細胞壁降解酶在球刺盤孢侵染過程中的作用

金夢軍 楊成德 李統華 OSEI Richard 蔡鋒鋒 馬婷

摘要

為明確球刺盤孢Colletotrichum?coccodes產生的細胞壁降解酶（CWDEs）在其侵染馬鈴薯過程中的作用，本文對球刺盤孢離體和活體條件下產生的CWDEs種類及活性進行檢測，并通過RTqPCR測定了球刺盤孢侵染過程中多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因的表達情況。通過定性測定發現，球刺盤孢能夠產生果膠酶、纖維素酶和蛋白酶;定量測定發現，球刺盤孢可產生羧甲基纖維素酶（Cx）、β葡萄糖苷酶（βGlu）、PG和聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）。在活體條件下，球刺盤孢可在馬鈴薯莖稈內產生PG、PMG和多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE），且酶活分別于接種后48、72?h和144?h達到最大值，分別為26.50、77.61?U/mL和0.16?U/mg。分別將羧甲基纖維素鈉和果膠誘導后的酶液接種至馬鈴薯莖稈可引起植物組織浸腐，與球刺盤孢引起的典型癥狀相似。除此之外，球刺盤孢的4個PGs基因均在其侵染后24?h和48?h顯著共上調表達。綜上所述，該研究結果表明，果膠酶在球刺盤孢致病過程中發揮重要作用。

關鍵詞

球刺盤孢;?馬鈴薯;?細胞壁降解酶;?多聚半乳糖醛酸酶

中圖分類號：

Q?939.9

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023263

The?role?of?cell?walldegrading?enzymes?of?Colletotrichum?coccodes?during?its?infection

JIN?Mengjun，?YANG?Chengde*，?LI?Tonghua，?OSEI?Richard，?CAI?Fengfeng，?MA?Ting

（Biocontrol?Engineering?Laboratory?of?Crop?Diseases?and?Pests?of?Gansu?Province，?College?of?Plant

Protection，?Gansu?Agricultural?University，?Lanzhou?730070，?China）

Abstract

To?determine?the?function?of?cell?walldegrading?enzymes?（CWDEs）?secreted?by?Colletotrichum?coccodes?during?infecting?potato?stems，?the?types?and?activities?of?CWDEs?secreted?by?C.coccodes?both?in?vivo?and?in?vitro?were?investigated，?the?gene?expression?levels?of?four?polygalacturonases?（PG）?of?C.coccodes?were?also?assessed?using?RTqPCR.?The?qualitative?measurement?results?indicated?that?C.coccodes?secretes?pectinase，?cellulase，?and?protease?on?detection?plates?in?vitro，?and?the?qualitative?determination?results?demonstrated?that?it?secretes?carboxymethyl?cellulase?（Cx），?βglucosidase?（βGlu），?polygalacturonase?（PG），?and?polymethylgalacturonase?（PMG）?on?detection?medium?in?vitro.?In?addition，?C.coccodes?produces?PG，?PMG?and?polygalacturonic?acid?transeliminase?（PGTE）?during?its?infection?to?potato?stems?in?vivo，?with?peak?activities?of?26.50，?77.61?U/mL?and?0.16?U/mg?48?h，?72?h?and?144?h?postinoculation，?respectively.?Inoculating?crude?enzymes?induced?by?sodium?carboxymethylcellulose?and?pectin?onto?potato?stems?could?cause?potato?stem?rotting?similar?to?the?typical?symptoms?caused?by?C.coccodes?on?potato?stems.?Moreover，?four?PGs?of?C.coccodes?showed?significantly?upregulated?coexpression?24?h?and?48?h?postinoculation.?Collectively，?these?data?demonstrated?the?important?role?of?pectinase?in?the?pathogenic?process?of?C.coccodes.

Key?words

Colletotrichum?coccodes;?Solanum?tuberosum;?cell?walldegrading?enzymes;?polygalacturonase

馬鈴薯是我國重要農作物之一，2021年，中國馬鈴薯總產量約占全球總產量的23%，居世界首位［1］。然而，隨著種植面積增加，馬鈴薯晚疫?。?］、枯萎?。?］、瘡痂?。?］和炭疽?。?］等病害發生越來越普遍。其中，由球刺盤孢Colletotrichum?coccodes引起的炭疽病是馬鈴薯生產上的一種毀滅性病害，可在馬鈴薯整個生長期發生，侵染后在感病植株的根、塊莖和莖稈上形成典型的黑色小顆粒，即分生孢子盤［6］，導致葉片干枯［7］，整株萎蔫、壞死，嚴重時發病率可達到30%～50%［8］。目前，炭疽病的發病面積和造成的經濟損失還在持續上升。2019年，球刺盤孢引起的馬鈴薯炭疽病在中國河北和墨西哥被首次發現，造成嚴重損失［9］。因此，了解球刺盤孢的致病因子對有效防治馬鈴薯炭疽病具有重要意義。

