基于病菌孢子捕捉和realtime PCR技術(shù)的田間空氣中小麥白粉病菌孢子動態(tài)監(jiān)測及病情估計模型研究

摘要

利用Burkard定容式孢子捕捉器結(jié)合realtime"PCR定量技術(shù)，分別對種植高抗、中感和高感白粉病小麥品種的田間空氣中白粉病菌分生孢子濃度進行監(jiān)測，結(jié)果表明，realtime"PCR定量與傳統(tǒng)的顯微觀察計數(shù)兩種方法測得的孢子濃度呈顯著正相關(guān)（P≤0.01），且兩種病菌孢子計數(shù)方法在同一抗性品種上監(jiān)測到的孢子濃度動態(tài)相近。此外，兩種方法測得的孢子濃度與各氣象因子的相關(guān)性分析結(jié)果一致，空氣中的白粉病菌孢子濃度主要與空氣相對濕度顯著正相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，利用兩種方法測定的田間空氣中白粉病菌孢子濃度分別建立了基于累積孢子濃度的田間病情估計模型。分析發(fā)現(xiàn)，基于兩種孢子濃度測定方法建立的病情估計模型間無顯著性差異，表明realtime"PCR定量技術(shù)測定的孢子濃度在構(gòu)建白粉病病情估計模型上具有一定可行性。該結(jié)果為realtime"PCR定量技術(shù)與病菌孢子捕捉技術(shù)相結(jié)合用于小麥白粉病的監(jiān)測和預測提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞

小麥白粉病;"病菌孢子捕捉;"實時熒光定量PCR;"病原菌監(jiān)測;"病情估計模型

中圖分類號：

S"435.121.4

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023516

Dynamic"monitoring"of"aerial"conidia"and"disease"estimation"models"for"wheat"powdery"mildew"in"fields"using"pathogen"spore"traps"coupled"with"realtime"PCR"technique

WANG"Aolin1，2，"SHANG"Zhaoyue1，5，"ZHANG"Meihui1，"WANG"Gui1，"HU"Xiaoping2，"XU"Fei3，SUN"Zhenyu4，"CAO"Shiqin4，"LIU"Wei1*，"FAN"Jieru1*，"ZHOU"Yilin1*

（1."State"Key"Laboratory"for"Biology"of"Plant"Diseases"and"Insect"Pests，"Institute"of"Plant"Protection，"Chinese"

Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China;"2."State"Key"Laboratory"for"Crop"Stress"Resistance"

and"HighEfficiency"Production，"College"of"Plant"Protection，"Northwest"A"amp;"F"University，"Yangling"712100，"China;"

3."Key"Laboratory"of"Integrated"Pest"Management"on"Crops"in"Southern"Part"of"North"China，"Ministry"of"Agriculture"

and"Rural"Affairs，"Institute"of"Plant"Protection，"Henan"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Zhengzhou"450002，"China;"

4."Institute"of"Plant"Protection，"Gansu"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Lanzhou"730070，"China;"5."Key"

Laboratory"of"the"Pest"Monitoring"and"Safety"Control"of"Crops"and"Forests"of"Xinjiang"Uygur"Autonomous"

Region，"College"of"Agronomy，"Xinjiang"Agricultural"University，"Urumqi"830052，"China）

Abstract

In"this"study，"a"combination"of"realtime"PCR"assay"and"Burkard"7day"recording"spore"traps"was"used"to"monitor"airborne"Blumeria"graminis"f.sp."tritici"（Bgt）"conidia"in"the"fields"across"three"wheat"varieties"exhibiting"highly"resistant，"moderately"susceptible"and"highly"susceptible"levels."There"were"significant"correlations"（P≤0.01）"between"conidia"concentrations"obtained"by"using"a"compound"microscope"and"a"realtime"PCR"assay."The"dynamics"of"airborne"Bgt"conidia"concentrations"on"same"resistant"varieties"were"found"to"be"similar"when"determined"by"two"methods."Furthermore，"the"correlations"between"meteorological"factors"and"conidia"concentrations，"as"determined"by"the"two"methods，"were"almost"identical，"with"conidia"concentrations"mainly"exhibiting"significant"positive"correlations"with"humidity."Subsequently，"disease"estimation"models"for"wheat"powdery"mildew"between"disease"index"and"accumulated"conidia"concentration"were"constructed"using"two"methods，"respectively."Parallel"curve"analysis"showed"that"there"were"no"significant"differences"in"the"fitted"models"established"based"on"two"methods"for"measuring"accumulated"conidia"concentration."The"conidia"concentration"determined"by"the"realtime"PCR"technique"for"fitting"mildew"estimation"models"has"proven"to"be"practical"and"efficient."These"results"suggested"that"the"pathogen"spore"trap"technique"coupled"with"realtime"quantitative"PCR"offers"a"potential"tool"for"both"monitoring"and"predicting"wheat"powdery"mildew.

