中性粒細胞彈性蛋白酶在支氣管擴張中的生物學功能及中藥干預研究進展*

楊小鈺， 張惠勇， 邸彩霞， 陳林錦， 潘辰慧， 樊雅欣， 張少言， 吳顯偉，鹿振輝， 吳定中， 鄭培永， 邱磊

（1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032； 2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院呼吸與危重癥醫學科， 上海 200025）

支氣管擴張是一種復雜的、具有異質性的慢性氣道疾病，其特征是不可逆的支氣管病理擴張，并伴有咳嗽、咳痰和反復呼吸道感染[1]。2013～2017 年中國成人支氣管擴張患病率增加了2.31 倍，總體患病率以年均32.8%的速度上升，人均總費用和住院費也明顯增加（分別增加了2.18 倍和1.83 倍）[2]。支氣管擴張的病理生理機制復雜，從1986 年COLE 提出“惡性循環”到FLUME 進一步闡釋“惡性旋渦”理論，其機制至今仍未完全明確[3]。支氣管擴張被認為是一種中性粒細胞炎癥疾病，中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）是中性粒細胞原代顆粒中的一種主要蛋白酶，不僅能夠降解彈性蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白等細胞外基質成分，還參與了破壞蛋白酶-抗蛋白酶平衡，促進多種炎癥因子分泌，加重組織、器官炎癥損傷[4]。NE 已被證明是靜脈血栓栓塞[5]、腎小球腎炎、肺氣腫等慢性疾病的生物標志物。NE 在支氣管擴張中同樣扮演重要角色，包括炎癥生物標志物、疾病嚴重程度的潛在預測指標、臨床療效的預測因子、治療的靶點等，但其具體作用及其機制尚不明確。

1 NE結構與分布

NE 是由218 個氨基酸殘基組成的29 KD 絲氨酸蛋白酶，成熟的NE 由6 個反向平行的β 折疊形成1 個β 桶結構，2 個β 桶結構形成的折疊構成了其三維結構，活性位點（組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸）位于2 個桶之間的連接處。NE 在骨髓原核細胞中合成，以成熟形式主要儲存在中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒中[6]。NE 還可存在于核膜及細胞表面，未激活的中性粒細胞膜上也有少量NE 表達，巨噬細胞、平滑肌細胞和肥大細胞也可表達NE。當細菌、毒素損傷顆粒、炎癥細胞因子等激活中性粒細胞時，NE 分布于吞噬溶酶體、中性粒細胞膜表面及細胞外間質，殺滅細菌同時引起炎癥反應誘導肺組織損傷。當活化的中性粒細胞進入彈性蛋白酶依賴的程序性細胞死亡過程（NETosis），NE 易位至細胞核，通過分裂組蛋白參與染色質的降解，釋放中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap, NET）；NE 在機體免疫防御、參與炎癥反應及其調控過程發揮重要作用。

2 NE在支氣管擴張中的生物學功能

在支氣管擴張中，NE 不僅參與調節炎癥反應，而且在控制感染、增加黏液分泌、降解細胞外基質、損害上皮細胞等重要的病理生理環節發揮重要作用。

2.1 促進炎癥反應

在中性粒細胞介導支氣管擴張氣道炎癥反應中，NE 起重要作用。病原體定植是中性粒細胞遷移至氣道的主要刺激來源，炎癥細胞因子趨化中性粒細胞到肺部，中性粒細胞產生多種宿主防御機制，包括吞噬作用、脫顆粒、活性氧的產生、促炎細胞因子的產生和NET 的形成。NE 促進炎癥反應主要通過增加細胞因子的表達和釋放激活促炎癥信號通路，產生級聯反應。白細胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）是一種重要的中性粒細胞趨化因子，在NE 促炎通路上意義顯著，其主要來源于上皮細胞，巨噬細胞、中性粒細胞及肥大細胞等也可分泌IL-8，在炎癥反應中高表達[7]。支氣管擴張患者痰液中NET與NE、IL-8 及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）含量密切相關，可作為疾病活動度的重要標志[8]。除IL-8、TNF-α 外，NE 還可通過激活其他細胞因子如：IL-1α、IL-33、IL-36α、IL-36γ、IL-1β，導致中性粒細胞趨化性和氣道炎癥增加；同時中性粒細胞釋放基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）如MMP-8、MMP-9，加劇氣道炎癥及導致氣道重塑[9]。抗菌IL-37 作為新型支氣管擴張生物標志物，具有廣譜抗菌作用，但支氣管擴張患者反復感染，抗菌肽反而進一步刺激炎癥，加重疾病嚴重程度、增加疾病活動性和氣道感染[10]。