寄主植物細胞壁包含纖維素、果膠、半纖維素等組分，其作為保護屏障，可抑制病原菌的侵入［10］。然而，病原菌分泌的細胞壁降解酶（cell?wall?degrading?enzymes，?CWDEs），如纖維素酶和果膠酶等能夠打破這種屏障，促進病原菌侵入寄主植物體內［11］，加速病害的發展。如尖孢刺盤孢C.acutatum產生的CWDEs幫助其侵入植株，引起橡膠樹炭疽?。?2］。真菌可分泌不同種類的CWDEs［13］，而CWDEs?的多樣性也反映了植物細胞壁結構的復雜性和病原菌生活方式的多樣性［14］。有學者認為，病原菌的致病性與CWDEs的活性相關，CWDEs的活性越高，該菌株的致病性越強［15］。豆類殼球孢Macrophomina?phaseolina不同菌株在侵染玉米、向日葵和西瓜種子的過程中產生的CWDEs活性不同，其致病性也存在差異［16］。從咖啡樹上分離的33株盤長孢狀刺盤孢?C.gloeosporioides均可以產生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶和果膠酶［多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）

、聚甲基半乳糖醛酸酶（polymethylgalacturonase，PMG）

和果膠裂解酶］，其中致病力較高的菌株?19和?124?可以分泌高活性的CWDEs［17］。尖孢刺盤孢引起的橡膠樹炭疽病中，葉片上病斑大小與果膠裂解酶活性具有相關性，且在發病的葉片中檢測到了?β葡萄糖苷酶和纖維素二糖酶［12］。因此，病原菌分泌的CWDEs?在其侵染寄主植物的過程中可能作為毒力因子發揮致病作用，尤其是纖維素酶和果膠酶［1819］。

致病菌在侵染寄主植物時首先分泌果膠酶降解植物細胞壁，被降解的細胞壁在為病原菌提供碳源的同時還能促進纖維素酶和半纖維素酶降解植物細胞壁中的其他組分，最終加速病原菌在寄主體內的擴展［20］。有研究表明，果膠酶的活性決定著病原菌的致病性，是導致植物發病的重要因素之一［21］。實生鏈核盤菌Monilinia?fructicola在侵染蟠桃時會分泌PMG和PG，且引起褐腐等癥狀［22］。在馬鈴薯病害的研究中，多種病原菌在侵染過程中會產生水解酶，且果膠酶的活性隨著培養基的不同而發生變化［23］。對33株盤長孢狀刺盤孢分泌的果膠酶（PG和PMG）活性進行測定發現，其與病原菌的致病性相關［17］。除此之外，康振生等［24］采用免疫細胞化學法觀察禾谷鐮孢Fusarium?graminearum侵染小麥穗組織時發現，病原菌產生的果膠酶可引起寄主細胞壁松弛。PGs屬于糖苷水解酶28家族（GH28），能夠催化果膠和半乳糖醛酸中1，4αD半乳糖醛酸鍵的水解，降解植物細胞壁中果膠成分，促進病原菌順利侵入［25］。PGs在離體和活體條件下的活性與病原真菌的毒力大小相關［15］，如Alternaria?patula［26］和小新殼梭孢Neofusicoccum?parvum［27］的毒力常與PGs的活性呈正相關。將來自豆刺盤孢Colletotrichum?lindemuthianum的PG在農桿菌內瞬時表達后，接種至煙草葉片時可引起過敏性壞死反應（hypersensitive?response，HR）［28］。平頭刺盤孢C.truncatum侵染大豆時，PG首先被“激活”，并協助?PMG?和果膠裂解酶降解大豆細胞壁成分［29］。以上研究表明，PG在病原真菌的致病過程中發揮重要作用。然而，根據之前相關報道，球刺盤孢的致病機制常與附著孢和侵入釘的形成［30］以及果膠酸裂解酶［31］相關，而關于其產生的其他細胞壁降解酶在其致病過程中是否發揮毒力作用研究較少。

