在中國廣東侵染勝紅薊的中國勝紅薊黃脈病毒的鑒定和全基因組分析

喬蕊 周雪平 李方方

摘要

2022年9月在廣東省羅定市發現了葉片表現為黃色網狀癥狀的勝紅薊病株。為了明確勝紅薊葉片的黃脈癥狀是否由雙生病毒感染引起，本研究使用檢測雙生病毒的簡并引物PA/PB進行PCR擴增，獲得約500?bp的片段。根據該序列設計特異性引物擴增并且克隆得到了病毒DNAA的全基因組序列。通過BLAST比對發現，獲得的DNAA與中國勝紅薊黃脈病毒（ageratum?yellow?vein?China?virus，?AYVCNV）海南分離物（OQ421190）的DNAA的相似性最高，相似度為98.11%。系統進化樹分析顯示，獲得的病毒DNAA與海南分離物（OQ421190）在同一分支，說明具有較近的親緣關系。以上研究結果表明侵染勝紅薊的病毒是AYVCNV的分離物。這是關于AYVCNV在廣東地區侵染勝紅薊的首次報道，可為當地病毒病的防控提供參考。

關鍵詞

中國勝紅薊黃脈病毒;?PCR技術;?基因組序列;?系統發育分析

中圖分類號：

S?432.?41

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023216

Identification?and?complete?genome?sequence?analysis?of?ageratuminfecting?ageratum?yellow?vein?China?virus?from?Guangdong，?China

QIAO?Rui，?ZHOU?Xueping*，?LI?Fangfang*

（State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

The?ageratum?plants?with?yellow?vein?symptoms?were?found?in?Luoding?city，?Guangdong?province，?in?September?2022.?To?determine?whether?the?ageratum?plants?showing?vein?yellowing?symptoms?were?caused?by?geminiviruses，?PCR?technology?was?used?to?amplify?about?500?bp?sequence?using?the?degenerate?primers?PA/PB?for?detecting?the?presence?of?geminiviruses?in?this?study.?Based?on?the?amplified?500?bp?sequence，?the?complete?genome?sequences?of?DNAA?component?were?obtained?by?PCR?amplification，?cloning，?and?sequencing.?BLAST?comparison?showed?that?the?DNAA?component?shared?the?highest?sequence?identity?（98.11%）?with?the?Hainan?isolate?of?ageratum?yellow?vein?China?virus?（OQ421190）.?Phylogeny?analysis?showed?that?the?complete?genome?sequence?of?DNAA?component?was?most?closely?related?to?the?Hainan?isolate?of?AYVCNV?（OQ421190）.?These?results?suggest?that?the?virus?infecting?ageratum?is?an?isolate?of?AYVCNV.?This?is?the?first?report?on?AYVCNV?infecting?ageratum?in?Guangdong，?which?can?provide?a?reference?for?local?virus?disease?prevention?and?control.

Key?words

ageratum?yellow?vein?China?virus;?PCR?technology;?genome?sequence;?phylogeny?analysis

雙生病毒科Geminiviridae具有最大數量的植物DNA病毒，病毒粒子大小約為22?nm×38?nm［1］，基因組大小2.5～5.2?kb，存在單組分或者雙組分兩種類型的單鏈環狀基因組DNA。雙生病毒依靠煙粉虱、葉蟬等昆蟲介體傳播［23］，危害糧食、飼料、纖維、蔬菜、果樹等作物，導致世界范圍（特別是在熱帶和亞熱帶地區）內農業生產的巨大損失，有時甚至是毀滅性的損失。番茄、小麥、大豆、煙草、玉米和蘋果等農作物都是雙生病毒的重要寄主［45］。據報道，雙生病毒在中國可侵染118種植物，其中75種為非農作物［6］。非農作物寄主為雙生病毒提供了中轉場所，利于雙生病毒后續的持續侵染、傳播和流行［7］。莧科、菊科、旋覆花科、錦葵科、大戟科、夾竹桃科、柳葉菜科、酢漿草科、紫茉莉科和車前科等科的非農作物均受到雙生病毒的侵害。

