瓜類(lèi)褪綠黃化病毒外殼蛋白的亞細(xì)胞定位及致病作用淺析

摘要

瓜類(lèi)褪綠黃化病毒（cucurbit"chlorotic"yellows"virus，"CCYV）是近些年來(lái)出現(xiàn)的一種煙粉虱"Bemisia"tabaci傳播的植物病毒，在瓜類(lèi)生產(chǎn)中造成了嚴(yán)重?fù)p失。為了解該病毒外殼蛋白（coat"protein，"CP）在病毒侵染寄主過(guò)程中的亞細(xì)胞定位和致病作用，本研究以CCYV山東黃瓜分離物為研究對(duì)象，構(gòu)建了熒光表達(dá)載體CPYFP和異源表達(dá)載體pGRCP。浸潤(rùn)熒光表達(dá)載體48"h后的本氏煙Nicotiana"benthamiana葉片在激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布;浸潤(rùn)異源表達(dá)載體的本氏煙植株7"d后上部葉片開(kāi)始顯現(xiàn)花葉癥狀，13"d后頂部新葉出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮和壞死斑點(diǎn)。以上結(jié)果表明CCYV"CP蛋白參與了病毒對(duì)寄主的侵染過(guò)程，可能是癥狀形成的致病相關(guān)因子。本研究為進(jìn)一步解析該病毒的致病機(jī)理提供了初步的理論支持。

關(guān)鍵詞

瓜類(lèi)褪綠黃化病毒;"外殼蛋白;"亞細(xì)胞定位;"致病性;"異源表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：

S"436.42

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023139

Characterization"of"the"subcellular"localization"and"pathogenicity"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"coat"protein

GAN"Shexiang#，"YANG"Liu#，"REN"Chunmei，"MIAO"Qian，"CHENG"Zhaobang，"JI"Yinghua*

（Institute"of"Plant"Protection，"Jiangsu"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Nanjing"210014，"China）

Abstract

Cucurbit"chlorotic"yellow"virus"（CCYV）"is"a"kindnbsp;of"plant"virus"transmitted"by"whitefly."Recently，"it"has"caused"serious"losses"in"the"production"of"Cucurbitaceae"crops."In"order"to"study"the"subcellular"localization"and"pathogenic"characteristics"of"its"coat"protein"（CP）"during"infection，"the"fluorescence"vector"CPYFP"and"the"heterologous"expression"vector"pGRCP"were"constructed"based"on"CCYV"Shandong"isolate."After"infiltrating"the"vector"CPYFP"for"48"h，"fluorescence"signal"could"be"observed"in"cytoplasm"and"nucleus"of"the"Nicotiana"benthamiana"leaves"under"the"laser"confocal"microscope."After"seven"days"of"infiltrating"the"vector"pGRCP，"the"upper"leaves"of"N.benthamiana"plants"began"to"show"mosaic"symptoms，"and"13"days"later，"the"systemic"leaves"appeared"severe"chlorotic，"crumple"and"necrotic"spots."These"results"indicated"that"CP"might"be"an"important"protein"involved"in"the"pathogenicity"of"CCYV."This"study"provided"a"preliminary"theoretical"support"for"further"understanding"the"pathogenesis"of"this"virus.

Key"words

cucurbit"chlorotic"yellows"virus;coat"protein;subcellular"localization;pathogenicity;heterologous"expression

瓜類(lèi)褪綠黃化病毒（cucurbit"chlorotic"yellows"virus，"CCYV）是一種由煙粉虱Bemisia"tabaci以半持久方式傳播的植物病毒，它最早于2009年在日本甜瓜上發(fā)現(xiàn)［1］，近些年來(lái)報(bào)道逐漸增多，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道［213］。我國(guó)于2010年在臺(tái)灣地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)CCYV［14］，之后在新疆、海南等多個(gè)省相繼出現(xiàn)報(bào)道［1520］。