因此，本研究以球刺盤孢為研究對象，通過定性和定量方法測定其在寄主體內和體外產生的主要果膠酶和纖維素酶的種類及其活性，并確定其是否在球刺盤孢致病過程中發揮作用，以期明確球刺盤孢分泌的CWDEs種類，及其與球刺盤孢致病性之間的相關性，通過RTqPCR確定PG基因在球刺盤孢侵染過程中的表達情況，為球刺盤孢果膠酶致病機制的研究奠定基礎。

1?材料和方法

1.1?材料

1.1.1?供試菌株與植物

馬鈴薯炭疽病病原菌：球刺盤孢Colletotrichum?coccodes，由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及生物多樣性實驗室提供。供試植物：馬鈴薯，?品種‘大西洋。

1.1.2?供試試劑

50?mmol/L的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH?5.0）、醋酸醋酸鈉緩沖液（pH?5.0）和甘氨酸氫氧化鈉緩沖液（GlyNaOH，pH?9.0）；1%的羧甲基纖維素鈉（CMC）（pH?5.0）、水楊苷（pH?5.0）、果膠（pH?5.0）和多聚半乳糖醛酸（pH?5.0）；3?mmol/L?CaCl2；1?mol/L?NaCl；3，5二硝基水楊酸（Dinitrosalicylic?acid，DNS）（棕色瓶保存）;均由實驗室配制。

1.1.3?供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：用于球刺盤孢的活化；

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（PDB）：用于球刺盤孢孢子懸浮液制備。

細胞壁降解酶誘導培養基：2?g?KNO3，0.5?g?KCl，0.01?g?FeSO4，1?g?K2HPO4，0.5?g?MgSO4·7H2O，10?g?碳源（柑橘果膠：用于果膠酶誘導;羧甲基纖維素鈉：用于纖維素酶誘導），1?000?mL雙蒸水。用于球刺盤孢分泌的細胞壁降解酶的定量測定。

葡萄糖酵母提取物蛋白胨培養基（glucose?yeast?extracts?peptone?medium，GYP）：1?g葡萄糖，0.1?g酵母提取物，0.5?g蛋白胨，16?g瓊脂，2?g可溶性淀粉，1?000?mL蒸餾水。用于細胞壁降解酶的定性分析。

果膠瓊脂培養基（pH?5.0）：5?g果膠，1?g酵母提取物，15?g瓊脂，1?000?mL蒸餾水。用于果膠酶活性的定性分析。

1.2?試驗方法

1.2.1?球刺盤孢細胞壁降解酶分泌活性的定性測定

球刺盤孢于PDA平板25℃黑暗培養7?d，打取5?mm菌餅轉接至纖維素酶、蛋白酶和果膠酶檢測培養基平板上培養7?d。以只接種5?mm?PDA瓊脂培養基的平板為對照。通過染色觀察球刺盤孢分泌纖維素酶、蛋白酶和果膠酶的能力，每處理組接4皿。具體測定方法如下：

纖維素酶分泌活性定性測定：將5?mm球刺盤孢菌餅接種至含有0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium?carboxymethylcellulose，CMC）（pH?6.0）的GYP平板。25℃黑暗培養7?d后，將0.2%剛果紅溶液平鋪于平板表面染色30?min，ddH2O漂洗干凈后，用1?mol/L?NaCl脫色15?min。如接種球刺盤孢的培養基背景由紅色變為黃色，說明其具有產纖維素酶的能力［10］。

蛋白酶［10］和果膠酶［32］分泌活性定性測定：將5?mm球刺盤孢菌餅分別接種至含有0.4%明膠（pH?4.0）的GYP平板和果膠瓊脂培養基上。25℃培養7?d后，分別用10%飽和硫酸銨溶液和1%十六烷基三甲基溴化銨水溶液浸沒15?min，如菌落周圍出現明顯的透明圈，表明球刺盤孢具有產生蛋白酶和果膠酶的能力。

1.2.2?球刺盤孢細胞壁降解酶分泌活性的定量測定［3334］

1.2.2.1?培養基中球刺盤孢細胞壁降解酶粗酶液的提取及純化

分別在250?mL的細胞壁降解酶誘導培養液和PDB培養液中接種10個球刺盤孢菌餅（5?mm），于搖床（HNY203T，天津歐諾儀器股份有限公司）中25℃、120?r/min振蕩培養，分別于培養24、48、72、96、120、144、168?h和192?h過濾菌絲，培養液10?000?r/min?離心30?min，收集上清液，即為待測粗酶液。利用60%飽和硫酸銨對所得粗酶液進行濃縮。具體為：將粗酶液與60%飽和硫酸銨混合，4℃靜置5?h，4℃?14?000?r/min離心25?min，棄上清，將沉淀溶解于50?mmol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液（pH?5.0）中，4℃透析48?h，得到純化酶液。