勝紅薊Ageratum?conyzoides是菊科Asteraceae藿香薊屬Ageratum植物，是雙生病毒主要侵染的非農作物，在我國侵染勝紅薊的雙生病毒主要有勝紅薊黃脈病毒（ageratum?yellow?vein?virus，?AYVV）、中國勝紅薊黃脈病毒（ageratum?yellow?vein?China?virus，?AYVCNV）、四川勝紅薊曲葉病毒（ageratum?leaf?curl?Sichuan?virus，?ALCScV）、勝紅薊曲葉病毒（ageratum?leaf?curl?virus，?ALCuV）、臺灣勝紅薊黃脈病毒（ageratum?yellow?vein?Taiwan?virus，?AYVTV）、賽葵黃脈病毒（malvastrum?yellow?vein?virus，?MYVV）、煙草曲莖病毒（tobacco?curly?shoot?virus，?TbCSV）和云南煙草曲葉病毒（tobacco?leaf?curl?Yunnan?virus，?TbLCYV）等［811］。在這些病毒中，AYVCNV在我國的寄主范圍較廣，除侵染勝紅薊外，番茄、煙草和辣椒也是AYVCNV的常見作物寄主，近年在海南的雪茄煙上也分離到AYVCNV的病毒分離物［12］。

AYVCNV屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus的單組分病毒，其DNAA基因組編碼6個蛋白。單組分雙生病毒常伴有衛星分子協助其侵染，例如AYVV?DNAA與衛星分子DNAβ的侵染性克隆可以共同侵染植物并且通過昆蟲傳到其他植物，引起黃脈癥狀。將AYVCNV確定為菜豆金色花葉病毒屬的一個獨立種是由于該病毒與其他種類菜豆金色花葉病毒的全長序列核苷酸相似性低于86%，并且該病毒的衛星分子DNAβ與其他種類菜豆金色花葉病毒的DNAβ分子的相似度低于81%［13］。DNAβ分子在單組分基因組雙生病毒中充當DNAB的角色［14］，在一些雙生病毒中只有DNAA與DNAβ分子共同存在才會引起嚴重的病害癥狀。有研究證明，在棉花曲葉病株中不僅分離到了木爾坦棉花曲葉病毒（cotton?leaf?curl?Multan?virus，?CLCuMuV），同時也分離到了類似的DNAβ分子，而且發現DNAβ的存在是棉花葉片產生卷曲癥狀的重要原因［15］。

本研究針對廣東省羅定市番茄種植區周圍勝紅薊病株存在的病原種類進行鑒定，避免存在的主要病原對番茄生長造成危害，為后期防治奠定基礎。首先利用雙生病毒DNAA的檢測引物PA/PB對感病的廣東勝紅薊進行檢測，再通過設計背向引物獲取全長基因組序列，根據獲得的全長基因組序列對分離物分類并分析其遺傳進化關系。利用DNAβ的簡并引物Beta01/02檢測是否存在DNAβ分子，從而確定引起廣東勝紅薊黃脈癥狀的主要病原。

1?材料與方法

1.1?材料來源

2022年9月在廣東省羅定市番茄種植區周圍采集了疑似感染雙生病毒的勝紅薊病株（圖1），

病株葉片均表現為黃綠相間的花葉，葉脈褪綠發黃呈黃色網狀，葉片還表現皺縮、上卷等癥狀（圖1），將其

命名為202209GDSHJ。

圖1?廣東省勝紅薊樣品202209GDSHJ的癥狀

Fig.1?Symptom?of?ageratum?sample?202209GDSHJ

collected?from?Guangdong?province

1.2?植物總DNA的提取及目的片段的擴增

采用CTAB法提取植物總DNA，以提取的勝紅薊樣品DNA為模板，使用檢測雙生病毒的簡并引物PA/PB（PA：5′TAATATTACCKGWKGVCCSC3′;PB：5′TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA3′）進行PCR擴增，擴增程序為：94℃預變性3?min;94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸30?s，共32個循環;72℃延伸10?min。將擴增產物切膠純化回收并且克隆至pGEMT?easy?vector。使用通用引物M13F/M13R檢測陽性克隆并測序（北京擎科生物）。利用DNAβ的簡并引物Beta01/02（Beta01：5′GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC3′;Beta02：5′GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC3′）檢測伴隨的DNAβ衛星分子，PCR擴增程序同上。