2.2 清除病原體

NE 對氣道感染具有重要的調控作用。氣道感染可直接造成肺組織結構損傷及慢性炎癥，細菌負荷與氣道炎癥標志物直接相關，是支氣管擴張病情加重的主要驅動因素。ORIANO 等[11]通過微生物生態學定量研究發現假單胞菌屬、銅綠假單胞菌種及痰中銅綠假單胞菌基因組拷貝量與支氣管擴張患者痰液中高水平NE 相關。NE 可通過參與吞噬溶酶體形成降解被吞噬的病原體，對革蘭陰性菌有顯著的抗菌活性，NE 可降解銅綠假單胞菌主要的外膜蛋白F（OmpF）達到清除目的，NE 還可直接殺傷組織周圍病原體[12]。另外，通過NETosis 產生NET，可直接捕獲并清除病原菌，蛋白質組學分析證實，痰液中NET 與疾病嚴重程度的密切相關[8]。有研究發現長期霧化吸入慶大霉素可顯著降低痰液中的游離彈性蛋白酶活性及減輕痰液中的細菌負荷[13]。NET對多種病原體均有不同程度的抗感染作用，而這些病原體也通過不同方式逃避NET 捕獲。研究發現銅綠假單胞菌可通過脂多糖、鞭毛和釋放毒力因子等多種刺激物介導NETosis，降解NET，目前對NETosis 與疾病聯系的研究逐漸深入，但NET 在體內的殺滅和控制作用仍存在高度爭議[14]。

2.3 降低氣道分泌物清除能力

NE 可使氣道清除能力降低，導致痰液滯留，成為感染和炎癥的“港灣”。纖毛上皮作用及氣道黏液特征決定了氣道黏液清除率。NE 主要通過上調黏蛋白、損傷氣道纖毛結構及降低氣道液體水化作用降低氣道清除能力。患者氣道感染定植菌（如銅綠假單胞菌）分泌的有毒介質及死亡后的分解物刺激氣道上皮細胞杯狀化生，使氣道處于黏液高分泌狀態。支氣管擴張可表現為小氣道早期和嚴重的黏液膿性梗阻，氣道主要黏蛋白成分是黏蛋白5AC（mucin 5AC, MUC5AC）和黏蛋白5B（mucin 5B,MUC5B）[15]，NE 可上調MUC5AC、MUC5B 的基因表達；NE 還能激活原代人支氣管上皮細胞分泌的黏蛋白。相關細胞因子上調，包括IL-13、IL-1β、IL-6、IL-17、IL-9、TNF-α 等，微生物和微生物產物增加，如脂多糖、肺炎支原體、銅綠假單胞菌、鼻病毒和非分型流感病毒，刺激杯狀細胞化生[16]。NE 可降低纖毛運動功能，損傷纖毛結構，鐘南山院士團隊基于“上-下氣道同病”假說研究發現支氣管擴張患者纖毛功能障礙可繼發于慢性細菌或病毒感染或炎癥標志物損傷，而NE 是調控炎癥、感染的樞紐[17]。在囊性纖維化研究中發現NE 還可通過降解跨膜傳導調節器（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）激活上皮鈉通道（epithelial Na+channel, ENaC）使氣道水化功能受損，導致氣道黏液高濃縮，發生氣道黏液阻塞，為細菌定植創造環境，加重感染，降低肺功能[18]。

2.4 降解細胞外基質及細胞因子

NE 參與降解細胞外基質（extracellular matrix,ECM）及細胞因子，ECM 在氣道重塑方面具有重要意義，細胞因子也貫穿支氣管擴張病理生理過程。ECM 的沉積失衡和降解是支氣管擴張患者氣道重構的重要原因，NE 可特異性降解彈性蛋白、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等多種ECM 蛋白。NE降解彈性蛋白，釋放促纖維化因子轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1），使支氣管擴張患者基底膜增厚，造成氣道不可逆重塑[16]。NE還可影響氣道上皮細胞增殖、分化、凋亡或衰老。NE 降解細胞因子/趨化因子如IL-2、IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）、TNF-α、血管生成因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、細胞受體如蛋白酶激活受體、補體C3bi 等，對炎癥反應、血管生成、免疫防御均產生重要影響[17]。