1.2.2.2?球刺盤孢侵染馬鈴薯莖稈后細胞壁降解酶的提取

將球刺盤孢接種至PDB中，25℃，120?r/min振蕩培養獲得孢子懸液（108個/mL），將其接種至馬鈴薯莖稈，于接種后24、48、72、96、120?h和144?h分別收集馬鈴薯發病部位及周圍的組織樣本（每個時間段收集混合樣品共1?g）于無菌研缽中，加入1?mol/L?NaCl（9?mL/g組織）進行研磨，收集研磨勻漿液，4℃、10?000?r/min?離心20?min，收集上清液于4℃保存。以接種無菌水后研磨的馬鈴薯組織上清液為對照。以球刺盤孢侵染后馬鈴薯體內CWDEs活性與無菌水接種后CWDEs活性的差值表示球刺盤孢侵染莖稈時所分泌的CWDEs活性。每個時間段收集3份樣品用于試驗。

1.2.2.3?標準曲線繪制

葡萄糖標準曲線：在8個空的10?mL離心管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?mL和1.4?mL濃度為1?mg/mL的葡萄糖溶液，補足蒸餾水至2?mL，分別加入2?mL?DNS，使葡萄糖濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30?mg/mL和0.35?mg/mL，混勻后煮沸5?min，自來水冷卻，加入5?mL蒸餾水。以含有0?mg/mL葡萄糖的溶液為對照，利用紫外分光光度計測定不同濃度葡萄糖溶液的OD540。以葡萄糖濃度為橫坐標，對應濃度的OD540為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

D半乳糖醛酸標準曲線：標準曲線繪制方法同葡萄糖標準曲線，其中，以D半乳糖醛酸［用50?mmol/L的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH?5.0）配制］代替1?mg/mL葡萄糖，且自來水冷卻后的混合液用蒸餾水定容至10?mL。最后，利用紫外分光光度計測定不同濃度D半乳糖醛酸的OD540，以不加D半乳糖醛酸的混合液為對照。以D半乳糖醛酸的濃度為橫坐標，對應的OD540為縱坐標，繪制D半乳糖醛酸標準曲線。

牛血清蛋白標準曲線：用蒸餾水將1?mg/mL的牛血清蛋白分別稀釋為0、20、60、100、140、180、220?μg/mL?和260?μg/mL，再分別加入5?mL考馬斯亮藍G250，混勻后靜置2?min。以含0?mg/mL牛血清蛋白的混合液作為空白調零，利用紫外分光光度計測定各管OD595。以牛血清蛋白的濃度為橫坐標，對應的OD595為縱坐標，繪制牛血清蛋白標準曲線。

將1?mL待測粗酶液與5?mL考馬斯亮藍G250混勻，靜置2?min后測定OD595，試驗重復3次。

以加入1?mL?50?mmol/L?醋酸鈉緩沖液（pH?5.0）的混合液為對照，再根據牛血清蛋白標準曲線計算酶液蛋白濃度［35］。

1.2.2.4?細胞壁降解酶活性的定量測定

羧甲基纖維素酶和β葡萄糖苷酶活性：

將1?mL待測酶液與1?mL檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（50?mmol/L，pH?5.0）混合，加入1?mL底物［1%?CMC和1%水楊苷分別為測定

羧甲基纖維素酶（Cx）和β葡萄糖苷酶（βGlu）酶活性的底物］，50℃保溫30?min后加入2?mL?DNS，于沸水中加熱終止反應（測定Cx和βGlu活性的離心管分別加熱10?min和5?min），分別測定各樣品于540?nm處的吸光度，根據葡萄糖標準曲線計算葡萄糖濃度。對照組是先加入DNS終止反應，再加入底物，其他步驟與處理組相同。每個試驗重復3次。將1個酶活力單位定義為：在50℃和pH?5.0的條件下，1?mL酶液水解CMC或水楊苷1?h產生1?mg葡萄糖所需酶量。

酶活力（U/mL）=（As-A0）/（K×V×T）×Dr，式中，As：樣品酶的OD540;A0：空白樣品酶的OD540;K：標準曲線斜率;Dr：稀釋倍數;V：取樣量（mL）;T：反應時間（h）。