根據測序結果設計背向引物202209GDSHJF：（5′TTGATAAGGCTGATATTTGGGAAAGTG

CTT3′）和202209GDSHJR：（5′TATCAGCCTTATCAACCCCGACTAATAAAT3′）擴增該病毒的全長基因組序列，PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化、克隆至pGEMT?easy?vector，篩選陽性克隆，測序（北京擎科生物）得到病毒的全長基因組序列。

1.3?病毒基因組序列分析以及進化樹構建

得到全長基因組序列后，首先通過在線程序ORF?finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定病毒的開放閱讀框;根據獲得的開放閱讀框，利用Snapgene繪制病毒的基因組結構;使用BLAST（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）對獲得的病毒分離物進行同源序列檢索;使用SDT軟件［16］對病毒分離物序列、我國不同省份鑒定的AYVCNV和AYVV病毒分離物以及部分在廣東省鑒定的其他雙生病毒分離物進行比對，并使用MEGA?7.0軟件［17］對以上病毒分離物序列通過鄰接法構建系統進化樹，bootstrap設置為1?000。

2?結果與分析

2.1?勝紅薊疑似雙生病毒侵染葉片的病毒檢測

勝紅薊是很多植物病毒的中間寄主，于2022年９月在廣東省羅定市番茄種植區周圍的勝紅薊植株中發現了疑似感染雙生病毒的病株。為了避免勝紅薊病株存在的病原對番茄造成危害，對其病原進行了分子鑒定。

利用檢測雙生病毒的簡并引物PA/PB?對疑似雙生病毒侵染的勝紅薊病株樣品的DNA進行擴增，得到約500?bp的特異性條帶（圖2a）。隨機選取2個單克隆進行測序，結果表明它們具有99%的核苷酸序列相似性。利用DNAβ的簡并引物Beta01/02在以上樣品中沒有檢測到伴隨的DNAβ衛星分子。

2.2?DNAA全長基因組序列擴增及結構分析

為了獲得病毒的全長基因組核苷酸序列，在已經確定的500?bp序列基礎上設計一對有15?bp重復序列的背向特異性引物，擴增病毒基因組全長（圖2b）。挑取單克隆進行測序，得到2?745?nt的病毒基因組序列，上傳GenBank獲得登錄號OQ819181。經過BLAST分析發現AYVCNV202209GDSHJ病毒分離物的基因組核苷酸序列與中國勝紅薊黃脈病毒海南分離物（AYVCNVDZ，登錄號：OQ421190）的基因組核苷酸序列相似性較高，為98.11%。該分離物的基因組具有典型的單組分雙生病毒基因組結構特征，尤其與已經報道的AYVCNV?的?DNAA?基因組高度一致，包含6個已知的編碼蛋白（圖2c）：病毒鏈編碼29.7?kD的V1?蛋白（294－1?069?nt）和13.6?kD的V2蛋白（134－484?nt），互補鏈上編碼40.8?kD的C1?蛋白（1?516－2?604?nt）、15.5?kD的C2?蛋白（1?209－1?616?nt）、16.0?kD?的C3?蛋白（1?064－1?468?nt）和16.0?kD的C4?蛋白（2?154－2?576?nt），在病毒鏈與互補鏈之間包含有?AYVCNV?復制和轉錄必需元件的非編碼區，其中包含一個9?nt的莖環結構（TAATATT/AC）。