Key"words

wheat"powdery"mildew;"pathogen"spore"trap;"realtime"quantitative"PCR;"monitoring"of"pathogen;"disease"estimation"model

小麥白粉病是由Blumeria"graminis"f.sp."tritici（Bgt）引起的典型氣傳多循環(huán)病害，在我國發(fā)生范圍廣，危害面積大［12］。尤其是近年來生產(chǎn)上種植的小麥多為感病品種，且栽培上實行高肥水管理，使白粉病在我國常年維持高位發(fā)生狀態(tài)，年平均發(fā)病面積約600萬hm2［3］。田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子的數(shù)量是影響該病害流行的重要驅(qū)動因素，掌握空氣中病原菌數(shù)量動態(tài)對該病害的監(jiān)測和預警具有重要意義［45］。利用病菌孢子捕捉器可以實現(xiàn)對田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子濃度的連續(xù)監(jiān)測，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合環(huán)境條件、寄主抗性水平和病害調(diào)查數(shù)據(jù)等，能夠進一步分析影響白粉病菌分生孢子濃度動態(tài)變化的因素及其與病害發(fā)生強度之間的關(guān)系［67］。研究發(fā)現(xiàn)，當周累積孢子濃度和一周前累積孢子濃度與病情指數(shù)均存在顯著的對數(shù)關(guān)系［810］;且無論在高感還是中感白粉病的小麥品種上，當周累積孢子濃度與病情指數(shù)均存在顯著的對數(shù)關(guān)系［1112］。閆征遠等［13］進一步根據(jù)不同年度和不同品種上田間孢子濃度的監(jiān)測結(jié)果及其與病害發(fā)生之間的關(guān)系建立了基于不同時段累積孢子濃度的白粉病病情估計模型。

目前，在小麥白粉病菌孢子捕捉與監(jiān)測研究中，前人均利用傳統(tǒng)的顯微觀察計數(shù)來獲取并換算得到孢子濃度數(shù)據(jù)［813］。該方法費時費力，并且需要具有一定真菌分類學基礎(chǔ)的人員對目標病原菌孢子進行區(qū)分和識別，在觀察計數(shù)的過程中會受到土壤、粉塵顆粒、花粉和其他非靶標病原菌孢子等微粒的影響和干擾，易造成誤判［1416］。實時熒光定量PCR技術(shù)可較好地解決上述問題［17］。Cao等［18］利用Zeng等［19］設(shè)計的引物和Zheng等［20］開發(fā)的realtime"定量PCR"體系，建立了一套用來定量測定病菌孢子捕捉器采集樣本中小麥白粉病菌孢子數(shù)量的方法，通過特異性引物擴增小麥白粉病菌孢子的基因組DNA，對小麥白粉病菌孢子的擴增具有特異性，因此可極大提高孢子計數(shù)的準確性和讀出效率。本研究在2020年小麥生長季，利用Burkard7d定容式孢子捕捉器，在小麥白粉病不同抗性品種的田間試驗區(qū)內(nèi)，進行空氣中白粉病菌孢子的連續(xù)捕捉和監(jiān)測，采用傳統(tǒng)顯微觀察計數(shù)和realtime"PCR方法對孢子捕捉帶上的白粉病菌孢子定量，并分析兩種不同方法測得的孢子數(shù)量之間的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，分析基于兩種孢子計數(shù)方法的田間孢子動態(tài)及其與氣象因子和田間病情的關(guān)系，擬合基于不同時段累積孢子濃度的田間病情估計模型，并對基于兩種計數(shù)方法建立的田間病情估計模型進行比較。旨在為利用realtime"PCR定量技術(shù)聯(lián)合孢子捕捉技術(shù)監(jiān)測和預測小麥白粉病奠定基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"試驗材料與儀器