該病毒在田間可以自然感染黃瓜、西瓜等大多數(shù)葫蘆科作物，實(shí)驗(yàn)室條件下也可以侵染杖藜（莧色藜）Chenopodium"giganteum、甜菜、藜麥、菠菜、萵苣、曼陀羅"Datura"stramonium和本氏煙等植物［1］。被感染植株在侵染早期會(huì)出現(xiàn)中部下部葉片褪綠黃化，而后逐漸蔓延至植株頂部，最終造成整株黃化［21］。由于該病毒嚴(yán)重影響了瓜類(lèi)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致重大損失，已逐漸成為瓜類(lèi)作物生產(chǎn)中日益突出的問(wèn)題。

對(duì)病毒基因組、編碼蛋白及其功能的研究是解析病毒侵染機(jī)理并形成防控策略的基礎(chǔ)前提。CCYV屬于長(zhǎng)線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus，其基因組包含2條正單鏈RNA（RNA1和RNA2）。其中RNA1全長(zhǎng)"8"607"nt，包含4個(gè)開(kāi)放閱讀框（open"reading"frame，"ORF），分別編碼甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）和RNA解旋酶（RNA"helicase），依賴(lài)"RNA"的"RNA"聚合酶（RNA"dependent"RNA"polymerase，"RdRp），P61蛋白和P22"蛋白;RNA2全長(zhǎng)8"041"nt，含有8個(gè)ORF，分別編碼外殼蛋白（CP）、小外殼蛋白（CPm）、70"kD"類(lèi)熱激蛋白（HSP70h）、P59、P26、P9、P62、P4.9蛋白［22］。在"CCYV"上目前只有"P4.9、P22、P6等少數(shù)幾個(gè)蛋白有功能相關(guān)報(bào)道［2325］，包括CP在內(nèi)的許多蛋白功能仍然缺乏研究。位于CCYV"RNA2上的cp基因長(zhǎng)753"bp，編碼一個(gè)由250個(gè)氨基酸組成的28"kD蛋白。作為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，CP不僅僅起到包裹病毒RNA的作用，在植物病毒對(duì)寄主的侵染過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。

目前對(duì)于CCYV的CP蛋白在病毒侵染寄主中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，Crinivirus"屬其他成員的CP蛋白的功能也鮮有報(bào)道。本研究以"CCYV山東黃瓜分離物作為研究對(duì)象，對(duì)其編碼的CP蛋白進(jìn)行了克隆，明確了CP蛋白的亞細(xì)胞定位特征，并評(píng)估了CP蛋白的致病特征，為后續(xù)深入解析CCYV編碼的CP蛋白在病毒與寄主植物互作過(guò)程中的作用機(jī)理奠定了部分理論基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

毒源樣品為感染CCYV的黃瓜葉片，于2016年采自山東壽光［18］;熒光表達(dá)載體35S∶YFP由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授惠贈(zèng);大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司;基于馬鈴薯X病毒（potato"virus"X，"PVX）的異源病毒表達(dá)載體pGR107、陰性對(duì)照載體pGRGFP和植物材料本氏煙Nicotiana"benthamiana種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2"RNA提取和cDNA的合成

取0.2"g病葉樣品，使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（上海浦迪生物）提取RNA，之后取2"μL使用HiScript"II"Q"RT"SuperMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。提取和反轉(zhuǎn)錄均根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3"PCR擴(kuò)增和克隆

根據(jù)"CCYV"已發(fā)布的外殼蛋白序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1），引物兩端分別加入了不同的酶切位點(diǎn)以便于后續(xù)載體構(gòu)建。

擴(kuò)增體系：2×phanta"PCR"mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）25"μL，上、下游引物各1"μL，模板cDNA"2"μL，超純水補(bǔ)足至50"μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3"min，95℃變性30"s，50℃退火30"s，72℃延伸45"s，34個(gè)循環(huán);72℃延伸10"min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，而后在紫外燈下切取目的條帶，使用Axygen膠回收試劑盒（愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）回收。將回收產(chǎn)物連接至pEASYBlunt載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)PCR篩選出的陽(yáng)性克隆送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4"載體的構(gòu)建