2.5 參與蛋白酶和抗蛋白酶平衡

NE 作為一種蛋白酶，與抗蛋白酶之間的動態平衡對呼吸免疫系統具有重要作用。蛋白酶與抗蛋白酶失衡可能導致支氣管擴張患者氣道炎癥反應加劇、細胞外基質降解和肺組織損傷。蛋白酶在直接抵抗微生物入侵及調節炎癥因子中起著核心作用。α1 抗胰蛋白酶（α1 antitrypsin, A1AT）是一種由肝細胞、免疫細胞和支氣管上皮細胞分泌的絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑[19]。A1AT 對NE有很高的親和力，支氣管擴張中NE 和A1AT 之間的不平衡及A1AT 的遺傳缺陷或繼發性缺陷可能導致支氣管擴張病情的進展。分泌性白細胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI）是NE 主要靶點，研究顯示唾液中低SLPI 含量與痰液中低SLPI 含量、支氣管擴張嚴重程度指數下降及急性加重頻率降低有關[20]。Elafin 是一種彈性蛋白酶特異性抑制物，作為內源性抗蛋白酶同樣對NE親和力較高，但其抗菌多局限于銅綠假單胞菌[21]。NE 的活性與其抑制劑之間的不平衡可導致肺組織損傷、肺部感染、氣流受限和氣道重塑。

2.6 損害免疫系統

蛋白酶和抗蛋白酶失衡，可能導致高濃度的NE 干擾支氣管擴張患者先天和適應性免疫，進一步促進炎癥，降低清除微生物能力。NE 可以降解乳鐵蛋白（抗微生物糖蛋白），還可通過降解表面活性劑蛋白、補體C3bi 及其受體CR1，以及假單胞菌特異性IgG，使中性粒細胞和巨噬細胞微生物清除功能異常[16]。另外，NE 可通過降解T 細胞表面受體導致淋巴細胞功能受損，并干擾單核來源的樹突狀細胞（monocyte-deriveddendritic cell, mDC）的抗原呈遞過程，導致局部免疫抑制，NE 降解細胞表面受體CD40、CD80 和CD86 來抑制mDC 成熟[22]，導致mDC 無法啟動淋巴細胞增殖或細胞因子的產生。這些機制研究有待在支氣管擴張患者中深入開展。

3 NE抑制劑

支氣管擴張的治療目標是減輕癥狀，延緩病情進展。穩定期以抗菌藥物、氣道廓清、祛痰、黏液活性藥物等為主[23]。但現仍未有效藥物突破“惡性旋渦”壁壘。針對“惡性渦旋”切分治療缺乏大型隨機試驗，暫無強有力證據支持。而NE 可作為臨床治療結果的預測因子和可能的治療靶點。在蛋白酶-抗蛋白酶平衡中識別不同的治療靶點有助于精準治療，但目前NE 內源性抑制劑及外源性抑制劑的臨床療效尚未能達到預期。

3.1 內源性抑制劑

機體合成內源性抗蛋白酶包括A1AT、SLPI、Elafin 以抵抗NE 活性來實現蛋白酶-抗蛋白酶平衡，具有殺菌、抗病毒和抗真菌特性[24]。其中，SLPI和Elafin 屬于警示性抗蛋白酶，A1AT 為系統性抗蛋白酶，當機體受到外界有害刺激導致NE 釋放過多，A1AT 無法抵抗，SLPI、Elafin 可提高活性以平衡機體蛋白酶-抗蛋白酶系統[25]。SLPI 和Elafin 具有“防御素/抗菌肽樣”特性，Elafin 可下調炎癥細胞因子、調節免疫，改善氣道炎癥反應[26]。SLPI 不僅可以抗NE，也可通過核因子κB（nuclear factor kappa-B, NFκB）通路下調巨噬細胞對細菌脂多糖的反應來保護肺組織免受炎癥產物的影響[27]。內源性NE 抑制劑與NE 失衡，需要外源性NE 抑制劑來減少組織損傷和延緩炎癥進展。