供試的不同抗白粉病品種分別為‘保豐104’（高抗品種）、‘石4185’（中感品種）、‘京雙16’（高感品種）。供試菌株為小麥白粉菌混合菌株，由E09、E15、E21、E23（2）和E31等5個當前的優(yōu)勢小種混合而成。小麥品種和混合菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所小麥白粉病實驗室提供。

病菌孢子捕捉器為Burkard7d定容式孢子捕捉器（Burkard制造有限公司，英國），運行周期為7"d，吸氣速率為10"L/min，能夠?qū)μ镩g空氣中小麥白粉病菌分生孢子進行連續(xù)監(jiān)測。氣象數(shù)據(jù)收集裝置為Dynamet科研級自動氣象站（Dynamax公司，美國），距離試驗地約50"m，數(shù)據(jù)通過CR1000采集器獲取，包括逐小時的溫度、相對濕度、降水量、太陽輻射、風速和大氣壓強等。用奧林巴斯顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）進行顯微觀察計數(shù)。采用QuantStudio"6"Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司，中國）進行realtime"PCR定量測定孢子數(shù)量。

1.2"試驗方法

1.2.1"試驗設(shè)計及田間病害接種誘發(fā)

試驗地位于中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊中試基地（39.5°N，116.6°E）。小麥于2019年10月9日播種，共設(shè)置3個不同抗性品種種植區(qū)，品種分別為‘京雙16’‘石4185’和‘保豐104’，每個品種種植區(qū)面積10"m×50"m=500"m2，按照120"kg/hm2的種植密度進行播種，行距為25"cm。

為確保田間充分發(fā)病，于2020年3月18日將提前在溫室中繁殖好的帶有小麥白粉菌混合菌株的盆栽苗，移栽于田間各種植區(qū)，每10行移栽1盆。在整個田間試驗期間，各種植區(qū)內(nèi)無其他病蟲害發(fā)生，田間除草為人工拔除。

1.2.2"田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子的捕捉

4月中旬，于每個品種種植區(qū)的中心布設(shè)病菌孢子捕捉器各1臺，3臺病菌孢子捕捉器的吸氣口距離地面均為60"cm。每7"d（10：00）更換捕捉器的‘鼓’并獲取‘鼓’上的捕捉帶。

將捕捉帶按先后順序截成7個長為48"mm的小段，每小段相當于1"d的空氣樣本。將48"mm長的捕捉帶置于載玻片上，在顯微鏡400倍視野下識別并計數(shù)，統(tǒng)計所有觀察視野下的總孢子量即為每日孢子捕獲量。

在顯微觀察計數(shù)后，根據(jù)Cao等［18］的方法對田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子數(shù)量進行realtime"PCR定量測定，然后轉(zhuǎn)換成每天每立方米空氣中白粉菌孢子的濃度（C），計算公式為：

C=N×1"00010×60×24，

式中：N代表利用顯微觀察或realtime"PCR方法測得的白粉菌分生孢子日捕獲量；1"000為空氣體積升與立方米之間的單位換算；10為吸氣速率（L/min）;60和24分別表示60"min和24"h。

1.2.3"田間病害調(diào)查

每周換‘鼓’的同時，對小麥白粉病的發(fā)病情況進行調(diào)查。人工接種條件下，田間白粉病均勻發(fā)生，調(diào)查時以孢子捕捉器為中心均勻取樣，共選取12個調(diào)查點，每點調(diào)查20莖，分級標準參照改進后的“0～9”級法［21］，計算病情指數(shù)（disease"index，"DI）。

DI=0×n0+1×n1+…+9×n99×（n0+n1+…+n9）×100，

式中：n0、n1…n9分別代表不同發(fā)病級別的調(diào)查莖數(shù)。

1.3"數(shù)據(jù)分析

1.3.1"數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換

采用BoxCox變換［22］將孢子計數(shù)數(shù)據(jù)正態(tài)化并消除其異方差性。在RStudio（4.2.0）中利用car程序包的powerTransform函數(shù)通過獲取λ的最大似然估計來正態(tài)化變量Xλ，其中X為孢子計數(shù)的原始數(shù)據(jù)，Xλ為正態(tài)化后的孢子計數(shù)數(shù)據(jù)。