選擇測(cè)序正確的克隆使用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒（愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）提取質(zhì)粒，使用對(duì)應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）分別酶切目的片段和空載體（熒光表達(dá)載體35S∶YFP、異源病毒表達(dá)載體pGR107），酶切體系為：10×QuickCut"Buffer"4"μL，重組質(zhì)粒20"μL，限制性?xún)?nèi)切酶1.5"μL，超純水補(bǔ)足至40"μL。酶切后的產(chǎn)物使用Axygen膠回收試劑盒回收，單酶切的線性化載體去磷酸化，T4"連接酶連接目的片段與線性化的載體，連接體系為：10×T4"DNA"Ligase"Buffer"1"μL，回收產(chǎn)物7"μL，載體1"μL，T4"DNA"Ligase"1"μL。16℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，于含卡那霉素（50"μg/mL）的LB平板倒置培養(yǎng)過(guò)夜，PCR篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得重組載體。

1.5"浸潤(rùn)煙草與觀察分析

把構(gòu)建好的載體質(zhì)粒通過(guò)凍融法分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，于含卡那霉素（50"μg/mL）和利福平（50"μg/mL）的LB平板倒置培養(yǎng)2"d，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，將正確的克隆轉(zhuǎn)接至含有同樣濃度的卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁培養(yǎng)至OD600為0.8～1.2，4"000"g離心5"min富集菌體，加入浸潤(rùn)液（ddH2O"100"mL，1"mmol/L"MgCl2"200"μL，1"mmol/L"MES"1"mL，200"mmol/L乙酰丁香酮10"μL）重新懸浮菌體，并將OD600調(diào)至0.5，28℃靜置3"h后用無(wú)菌注射器浸潤(rùn)3～5葉齡健康本氏煙的葉片。

浸潤(rùn)熒光表達(dá)載體后的煙草置于25°C，光周期L∥D=16"h∥8"h的條件下培養(yǎng)。48"h后，剪下浸潤(rùn)葉片分為3份，其中1份制作玻片，于激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，LSM710）488"nm激發(fā)光下進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察，DAPI染核和觀察方法參照范小燕等［26］"的方法。另外2份樣品于液氮中研磨后，1份提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用表1引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。另1份樣品參照范小燕等［26］的方法提取總蛋白，進(jìn)行Western"blot檢測(cè)，在全自動(dòng)熒光/化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon"5200）下顯色觀察結(jié)果。將浸潤(rùn)異源表達(dá)載體的植株，分別于浸潤(rùn)后7、13"d觀察癥狀并拍照，同時(shí)采集植株系統(tǒng)葉片（頂部新生葉片，非浸潤(rùn)葉）提取RNA進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。CCYV"cp檢測(cè)引物見(jiàn)表1，PVX檢測(cè)引物見(jiàn)表2。定量PCR檢測(cè)使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix熒光定量檢測(cè)試劑盒（Q71102），按說(shuō)明書(shū)步驟在BIORAD"CFX"Opus"96"熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.6"生物信息分析

序列比對(duì)分析使用NCBI網(wǎng)站的BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和ClustalX軟件，蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分析使用在線工具ExPASy的ProtParam"tool（https：∥web.expasy.org/protparam/），信號(hào)肽分析使用在線軟件SignalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），跨膜結(jié)構(gòu)域分析使用在線軟件TMHMM（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。

2"結(jié)果與分析

2.1"CCYV"cp基因的克隆與分析

提取病樣RNA，使用表1引物經(jīng)RTPCR擴(kuò)增得到與目的基因片段大小基本吻合的片段。將目的條帶切膠回收并克隆至pEASYBlunt載體進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)結(jié)果表明所克隆序列為CCYV"cp基因?；蛉L(zhǎng)753"bp，編碼一個(gè)由250個(gè)氨基酸組成的28.7"kD蛋白，理論等電點(diǎn)5.92，經(jīng)SignalP和TMHMM預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。該蛋白的氨基酸序列與已報(bào)道序列比對(duì)結(jié)果顯示，作為病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，CCYV的外殼蛋白在不同分離物之間十分保守。本研究中的CCYV山東黃瓜分離物序列與參與比對(duì)的大部分分離物的CP氨基酸序列完全一致（圖1），推測(cè)重要保守位點(diǎn)的變化很有可能會(huì)改變病毒的侵染特性甚至喪失活性。