3.2 外源性抑制劑

目前臨床開展了諸多外源性NE 抑制劑的研究，探究NE 抑制劑在減少支氣管擴張加重次數、改善肺功能、提高生活質量及預后方面的作用，個別藥物顯示出在某些方面的優勢，但作用機制并不明確，且大多數生物利用度低，穩定性較差，化合物的半衰期較短，其余藥物未顯示出顯著療效或藥物毒副反應超過預期。這可能與NE 檢測方法、研究對象異質性有關。如2013 年，STOCKLEY 等[28]報道了AZD9668（選擇性和可逆的NE 抑制劑）治療38 例支氣管擴張的多中心2a 期隨機對照實驗研究結果：AZD9668 組在改善肺功能方面具有一定優勢，AZD9668 組第1 秒用力呼氣量（forced expiratory volume in first second, FEV1）提高100 mL，炎癥性生物標志物（如IL-6 和IL-8）也有降低的趨勢，但AZD9668 組和安慰劑組的痰液量、癥狀和生活質量沒有顯著差異。2019 年，WATZ 等[29]報道了BAY85-8501（選擇性和可逆的NE 抑制劑）治療94 例非囊性支氣管擴張的多中心2a 期隨機對照實驗研究結果：BAY85-8501 組較安慰劑組在生活質量、肺功能方面未見明顯改善，痰中IL-8 水平略有升高外，不同治療組之間的其他生物標志物沒有顯著差異。2020 年CHALMERS 等[30]報道了DPP-1 抑制劑Brensocatib（可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑）治療256 例非囊性支氣管擴張的多中心2 期隨機對照實驗研究結果：2 種劑量（10 mg 和25 mg）Brensocatib顯著延長了治療6 個月間發生首次肺部加重的時間（134 d VS 96 d，P<0.05）。Brensocatib也顯著降低了肺部癥狀加重的發生率，在治療6 個月間，痰液及血液[31]的NE 濃度與安慰劑相比呈劑量依賴性降低。Brensocatib治療患者最常見的不良反應是咳嗽、頭痛、痰量增多、呼吸困難、感染性支氣管擴張加重和腹瀉。進一步研究外源性NE 抑制劑的臨床效益及作用機制已成為支氣管擴張藥物研發的重要方向。

4 中藥對NE介導氣道炎癥的作用

中醫中，支氣管擴張屬于“肺痿”“咳嗽”“咯血”等范疇[32]，其病機以肺脾虛為本，痰熱瘀為標，以“扶正祛邪”為總治則[33]。中醫藥可通過抗菌、抗病毒、調節炎癥因子、抑制氣道基質破壞、抗氧化應激及調節機體免疫反應等多方面治療支氣管擴張：中藥提取物（如銀杏雙黃酮[34]、柚皮[35]、枇杷葉三萜酸[36]等）、中藥復方及中成藥（如：千金葦莖湯[37]、蔞芩止嗽煎[38]、清肺逐瘀方[39]及肺力咳合劑[40]等）在緩解臨床癥狀、提高肺功能、減輕氣道炎癥反應及減少氣道黏液分泌等方面具有優勢。鐘云青等[41]開展了款冬花散（款冬花、炙麻黃、浙貝母、桑白皮、生石膏、前胡、紫菀、旋覆花、白術、甘草等組成）治療痰熱壅肺證支氣管擴張模型大鼠的研究，結果顯示：款冬花組大鼠氣道肺組織白三烯B4（Leukotriene B4,LTB4）、TNF-α、IL-8、IL-10 含量及mRNA 表達較模型組明顯降低，且呈現一定量效關系。王麗等[42]開展了清金化痰湯（黃芩、麥冬、浙貝母、瓜蔞、桑白皮、山梔子、知母、茯苓、桔梗、陳皮、甘草組成）含藥血清對支氣管擴張大鼠炎癥反應的研究，結果顯示：低劑量組和高劑量組血清IL-8、MMP-9 和TNF-α 水平低于模型組，高劑量組血清IL-8、MMP-9 和TNF-α 水平低于低劑量組。鞏雪等[43]通過生物信息學方法研究發現清金化痰湯中山奈酚在內的多個有效成分可通過介導輔助性T 淋巴細胞17（Thelpercell 17, Th17）細胞分化、缺氧誘導因子-1 信號通路、NF-κB 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路在內的多通路緩解氣道高黏液分泌狀態、減輕炎癥反應。吳其標等[44]開展支擴寧合劑（黃芩、桑白皮、杏仁、枳殼、郁金、南沙參、麥冬、薏苡仁、冬瓜仁、全瓜蔞、黛蛤散、丹參、白茅根組成）治療支氣管擴張模型小鼠的研究，結果表明支擴寧合劑明顯降低NE 含量，抑制其蛋白分解活性。有藥理實驗研究發現黃芩可通過調節前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）和白三烯C4（Leukotrienes C4, LTC4）等炎性介質降低毛細血管通透性，減少白細胞滲出，降低炎癥反應；丹參酮Ⅱ a 對白細胞游走趨化有明顯的抑制作用，丹參對NE 具有直接抑制作用[45]。劉貴穎等[46]開展的痰熱清注射液治療60 例支氣管擴張的小樣本臨床研究發現，經支氣管鏡灌洗痰熱清注射液能明顯減少支氣管擴張患者氣道內NE 的含量；痰熱清注射液中主要成分有抗炎及細胞保護的作用，除黃芩外，連翹能抑制花生四烯酸級聯酶的激活，減少炎癥趨化因子，減少中性粒細胞釋放NE，減輕炎癥反應。溫宇龍等[47]開展了加味蒼麻丸（蒼術、生麻黃、桔梗、萊菔子、黨參、茯苓、瓜蔞、黃芩組成）治療80 例慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）穩定期、支氣管擴張穩定期的臨床研究，結果顯示加味蒼麻丸在減少病情急性加重次數、改善臨床癥狀、提高咳嗽咳痰評估問卷評分（CASA-Q）、減少痰量、改善肺功能方面具有優勢。NE 與COPD 急性加重期所引起的炎癥反應密切相關，中醫藥主要可通過減少炎性介質釋放及氣道黏液分泌緩解氣道炎癥反應，減輕氣道阻塞。鐘秀君等[48]開展了用反激逆從法（代表方：蠲飲泄肺方）治療72 例COPD 急性加重期患者的臨床研究，結果顯示蠲飲泄肺方可調節NE 的表達，降低IL-6 水平而減輕氣道炎癥反應。來薛等[49]發表了固本止咳中藥（黃芪、淫羊藿、白術、蜜百部、赤芍、黃芩、防風組成）治療COPD 模型小鼠后的研究結果，發現其可有效通過增強呼吸道黏膜免疫功能控制COPD 小鼠呼吸道黏膜炎癥，減少肺組織中NE 的過度表達；方中淫羊藿總酮可促進B 淋巴細胞增殖、促進免疫球蛋白分泌；芍藥可抗炎、抗氧化；防風多糖提高胸腺細胞活力[50]。因此，中醫藥具有多靶點、多途徑、多效應的特點，可能通過調控NE 介導的炎癥反應，抑制氣道炎癥、促進黏液清除，延緩病情進展，但中醫藥治療NE 介導的氣道炎癥機制有待進一步明確。