1.3.2"氣象數(shù)據(jù)的處理

日平均氣象數(shù)據(jù)（10：00至次日10：00）包括日平均空氣溫度（T）、日平均空氣濕度（RH）、日平均太陽輻射率（SR）、日平均氣壓（VPD）、日平均風速（WS）以及日累積降水量（RF），均根據(jù)氣象站導出的逐小時數(shù)據(jù)計算得到。

在此基礎(chǔ)上，計算周平均氣象數(shù)據(jù)。

1.3.3"不同時段累積孢子濃度統(tǒng)計

“累積孢子濃度（A）”為病害調(diào)查日期前所有孢子的累積濃度;“一周前累積孢子濃度（B）”為病害調(diào)查當周前累積孢子濃度;“前一周累積孢子濃度（C）”為病害調(diào)查當周的前一周內(nèi)的累積孢子濃度;“當周累積孢子濃度（D）”為病害調(diào)查當周內(nèi)的累積孢子濃度，計算公式為：

A=∑Ni=1Ci;"B=∑N-7i=1Ci;"

C=∑N-7i=N-14Ci;"D=∑Ni=N-7Ci;

式中，以開始運行孢子捕捉器的當日為第1天，病害調(diào)查日為第N天，第i天田間空氣中小麥白粉菌分生孢子濃度為Ci;病害調(diào)查日的前第7天為N-7，病害調(diào)查日的前第14天為N-14。

1.3.4"數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

田間空氣中小麥白粉病菌分生孢子的日捕獲量（經(jīng)BoxCox轉(zhuǎn)換）與氣象變量之間的相關(guān)性分析在RStudio中利用基礎(chǔ)函數(shù)cor完成，計算Pearson相關(guān)性系數(shù)并進行統(tǒng)計學檢驗。

基于顯微觀察和realtime"定量PCR兩種方法測定的孢子濃度間的線性相關(guān)分析、不同時段累積孢子濃度與田間白粉病病情指數(shù)的線性或非線性回歸模型擬合，均利用RStudio中的lm函數(shù)或nls函數(shù)實現(xiàn)。

模型的比較分析通過RStudio中l(wèi)me4包的lmer函數(shù)和Stats包的anova函數(shù)完成。

2"結(jié)果與分析

2.1"病情進展曲線

圖1顯示了不同抗性小麥品種試驗區(qū)的白粉病病情進展曲線，其中，中感品種和高感品種試驗區(qū)內(nèi)的病害發(fā)展情況基本相似，在5月19日左右之前幾乎呈線性增長趨勢，特別是在4月28日至5月5日期間，兩個感病品種的病情指數(shù)分別增長了2倍和5倍，5月19日后病情發(fā)展逐漸變慢，直到6月9日分別達到79.88和91.33;高抗品種試驗區(qū)內(nèi)白粉病發(fā)展較慢，田間病情始終維持在較低水平，最后一次調(diào)查時病情指數(shù)為19.17。

2.2"田間空氣中白粉菌分生孢子濃度變化

Realtime定量PCR與傳統(tǒng)顯微觀察計數(shù)測定的孢子濃度具有相近的變化動態(tài)，總體趨勢表現(xiàn)為在生長季隨病情加重孢子濃度逐漸升高然后達到峰值，在生長季結(jié)束或即將結(jié)束時下降（圖2）。

利用兩種方法測得的中感品種和高抗品種試驗區(qū)內(nèi)的白粉病菌孢子濃度均低于高感品種，但無論是realtime"定量PCR還是常規(guī)顯微觀察均在高感品種上于5月3日和5月5日監(jiān)測到兩個明顯的孢子濃度峰，在中感品種和高抗品種上分別于5月4日和5月21日監(jiān)測到一個明顯的孢子濃度峰（圖2）。不同抗性品種的3個種植區(qū)，利用兩種方法測得的田間空氣中白粉病菌孢子濃度均極顯著線性相關(guān)（圖3），R2分別為0.86、0.58和0.86（P≤0.01），數(shù)據(jù)合并后R2為0.87（P≤0.01）（圖4）。

在空氣中白粉病菌分生孢子濃度較低的情況下，realtime定量PCR測得的孢子濃度大多低于顯微鏡觀察的結(jié)果;然而在濃度相對較高的情況下，3個不同抗性品種一致表現(xiàn)為realtime定量PCR法測定的結(jié)果高于顯微觀察，尤其當出現(xiàn)孢子濃度峰時（圖2）。

