灰飛虱冠蛋白的基因克隆與表達分析

摘要

灰飛虱Laodelphax"striatellus冠蛋白屬于WD40重復超家族成員，主要通過結合肌動蛋白調控細胞骨架的動態聚合與解聚。本研究通過RTPCR克隆并獲得了灰飛虱3個冠蛋白coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的基因CDS區。系統進化樹分析顯示，這3個冠蛋白分別屬于3個分支，且與褐飛虱Nilaparvata"lugens的3個冠蛋白同源性最高，氨基酸序列相似性分別為99.2%、88.2%和82.5%。熒光定量PCR檢測結果顯示，coronin"1A在成蟲中的轉錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲，coronin"2B在雄蟲中的轉錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雌蟲，coronin"7在雌蟲中的轉錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雄蟲。而3個冠蛋白基因在唾液腺中的轉錄水平都顯著高于腸道。灰飛虱攜帶水稻條紋病毒（rice"stripe"tenuivirus，"RSV）后體內3個冠蛋白基因的轉錄水平顯著高于對照，說明冠蛋白可能在灰飛虱傳播RSV過程中發揮一定作用，研究結果為深入探究冠蛋白的功能奠定了基礎。

關鍵詞

灰飛虱;"水稻條紋病毒;"冠蛋白;"轉錄水平

中圖分類號：

S"433.3;"S"435.11

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023077

Gene"cloning"and"expression"analysis"of"coronins"in"Laodelphax"striatellus

ZHONG"Jiayi，"LI"Li，"WANG"Xifeng，"LIU"Wenwen*

（State"Key"Laboratory"for"Biology"of"Plant"Diseases"and"Insect"Pests，"Institute"of"Plant"Protection，"

Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China）

Abstract

The"coronins"of"Laodelphax"striatellus"are"the"members"of"WD40repeat"protein"superfamily，"which"can"regulate"the"dynamic"polymerization"and"depolymerization"of"actin"cytoskeleton."In"this"study，"we"cloned"the"coding"sequences"of"three"coronins："coronin"1A，"coronin"2B，"and"coronin"7"of"L.striatellus"by"RTPCR."Phylogenetic"analysis"showed"that"these"three"coronins"belonged"to"separate"branches，"with"the"highest"homology"observed"with"Nilaparvata"lugens，"showing"amino"acid"sequence"similarities"of"99.2%，"88.2%"and"82.5%，"respectively."Analysis"of"transcription"levels"of"coronin"genes"showed"that"transcription"level"of"coronin"1A"in"adults"was"significantly"higher"than"that"in"the"2nd"and"4thinstar"nymphs，"transcription"level"of"coronin"2B"in"male"adults"was"significantly"higher"than"in"the"2nd"and"4thinstar"nymphs"and"female"adults，"and"transcription"level"of"coronin"7"in"female"adults"was"significantly"higher"than"that"in"the"2nd"and"4thinstar"nymphs"and"male"adults."Moreover，"the"transcription"level"of"the"three"coronin"genes"in"the"salivary"glands"were"significantly"higher"than"those"in"the"gut."In"addition，"the"transcription"levels"of"the"three"coronin"genes"in"L."striatellus"carrying"rice"stripe"tenuivirus"（RSV）"were"significantly"higher"than"in"nonviruliferous"insects，"indicating"that"the"three"coronins"may"play"a"role"in"transmitting"RSV."This"study"have"laid"a"foundation"for"further"studies"on"the"function"of"coronins"in"virustransmission.

Key"words

Laodelphax"striatellus;"rice"stripe"tenuivirus;"coronin;"transcription"level

灰飛虱Laodelphax"striatellus（small"brown"planthopper，"SBPH）屬半翅目Hemiptera飛虱科Delphacidae，其除了直接取食水稻韌皮部汁液對水稻產生危害外，還能分泌各種化學物質（如多種水解酶）以及間接產生“蜜露”導致水稻長勢減弱或死亡［1］。此外，灰飛虱還是多種作物病毒的傳播介體，可傳播水稻條紋病毒（rice"stripe"tenuivirus，"RSV）、水稻黑條矮縮病毒（rice"blackstreaked"dwarf"virus）、北方禾谷花葉病毒（northern"cereal"mosaic"virus）和大麥黃條點花葉病毒（barley"yellow"striate"mosaic"virus）等，導致病毒病害的大面積暴發流行，作物產量嚴重降低甚至絕收，其造成的病害損失常大于直接取食危害［26］。為了解析灰飛虱的傳毒機制，本實驗室前期以RSV的核衣殼蛋白（nucleocapsid"protein，NP）為誘餌篩選了灰飛虱的cDNA文庫并獲得了與NP互作的冠蛋白［7］。