2.2"CP的亞細(xì)胞定位特征分析

擴(kuò)增到的cp基因連接到35S∶YFP載體上構(gòu)建成熒光表達(dá)載體CPYFP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后浸潤(rùn)本氏煙葉片，在浸潤(rùn)48"h時(shí)取浸潤(rùn)區(qū)葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，在本氏煙表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均能觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)，初步認(rèn)為CPYFP在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布（圖2a）。將樣品細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后再次進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)"CPYFP"與"DAPI染色區(qū)域相互重疊（圖2b），進(jìn)一步證明"CPYFP"具有細(xì)胞核分布的特征。

對(duì)浸潤(rùn)處理后的葉片提取RNA，使用引物CPbF和CPbR（表1）進(jìn)行RTPCR"檢測(cè)，產(chǎn)物大小約750"bp，而對(duì)照組（浸潤(rùn)35S∶YFP空載體）無(wú)擴(kuò)增條帶（圖2c）。同時(shí)提取浸潤(rùn)葉片總蛋白，經(jīng)過(guò)Western"blot檢測(cè)結(jié)果顯示浸潤(rùn)C(jī)PYFP的葉片檢測(cè)到一條大小約56"kD的特異性條帶，與CPYFP融合蛋白大小一致，而浸潤(rùn)35S∶YFP的樣品中檢測(cè)到一條大小約27"kD的條帶，與YFP大小一致（圖2d）。RTPCR和Western"blot結(jié)果表明CPYFP在本氏煙葉片中進(jìn)行了正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)也證實(shí)了在激光共聚焦顯微鏡下觀察到的熒光信號(hào)是由CPYFP在煙草葉片中表達(dá)產(chǎn)生的。

2.3"CP致病性分析

將擴(kuò)增到的cp基因連接到pGR107載體上，構(gòu)建成基于PVX病毒改造的表達(dá)載體pGRCP，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌"GV3101"后浸潤(rùn)本氏煙葉片。以浸潤(rùn)空載體和插入gfp基因的載體為對(duì)照。在浸潤(rùn)7"d后，兩種對(duì)照組上部葉片出現(xiàn)輕微花葉，類(lèi)似PVX感染后的癥狀;浸潤(rùn)pGRCP的本氏煙上部葉片出現(xiàn)花葉和卷曲皺縮。繼續(xù)觀察至第13"天，對(duì)照組煙草沒(méi)有明顯變化，而浸潤(rùn)pGRCP的植株系統(tǒng)葉片（頂部非浸潤(rùn)葉）出現(xiàn)較嚴(yán)重的卷曲、皺縮和壞死斑（圖3a）。此時(shí)對(duì)接種植株體內(nèi)的PVX及CCYV的CP表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，RTPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有接種植株體內(nèi)均檢測(cè)到了PVX，而CCYV的cp基因僅在接種pGRCP的植株中有檢測(cè)到，對(duì)照組未檢測(cè)到（圖3b）。qPCR結(jié)果顯示，在所有接種植株中PVX的表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖3c）。

上述結(jié)果說(shuō)明CCYV的CP蛋白能顯著增強(qiáng)PVX的致病性，暗示了CP"可能是一個(gè)參與病毒侵染時(shí)癥狀形成的致病相關(guān)因子。