5 總結

支氣管擴張病理機制復雜，微生物感染、免疫缺陷、先天肺/氣管結構異常、慢性肺疾病等各種病因引起支氣管擴張，其病理特征為慢性反復感染、炎癥、纖毛清除能力下降以及肺組織結構受損，出現支氣管異常和持久擴張；黏液纖毛清除受損導致氣道分泌物的積累，破壞正常的宿主防御，使患者更容易受到感染；持續的感染會引發炎癥反應，從而導致異常的氣道重塑和結構損傷。致病環節相互關聯，互為因果。NE 在支氣管擴張發病機制中扮演重要的角色，研發NE 靶向藥物對改善臨床癥狀、減少急性發作次數、改善預后等方面具有重要意義。NE 參與上調細胞黏附分子，促進中性粒細胞與內皮細胞黏附及組織浸潤、蛋白酶-抗蛋白酶平衡、釋放促炎癥分子、激活補體及誘導細胞因子表達，形成惡性漩渦，放大炎癥反應。識別可能評估疾病嚴重程度和預測進展和結果的生物標志物在支氣管擴張診療過程中尤為重要。未來的臨床試驗需要驗證NE 活性的截點，并將NE 作為支氣管擴張患者臨床管理中的一個有效的生物標志物。綜上所述，積極探索NE 在支氣管擴張中的病理生理作用具有以下挑戰：①探索NE 抑制劑干預支氣管擴張各環節靶細胞及信號通路，有效阻斷炎癥級聯反應，控制感染，減少氣道黏液分泌，改善臨床癥狀，致力于NE 內源性抑制劑探索及外源性特異性抑制劑的研發，滿足臨床需求；②進一步探索氣道定植微生物（如銅綠假單胞菌、鏈球菌等）與NE活性關系；③深入研究NE 相關生物標志物，力圖影響上游標志物阻斷NE 釋放；④以往對NE 抑制劑的研究大多未將NE 含量納入隨機對照試驗中，NE 抑制劑可能只針對高NE 含量的患者有效，這也解釋了以往NE 抑制劑臨床療效不顯著的原因。考慮對納入臨床實驗的患者根據NE 含量進行分層，對高含量NE 患者行抑制劑治療，有助于精準施治，制訂個性化的治療方案，提高支氣管擴張臨床診治水平；⑤開展體內外實驗，運用分子生物學、藥理學、多組學等多學科交叉技術，充分闡釋中藥干預NE 介導氣道炎癥的分子機制和效應物質基礎，同步探索中藥與NE 抑制劑的協同作用。基于NE 分層開展隊列研究和中醫證候調查，將NE 等生物標志物與中醫證候聯合，構建用于指導治療和預測結局的中醫證候評價體系。考慮將NE 作為中醫藥治療支氣管擴張的探索性指標，豐富支氣管擴張中醫藥臨床研究的評價指標體系。重視NE 作為生物標志物在支氣管擴張中的作用，制訂合理的治療方案，是未來治療支氣管擴張的方向。