冠蛋白家族（coronin"family）是一類進化上保守的肌動蛋白結合蛋白，是由de"Hostos等于1991年首次在盤基網柄菌Dictyostelium"discoideum中鑒定到的，其定位于細胞表面冠狀突起，屬于WD40重復超家族［8］。在哺乳動物中，冠蛋白家族有7個成員，分為3大類，其中coronin"1A，"coronin"1B、coronin"1C和coronin"6屬于Ⅰ類，coronin"2A和coronin"2B屬于Ⅱ類，coronin"7屬于Ⅲ類［9］。目前包括褐飛虱Nilaparvata"lugens、煙粉虱Bemisia"tabaci和棉鈴蟲Helicoverpa"armigera在內的多種昆蟲的冠蛋白，在NCBI數據庫中都只檢索到了3種不同類型，分別屬于Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。有文獻依據的盤狀網柄菌中只鑒定到了coronin"7（corB）、villindin和coronin（corA）這3種冠蛋白;黑腹果蠅Drosophila"melanogaster鑒定到2種冠蛋白coronin（coro）和Pod1（coronin"7）;而秀麗蠅桿線蟲Caenorhabditis"elegans鑒定到2種冠蛋白Pod1（coronin"7）和coronin（cor1）［10］。冠蛋白參與肌動蛋白動力學的調節，細胞骨架動力學是許多生理過程的重要組成部分，如細胞的運動遷移和囊泡的運輸等［11］。細胞運動在包括癌癥和自身免疫性疾病等各種疾病的病因學中起著至關重要的作用［12］。大多數情況下，運動性依賴于肌動蛋白細胞骨架的動態重組，而肌動蛋白微絲的聚合和解聚是一個高度調控的過程，受許多肌動蛋白相關蛋白如冠蛋白、Arp2/3復合體、ADF和絲切蛋白（cofilin）等的調節。目前對冠蛋白的研究主要是聚焦在人和哺乳動物中，Ren等研究發現coronin"3促進胃癌轉移［13］;Rastetter等發現MAPK12/coronin"2通路參與調控結腸癌細胞的轉移［14］;Wu等研究發現coronin"1C的表達與肝癌轉移成正相關，而與患者預后成負相關，coronin"1C增強了肝癌細胞的遷移和侵襲活力［1516］;而乳腺癌、神經膠質母細胞瘤、腎癌等癌癥的惡性程度也被證明與冠蛋白家族成員相關［1719］。

鑒于冠蛋白家族成員在人類疾病中發揮的重要作用和其在真核生物體內的保守性，且其在昆蟲中的功能研究還不清楚，本研究克隆了灰飛虱冠蛋白家族3個成員coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的基因，進行了生物信息學相關分析，構建了與其他物種同源基因的進化樹，并對這3個蛋白在灰飛虱不同發育階段和不同組織的表達量進行了分析，同時檢測了灰飛虱攜帶RSV后冠蛋白的表達差異，研究結果為深入探究冠蛋白在灰飛虱體內的功能及其在傳毒過程中發揮的作用奠定了基礎。

1"材料與方法

1.1"供試蟲源

試驗所用灰飛虱包括攜帶水稻條紋病毒（rice"stripe"tenuivirus，"RSV）的灰飛虱（帶毒灰飛虱）和不攜帶RSV的灰飛虱（無毒灰飛虱）種群，為本實驗室長期保存種群，分別用‘武育粳3號’水稻飼養于恒溫光照培養箱中。飼養條件為：光周期為L∥D=16"h∥8"h，溫度26～28℃，相對濕度70%。每7"d更換1次水稻。每2個月利用斑點雜交法對攜帶RSV的灰飛虱（帶毒灰飛虱）進行篩選，保證種群帶毒率保持在90%以上。