3"結(jié)論與討論

研究病毒編碼蛋白的功能，可以解析病毒的侵染機(jī)制并為該病毒的防治提供理論依據(jù)。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞后，病毒編碼的蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在的位置正是其發(fā)揮侵染功能和進(jìn)行自我復(fù)制的場(chǎng)所和基礎(chǔ)，因此研究病毒編碼蛋白的亞細(xì)胞分布不僅有益于闡釋蛋白的作用方式，對(duì)后續(xù)解析蛋白功能也起著積極的推動(dòng)作用。CCYV是近些年來(lái)才被發(fā)現(xiàn)的1種粉虱傳病毒，自進(jìn)入中國(guó)以來(lái)傳播迅速、發(fā)生嚴(yán)重，給葫蘆科作物的生產(chǎn)造成了損失。本研究以CCYV山東黃瓜分離物為對(duì)象，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)其CP蛋白在本氏煙中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了觀察研究，結(jié)果顯示CP蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布。分子量相對(duì)較小的蛋白有可能直接通過(guò)彌散的方式入核，但CP的分子量相對(duì)較大（28.7"kD），序列分析也沒(méi)有明顯的核定位信號(hào)，因此其入核機(jī)理尚不清楚。目前在CCYV編碼蛋白中，除P4.9和P6外，其余蛋白的定位特征均未見(jiàn)報(bào)道。Wei等［23］研究P4.9時(shí)，報(bào)道其主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核;涂麗琴等［25］研究報(bào)道P6蛋白也分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

許多病毒蛋白在感染進(jìn)入宿主細(xì)胞后會(huì)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等位置進(jìn)一步發(fā)揮功能。有些蛋白本身就具有一定的致病性，會(huì)導(dǎo)致宿主出現(xiàn)黃化、花葉、壞死等癥狀，而有些蛋白可能只是協(xié)助其他蛋白發(fā)揮作用。本文為了明確CCYV"CP蛋白在侵染寄主植物時(shí)是否具有致病性或參與寄主感病后癥狀的形成，利用PVX異源病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)CCYV編碼的CP蛋白會(huì)誘導(dǎo)寄主植物出現(xiàn)比PVX感染更加嚴(yán)重的癥狀，甚至到后期還出現(xiàn)了壞死斑，這說(shuō)明CCYV的CP蛋白能增強(qiáng)PVX的致病性，暗示它可能是直接參與病毒致病的關(guān)鍵因子。但CP蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中是如何行使功能最終導(dǎo)致寄主植物出現(xiàn)感病癥狀的還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］"OKUDA"M，"OKAZAKI"S，"YAMASAKI"S，"et"al."Host"range"and"complete"genome"sequence"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus，"a"new"member"of"the"genus"Crinivirus"［J］."Phytopathology，"2010，"100（6）："560566.

［2］"BANANEJ"K，"MENZEL"W，"KIANFAR"N，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"cucumber，"melon，"and"squash"in"Iran"［J］."Plant"Disease，"2013，"97（7）："1005.

［3］"HAMED"K，"MENZEL"W，"DAFALLA"G，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"muskmelon"and"cucumber"in"Sudan"［J］."Plant"Disease，"2011，"95（10）："1321.

［4］"AMER"M"A."Serological"and"molecular"characterization"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"affecting"cucumber"plants"in"Egypt"［J］."International"Journal"of"Virology，"2015，"11"（1）："111.

［5］"ORFANIDOU"C，"MALIOGKA"V"I，"KATIS"N"I."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"in"cucumber，"melon，"and"watermelon"in"Greece"［J］."Plant"Disease，"2014，"98（10）："1446.

［6］"SHAKEEL"M"T，"AMER"M"A，"ALSALEH"M"A，"et"al."Molecular"characterization"of"Criniviruess"involved"in"the"etiology"of"cucumber"yellowing"disease"in"Riyadh"region，"Saudi"Arabia"［J］."European"Journal"of"Plant"Pathology，"2018，"150（9）："3947.

［7］"KUMAR"A，"ROUT"B"M，"CHOUDHARY"S，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"pumpkin"in"India"［J］."Plant"Disease，"2022，"106（6）："1767.

［8］"JAILANI"A"A"K，"IRIARTE"F，"HOCHMUTH"R，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"affecting"watermelon"in"thenbsp;United"States"［J］."Plant"Disease，"2022，"106（2）："774.

［9］"WINTERMANTEL"W"M，"JENKINS"H"L"L，"FASHING"P，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"melon"in"the"new"world"［J］."Plant"Disease，"2019，"103（4）："778.

