樹分析

對TSWVeggplant全基因組核苷酸序列與其他TSWV序列進行比對分析，利用MEGA"7.0軟件基于鄰接法構建系統進化樹。結果表明，TSWVeggplant的S"RNA"進化樹可分為3個組，其中TSWVeggplant的S"RNA與美國菊苣分離物（GenBank"No."MG593199）親緣關系最近，聚合為一個分支，形成組3（圖3a）;M"RNA進化樹形成2個組，其中TSWVeggplant的M"RNA與中國番茄分離物（GenBank"No."JF960236）關系最近，與中國的其他分離物形成組1，而國外的很多分離物形成組2（圖3b）;L"RNA與韓國的枸杞Lycium"chinense分離物（GenBank"No."MT643234）關系最近，形成組1，而中國分離物形成組2（圖3c）。說明，該分離物與國內報道的分離物有所不同。

3"結論與討論

TSWV是世界十大植物病毒之一，寄主范圍非常廣泛，給世界上許多國家和地區造成了嚴重的經濟損失。自1989年在中國廣州首次發現以來，已在我國多個省市發生，部分地區發生非常嚴重［2，"17］，尤其是番茄和辣椒上［10，"18］，如在四川［19］和云南［20］的辣椒上，黑龍江［18］、北京［10］的番茄上均有檢出TSWV。由于TSWV的傳播介體薊馬繁殖速度快，長期的化學藥劑防控導致薊馬抗藥性增強，致使TSWV的防治越來越困難。

茄子是我國重要的蔬菜作物，也是我國北方設施栽培的主要蔬菜之一，而近幾年，病毒病害時有發生。已報道的可侵染茄子的病毒約44種，新的病毒種類還在不斷增加。本研究通過高通量測序技術和PCR方法，明確了侵染茄子的病毒為TSWV。研究發現，TSWV在侵染茄子后，會導致茄子植株發育不良，葉片出現嚴重花葉、褪綠、斑駁等癥狀，且發病植株上的茄子果實表皮出現凹凸不平的癥狀，嚴重影響了茄子的產量和質量。進一步利用分子生物學方法，克隆了侵染茄子的TSWV分離物的全基因組序列。通過進化樹分析發現本研究在茄子上分離的TSWV"S、M和L"RNA親緣關系表現出不同的地域性，"S"RNA和與美國分離物親緣關系較近，M"RNA與中國分離物親緣關系較近，而L"RNA與韓國分離物親緣關系較近，說明該分離物與國內其他分離物有所不同，可能是隨著品種的交流以及薊馬的擴散，與不同國家的株系間發生了基因重組。因此，本研究發現的TSWV分離物是否存在不同株系之間的重組需要進一步的研究。"

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（責任編輯：田"喆）