1.2"主要試劑

AllInOne"FirstStrand"cDNA"Synthesis"Mix"for"qPCR"（AE341）購自北京全式金公司;Total"RNA"extraction"reagent"（R401）"和2×Phanta"Max"Master"Mix"（P525）"購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;1st"Strand"cDNA"Synthesis"Kit"（11139ES60）和qPCR"SYBR"Green"Master"Mix（11184ES08）購自上海翌圣生物科技股份有限公司;pTOPOTA/Blunt"Simple"Cloning"Kit（CV2201）和瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（DR01）購自北京艾德萊生物科技有限公司;大腸桿菌DH5α菌株（SAC21）購自北京金沙生物公司;快速質粒小提試劑盒（DP105）購自北京生化科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3"序列比對及引物設計

在NCBI上檢索得到褐飛虱冠蛋白家族3個成員（coronin"1A：LOC111059043;coronin"2B：LOC111048487;coronin"7：LOC111045201）的CDS序列。與本地灰飛虱轉錄組進行BLAST比對，拼接后得到灰飛虱coronin"1A，coronin"2B和coronin"7的部分序列。根據CDS區設計3對引物克隆3個冠蛋白基因，克隆后進行測序分析，再根據測序得到的正確序列設計相應基因的qPCR引物（表1）。

1.4"灰飛虱樣品收集

不同組織樣品：取30頭灰飛虱置于離心管中并插入冰中，為1個重復，共3個重復。待灰飛虱凍暈后，在體視顯微鏡（明美光電技術有限公司，型號MZ101）下解剖唾液腺和腸道，并置于PBS溶液中，離心后去掉PBS溶液收集唾液腺和腸道組織;解剖完唾液腺和腸道后在剩余組織中加入3"μL"超純水，使蟲體內血淋巴釋放出來，用移液器轉移到離心管中。將收集的唾液腺、腸道和血淋巴放入液氮或-80℃保存。

不同發育階段樣品：取灰飛虱2齡、4齡若蟲，雌、雄成蟲各30頭，每10頭1個重復，共3個重復。放入液氮或-80℃保存。

帶毒灰飛虱與無毒灰飛虱樣品：取帶毒率90%以上的灰飛虱和無毒灰飛虱各30頭，每10頭1個重復，共3個重復。放入液氮或-80℃保存。

1.5"總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzol試劑分別提取灰飛虱不同組織、不同發育階段、帶毒灰飛虱和無毒灰飛虱的總RNA。用NanoDrop"1000測定總RNA濃度，確保總RNA的質量良好后，用1st"Strand"cDNA"Synthesis"Kit反轉錄合成cDNA第一鏈，此cDNA用于后續基因克隆的模板，另用AllInOne"FirstStrand"cDNA"Synthesis"Mix"for"qPCR將1"μg"總RNA反轉錄成短鏈cDNA，用于后續熒光定量PCR。

1.6"冠蛋白基因的克隆

以1.5中合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系（50"μL）：2×Phanta"Max"Master"Mix"25"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各2"μL，模板cDNA"2"μL，超純水"19"μL。反應條件為：95℃預變性3"min;95℃變性15"s，退火15"s（溫度根據引物設定），72℃延伸（30～60"s/kb），35個循環;72℃延伸5"min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化回收目的條帶，然后將回收產物連接到pTOPO克隆載體上，并轉化DH5α感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，37℃過夜培養。挑取單克隆于600"μL含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃，200"r/min培養4"h，PCR驗證后，將陽性克隆菌液送至華大基因進行測序，將測序正確的質粒提取DNA保存于-20℃。

1.7"序列拼接及生物信息學分析

利用SnapGene軟件對測序結果進行拼接及翻譯。對氨基酸序列進行跨膜結構（TMHMM"Server"2."0，https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）和信號肽（SignalP"4.1"Server，https：∥services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP4.1/）預測;用ProtParam（https：∥web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質分子量和等電點;利用SWISSMODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質結構預測;在NCBI（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行Blastp序列比對，檢索其他物種的冠蛋白基因序列，利用EMBOSS"Needle"（https：∥www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）對序列相似性進行比對，利用MEGA"X軟件構建不同物種冠蛋白基于氨基酸序列的系統進化樹。

1.8"實時熒光定量PCR

以1.5中合成的用于qPCR的cDNA為模板，反應體系（20"μL）為：qPCR"SYBR"Green"Master"Mix"10"μL，正、反向引物（10"μmol/L）各0.4"μL，cDNA"2"μL，超純水"7.2"μL。反應條件為：95℃"2"min；95℃"10"s，60℃"30"s，40個循環。以actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法對各個基因的相對表達量進行計算分析。