2.3"田間空氣中白粉菌分生孢子濃度與氣象因子的關(guān)系

對不同抗性品種，利用realtime定量PCR和傳統(tǒng)顯微觀察兩種方法測得的孢子濃度與氣象因子的相關(guān)性分析結(jié)果均一致，與日平均溫度不存在明顯的線性相關(guān);與日平均大氣壓強負相關(guān)，且在高抗品種上顯著負相關(guān);與日平均太陽輻射和日平均風速負相關(guān)，且在高感品種和中感品種上顯著負相關(guān);與日平均空氣相對濕度顯著正相關(guān);但與日降水量無顯著相關(guān)性（表1，圖5）。

2.4"基于田間孢子濃度的白粉病病情估計模型

利用不同抗性品種不同時段，基于realtime定量PCR和顯微觀察兩種方法測得的累積孢子濃度分別與田間病情實際調(diào)查結(jié)果擬合線性回歸方程，發(fā)現(xiàn)兩種方法得到的累積孢子濃度與病情之間的關(guān)系結(jié)果一致，表現(xiàn)為：3個品種病害調(diào)查日期前孢子的累積濃度和調(diào)查當周前累積孢子濃度與病情均存在極顯著的線性關(guān)系;病情調(diào)查當周內(nèi)孢子的累積濃度和病情調(diào)查當周的前一周內(nèi)孢子的累積濃度與病情均不存在顯著的線性關(guān)系（表2，表3）。

進一步分析結(jié)果表明，利用兩種方法建立的基于病害調(diào)查日期前孢子累積濃度的病情估計模型，截距均無顯著性差異（Pgt;0.05），斜率大多無顯著性差異;而基于病害調(diào)查當周前累積孢子濃度建立的病情估計模型，斜率和截距均無顯著性差異（Pgt;0.05）（表4）。

3"結(jié)論與討論

Realtime定量PCR方法應(yīng)用于病菌孢子捕捉器的孢子計數(shù)已有研究報道，該方法最大特點是對靶標病原菌的特異性強，克服了傳統(tǒng)顯微觀察計數(shù)法中形態(tài)相似或相近孢子難以區(qū)分的缺陷，不僅能夠準確定量空氣中靶標病原菌孢子的濃度，而且較傳統(tǒng)顯微觀察計數(shù)法節(jié)省時間，極大地提高了工作效率［2328］。Cao等［18］利用realtime定量PCR連續(xù)3年測定了高感品種‘京雙16’田間空氣中白粉病菌分生孢子的濃度，發(fā)現(xiàn)與顯微觀察計數(shù)法測定的孢子濃度顯著相關(guān)。本研究得到了與前人一致的結(jié)果，并在小麥不同抗性品種上得到了進一步的驗證。不同抗性品種上，雖然白粉病菌分生孢子捕獲的絕對數(shù)量存在一定差異，但realtime定量PCR能準確地反映各品種上孢子濃度的動態(tài)變化趨勢，且均與傳統(tǒng)顯微觀察所測結(jié)果極顯著線性相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，當孢子濃度監(jiān)測結(jié)果相對較高時，realtime定量PCR測得的孢子量往往高于顯微觀察;當監(jiān)測的孢子濃度相對較低時，則相反。導致這種差異的原因較為復雜［18］，如孢子捕捉帶未洗脫充分、或在DNA提取的收集上清步驟中存在損耗等。

本研究利用realtime定量PCR測定的不同抗性品種不同時段田間空氣中小麥白粉病菌累積孢子濃度，建立了白粉病的病情估計模型，具有一定可行性，且與利用傳統(tǒng)顯微觀察法建立的病情估計模型無顯著性差異，提供了一種除顯微觀察外獲取建模數(shù)據(jù)的備選或可替代方法。當然，目前使用的顯微觀察計數(shù)仍將是試驗條件有限的基層農(nóng)技推廣部門的首選;但隨著realtime定量PCR檢測技術(shù)的普及和推廣，該技術(shù)也將得到廣泛應(yīng)用，從而進一步推動病菌孢子捕捉技術(shù)在小麥白粉病監(jiān)測預測上的應(yīng)用。

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