［10］KHEIREDDINE"A，"SAEZ"C，"SIFRES"A，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"cucumber"and"zucchini"in"Algeria"［J］."Plant"Disease，"2020，"104（4）："1264.

［11］CHYNOWETH"R，"JIMENEZ"D，"LIBERTI"D，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"cucumber"plants"in"Spain"［J］."Plant"Disease，"2021，"105（8）："2258.

［12］KWAK"H"R，"BYUN"H"S，"CHOI"H"S，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"cucumber"in"South"Korea"［J］."Plant"Disease，"2021，"105（6）："1862.

［13］ABRAHAMIAN"P"E，"SOBH"H，"ABOUJAWDAH"Y."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"on"cucumber"in"Lebanon"［J］."Plant"Disease，"2012，"96（11）："1704.

［14］HUANG"L"H，"TSENG"H"H，"LI"J"T，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"infecting"cucurbits"in"Taiwan"［J］."Plant"Disease，"2010，"94（9）："1168.

［15］唐鑫，"張德詠，"李凡，"等."瓜類(lèi)褪綠黃化病毒（cucurbit"chlorotic"yellows"virus）在湖南省的首次報(bào)道及其流行動(dòng)態(tài)研究［J］."植物病理學(xué)報(bào)，"2017，"47（4）："573576.

［16］GU"Q"S，"LIU"Y"H，"WANG"Y"H，"et"al."First"report"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"in"cucumber，"melon，"and"watermelon"in"China"［J］."Plant"Disease，"2011，"95（1）："73.

［17］劉珊珊，"彭斌，"吳會(huì)杰，"等."海南省和河南省發(fā)生甜瓜褪綠黃化病的分子鑒定［J］."果樹(shù)學(xué)報(bào)，"2013，"30（2）："291293.

［18］干射香，"涂麗琴，"吳淑華，"等."山東壽光黃瓜上瓜類(lèi)褪綠黃化病毒的分子鑒定［J］."江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2019，"35（5）："10471053.

［19］楊世安，"李戰(zhàn)彪，"秦碧霞，"等.廣西三種甜瓜病毒分離物的分子檢測(cè)與鑒定［J］."植物保護(hù)，"2017，"43（3）："8389.

［20］潘衛(wèi)萍，"張以和，"吉艷玲."吐魯番首次發(fā)生甜瓜褪綠黃化病毒病［J］."蔬菜，"2017（2）："6061.

［21］古勤生，"彭斌，"劉珊珊，"等."瓜類(lèi)新病毒病害（一）：瓜類(lèi)褪綠黃化?。跩］."中國(guó)瓜菜，"2011，"24（3）："3233

［22］干射香，吳淑華，趙文浩，等."瓜類(lèi)褪綠黃化病毒山東黃瓜分離物基因組序列克隆及特征分析［J/OL］."植物病理學(xué)報(bào)："113［20230324］."DOI：10.13926/j.cnki.apps.000420.

［23］WEI"Ying，"SHI"Yajuan，"HAN"Xiaoyu，"et"al."Identification"of"cucurbit"chlorotic"yellows"virus"P4.9"as"a"possible"movement"protein"［J］."Virology"Journal，"2019，"16（1）："8285.

［24］ORFANIDOU"C"G，"MATHIOUDAKIS"M"M，"KATSAROU"K，"et"al."Cucurbit"chlorotic"yellows"virus"p22"is"a"suppressor"of"local"RNA"silencing"［J］."Archives"of"Virology，"2019，"164（11）："27472759.

［25］涂麗琴，"干射香，"吳淑華，"等."瓜類(lèi)褪綠黃化病毒編碼的P6蛋白亞細(xì)胞定位及致病特征分析［J］."園藝學(xué)報(bào)，"2021，"48（8）："15311540.

［26］范小燕，"楊柳，"季英華，"等."黃瓜綠斑駁花葉病毒CP基因克隆及亞細(xì)胞定位［J］."江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2018，"34（2）："281287.

（責(zé)任編輯：田"喆）