1.9"數據分析

利用IBM"SPSS"Statistics"26對試驗數據進行分析，3種冠蛋白基因在不同發育階段和不同組織之間的差異顯著性分析采用單因素方差分析（Oneway"ANOVA）和最小顯著性差異法（least"significant"difference，LSD），在無毒灰飛虱和帶毒灰飛虱之間的差異顯著性分析采用t檢驗，顯著水平設為0.05和0.01。

2"結果與分析

2.1"冠蛋白基因克隆及生物信息學分析

基于灰飛虱轉錄組數據，經PCR擴增和測序最終得到灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7基因的CDS區序列，長度分別為1"506、1"749"bp和3"213"bp，分別編碼501、582個和1"070個氨基酸。預測的蛋白分子量分別為55.88、65.67"kD和116.81"kD，等電點分別為6.00、8.58和6.15，均無跨膜結構，也無信號肽。利用EMBOSS"Needle對氨基酸序列進行相似性比對，發現灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7與褐飛虱N.lugens"coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的相似性分別為99.2%、88.2%、82.5%，與人Hama"sapiens的coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的相似性分別為68.2%、61.7%、53.7%，說明3個冠蛋白在不同物種間具有高度的保守性。

冠蛋白家族成員具有WD40重復結構域（含有保守的色氨酸天冬氨酸基序，長度約為40"aa），此結構域包含5～7個WD40重復序列，在空間上折疊成一個具有5～7個葉片的β螺旋槳結構。利用SWISSMODEL對灰飛虱3個蛋白的三維結構進行預測，結果表明，其中coronin"1A和coronin"2B含有N端由WD40重復序列形成的“螺旋槳”結構及C端形成的卷曲螺旋結構，而coronin"7是長鏈蛋白，空間結構上包含2個由WD40重復序列形成的“螺旋槳”，但其缺少C端的卷曲螺旋結構域（圖1）。

2.2"冠蛋白系統進化樹分析

從NCBI數據庫中選取與灰飛虱冠蛋白家族序列同源性較高的7種昆蟲，褐飛虱、棉鈴蟲、煙粉虱、茶翅蝽"Halyomorpha"halys、意大利蜜蜂"Apis"mellifera、米象"Sitophilus"oryzae、致倦庫蚊Culex"quinquefasciatus，再加上人和小家鼠Mus"musculus冠蛋白家族的7個成員，利用MEGA"X，采用鄰接法（neighbourjoining"method）構建冠蛋白基于氨基酸序列在不同物種間的系統進化樹。結果顯示，冠蛋白家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別聚成一支，說明3類蛋白在不同物種間保守性強。灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7與褐飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7親緣關系最近（圖2）。

2.3"冠蛋白基因的時空表達分析

qPCR檢測結果表明，3個冠蛋白基因在灰飛虱的各發育階段和不同組織中都有轉錄。coronin"1A在成蟲（雄蟲和雌蟲）中的轉錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲;coronin"2B在雄蟲中的轉錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雌蟲;而coronin"7在雌蟲中的轉錄水平顯著高于2齡、4齡若蟲和雄蟲（圖3）。

coronin"1A在灰飛虱血淋巴中的轉錄水平最高，其次是唾液腺，腸道中最低;coronin"2B在唾液腺中的轉錄水平最高，其次是血淋巴和腸道;而coronin"7在唾液腺和血淋巴中的轉錄水平顯著高于腸道（圖4）。說明這3個冠蛋白基因在灰飛虱體內具有組織特異性，它們發揮的功能可能也不一樣。

2.4"帶毒灰飛虱與無毒灰飛虱冠蛋白基因表達差異

為探究冠蛋白家族3個蛋白是否在灰飛虱傳播水稻條紋病毒（RSV）中發揮一定功能，我們檢測了帶毒灰飛虱和無毒灰飛虱體內冠蛋白基因的表達情況，結果發現帶毒灰飛虱體內3個冠蛋白基因的轉錄水平均顯著高于無毒灰飛虱（圖5），這說明病毒侵染灰飛虱后會顯著上調冠蛋白基因的表達，表明它們可能在灰飛虱傳播RSV時發揮一定作用。