2.3?AYVCNV202209GDSHJ與其他雙生病毒的同源性分析

選取來自我國不同省份的AYVCNV和AYVV病毒分離物以及部分在廣東省鑒定的其他雙生病毒分離物，兩兩比較這些病毒分離物與AYVCNV202209GDSHJ的全長基因組核苷酸序列以及編碼蛋白的氨基酸序列的同源性。結果表明，AYVCNV202209GDSHJ與AYVCNV（OQ421190）相似性最高，并且2個分離物基因組編碼的蛋白的氨基酸相似性均最高，與我國其他地區的AYVCNV分離物的相似性在90%以上（表1）。

為了分析該病毒分離物的系統進化情況，將以上進行同源性比較的病毒分離物基因組全長核苷酸序列通過構建系統進化樹（圖3）分析該病毒分離物的遺傳進化情況。從圖中可以發現，本研究中來自廣東的AYVCNV202209GDSHJ病毒分離物與來自海南的AYVCNV（OQ421190）親緣關系較近，然而與同樣采自廣東的其他雙生病毒分離物遺傳距離較遠。

3?結論與討論

本研究對采自廣東省勝紅薊樣品進行雙生病毒的檢測和鑒定，發現AYVCNV在廣東省侵染勝紅薊。根據國際病毒分類委員會（International?Committee?on?Taxonomy?of?Viruses，?ICTV）雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬分類原則，病毒全長基因組核苷酸序列相似度低于91%?即可劃分為新種［18］。本研究分離到的AYVCNV202209GDSHJ與已經鑒定的AYVCNV（OQ421190）相似性最高，為98.10%，確定AYVCNV202209GDSHJ為雙生病毒AYVCNV的一個分離物。根據Li等［6］2022年對中國雙生病毒種類的發生與分布的研究總結，本研究是在廣東省勝紅薊寄主上首次分離到AYVCNV分離物并且對其病毒基因組結構進行了分析。

通過對分離物AYVCNV202209GDSHJ編碼產物氨基酸序列同源性分析發現，AYVCNV202209GDSHJ編碼的6個蛋白的氨基酸序列與AYVCNV（OQ421190）編碼的蛋白氨基酸序列高度相似，V1、V2、C1、C2和C3蛋白間的相似性均大于94%，C4的相似性為92.78%（表1）。

通過系統進化樹的構建，在廣東省采集鑒定的雙生病毒分離物AYVCNV202209GDSHJ與海南省分離物AYVCNV（OQ421190）在同一分支，具有較近的親緣關系，與同樣是在廣東省鑒定的其他雙生病毒親緣關系較遠（圖3）。出現這樣的現象可能和昆蟲介體對病毒的傳播、作物栽培方式以及人類的活動導致病毒跨區域傳播有關。

勝紅薊作為一種外來入侵雜草，最早只在中國香港發現，隨著生物活動范圍的增加，逐漸在中國各地廣泛生長［1920］。勝紅薊在田間可直接或者間接影響農作物生長，在田間與農作物競爭生長環境。有調查表明，勝紅薊在貴州田間已成為優勢雜草種群［21］。在廣東省勝紅薊可以與多種作物構成優勢生物群落，例如茶樹日本耳草勝紅薊群落和荔枝勝紅薊群落［22］。勝紅薊的整個生育期都與栽培植物伴生，感染病毒的勝紅薊能夠作為病毒庫，其是否攜帶病毒直接影響作物的健康。此外，勝紅薊還是大量病原物的重要寄主，尤其是病毒侵染后的勝紅薊可以作為中間寄主，為病毒提供一個合適的生存環境，在合適時機下病毒會侵染周圍的農作物，從而造成農作物的經濟損失。因此，對于雜草上雙生病毒的檢測是至關重要的，通過對侵染雜草的雙生病毒的盡早防控有利于在源頭上阻止雙生病毒對農作物的侵染。

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（責任編輯：田?喆）