3"結論與討論

冠蛋白在高等真核生物中具有多種作用，已知它們是肌動蛋白結合蛋白之一，并參與多種重要的細胞功能［10］。冠蛋白與Factin的相互作用調節Factin的表達和定位［2021］。惡性瘧原蟲Plasmodium"falciparum的冠蛋白在其繁殖后期高表達，促進Factin在質膜上的定位［22］。因此，冠蛋白通過與蛋白質互作在Factin定位方面具有重要作用。目前已有較多研究發現冠蛋白與人類疾病相關，其可促進腫瘤轉移，影響癌癥預后等［23］，但其在昆蟲上的研究報道較少。NCBI數據庫中灰飛虱冠蛋白均未注釋。本研究利用RTPCR技術克隆獲得了灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的基因，其中"coronin"1A與coronin"2B和coronin"7的氨基酸序列相似性分別為57.9%和23.2%;coronin"2B與coronin"7的相似性只有22.2%，說明3個蛋白之間的相似性較低，但3個蛋白在空間上都形成一個“螺旋槳”結構，這個結構被認為是冠蛋白與其他蛋白互作的平臺［10］。灰飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7與褐飛虱coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的氨基酸序列相似性分別為99.2%、88.2%、82.5%，與人coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的相似性分別為68.2%、61.7%、53.7%，且在對灰飛虱與其他物種的冠蛋白構建進化樹時，冠蛋白的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別聚成一支，這說明冠蛋白家族成員在不同物種間高度保守。

目前對昆蟲中冠蛋白的功能研究較少，但在哺乳動物中冠蛋白的研究已取得了很大進展。有研究發現coronin"1A參與了吞噬作用，coronin"1A與NADPH氧化酶（PHOX）復合體的成分結合，該復合體聚集在吞噬小體表面，產生可以殺死體內病原體的超氧化物［24］。Humphries等發現，冠蛋白通過其卷曲螺旋結構域與Arp2/3復合體結合，將其招募到肌動蛋白細絲的兩側，促進肌動蛋白細絲成核;而在沒有細絲存在的情況下，冠蛋白抑制Arp2/3復合體的成核活性［25］。Cai等提出coronin"1B可以通過引導磷酸酶SSH1L定位到片狀脂膜，去磷酸化激活絲切蛋白（cofilin），從而增強cofilin活性來調控肌動蛋白細胞骨架的解聚［26］。有證據表明，冠蛋白可以區別Factin的核苷酸狀態，coronin"1B對ATPFactin的親和力遠高于對ADPFactin的親和力［27］，ATPFactin存在于肌動蛋白細絲聚合的正端，而ADPFactin存在于解聚末端。冠蛋白是如何調節肌動蛋白細絲動態變化的過程是復雜的，目前的研究也不夠完整，但很明顯，冠蛋白在肌動蛋白細絲的兩端，分別參與了其聚合與解聚。

帶毒灰飛虱與無毒灰飛虱相比，coronin"1A、coronin"2B和coronin"7的轉錄水平均顯著上升，而實驗室前期利用RSV"的核衣殼蛋白NP為誘餌篩選灰飛虱的cDNA文庫時，僅篩選到coronin"1A與NP互作［7］。由于coronin"1A是保守的肌動蛋白結合蛋白，其對肌動蛋白細胞骨架有著保守的調節作用，推測coronin"1A可能是通過與RSV"NP的互作在灰飛虱傳播RSV中發揮重要作用，且這個過程中可能有肌動蛋白細胞骨架的參與。coronin"2B和coronin"7在RSV侵染后轉錄水平也顯著上升，這可能是因為coronin"2B和coronin"7并不是通過直接與RSV"NP互作而是通過其他路徑發揮功能，后續可以從coronin"2B和coronin"7與病毒其他蛋白的互作入手進行研究。

通過本研究，我們克隆了灰飛虱冠蛋白家族3個成員coronin"1A、coronin"2B和coronin"7，它們在灰飛虱不同發育階段的轉錄水平存在顯著差異，且在唾液腺的轉錄水平顯著高于腸道，也明確了灰飛虱攜帶RSV后會引起3個冠蛋白基因的轉錄水平上升，這為下一步探索這3個冠蛋白在灰飛虱傳播RSV中的功能奠定了基礎。

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（責任編輯：楊明麗）