PG和PMG活性：測定方法與上述方法相似。其中，測定PG和PMG活性的底物分別為1%多聚半乳糖醛酸和1%果膠，50℃保溫60?min。根據D半乳糖醛酸標準曲線，計算PG和PMG酶活力。每個試驗重復3次。將1個酶活力單位定義為：在50℃和pH?5.0條件下，1?mL酶液水解1?h多聚半乳糖醛酸或果膠產生1?mg?D半乳糖醛酸所需酶量。

酶活力（U/mL）=（As-A0）/（K×V×T）×Dr，

式中，As：樣品酶的OD540;A0：空白樣品酶的OD540;K：標準曲線斜率;Dr：稀釋倍數;V：取樣量（mL）;T：反應時間（h）。

多聚半乳糖醛酸反式消除酶（polygalacturonic?acid?transeliminase，PGTE）和果膠甲基反式消除酶（pectin?methyltranseliminase，PMTE）活性：分別用1%多聚半乳糖醛酸和1%果膠作為底物進行酶活性檢測。具體操作方法：1?mL待測粗酶液中加入1?mL?50?mmol/L?GlyNaOH（pH?9.0）緩沖溶液，再加入1?mL底物和1?mL?3?mmol/L?CaCl2溶液，混勻，30℃條件下反應60?min，立即加入2?mL?DNS終止反應，自來水冷卻后，加入蒸餾水，定容至6?mL，測定其OD232。其中，對照組先加入DNS終止反應后再加入底物。每個試驗重復3次。1個酶活力單位定義為：在30℃和pH?5.0?條件下，1?mL酶液1?min水解多聚半乳糖醛酸或果膠產生1?μmol不飽和醛酸所需酶量。

酶活性（U/mg）=（ΔOD232×0.1×Dr）/（0.17×C×T），式中，△OD232：OD232（反應T時間后）-?OD232（反應初期）;Dr：稀釋倍數;0.17：每釋放0.1?μmol不飽和醛酸，在232?nm處增加的OD232值;C：粗酶液蛋白濃度（mg/mL），根據牛血清蛋白標準曲線計算;T：反應時間（h）。

1.2.3?經果膠和纖維素誘導的球刺盤孢粗酶液對馬鈴薯莖稈的浸解作用

在細胞壁降解酶培養基中分別利用CMC和果膠對球刺盤孢進行誘導培養，誘導培養96?h后，采用1.2.2.1的方法提取粗酶液并純化。分別取100?μL純化的纖維素酶和果膠酶液接種至健康的馬鈴薯莖稈（用5號昆蟲針針刺造成微傷口，且利用75%乙醇進行表面消毒）。以接種球刺盤孢為陽性對照組，以接種無菌水為陰性對照組。72?h后，觀察并記錄纖維素粗酶液和果膠粗酶液對馬鈴薯莖稈組織的浸解作用。

1.2.4?球刺盤孢侵染過程中PG基因的相對表達量

選擇4個具有信號肽且在侵染馬鈴薯莖稈過程中上調表達的PGs基因［Cluster14407.17878，?Cluster14407.16352、Cluster83170.0和Cluster84997.0，屬于糖苷水解酶28家族（GH28）］，采用RTqPCR（QuantStudio5，ABI，美國）測定其在球刺盤孢侵染馬鈴薯后3、6、12、24、48、72?h和96?h?的表達情況，以收集于PDA平板的球刺盤孢菌絲和分生孢子的轉錄本作為對照組（0?h）。采用OMEGA真菌RNA提取試劑盒（OMEGA?Biotek，?Georgia，?美國）提取球刺盤孢樣本的RNA，以此為模板，利用PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit（TaKaRa?Biotechnology?Co.，?Ltd.，?北京，中國）合成球刺盤孢的單鏈cDNA。利用Primer?Premier?6.0設計PGs基因的RTqPCR引物，以球刺盤孢的18S?rRNA作為內參基因（表1）［31］。RTqPCR的擴增程序為：95℃?10?min；40個循環（95℃?15?s，60℃?30?s，72℃?30?s）；熔解曲線（95℃?15?min，60℃?60?s，95℃?15?s）。擴增體系為（20?μL）：10?μL?2x?SYBR?Green?qPCR?Master?Mix，上、下游引物各1?μL?（10?μmol/L），1～100?ng?球刺盤孢cDNA，0.4?μL?ROX?Reference?Dye（No.2）。利用2-ΔΔCt計算基因相對表達量，其中ΔΔCt=（Ct處理組目標基因-?Ct處理組18S?rRNA）-（Ct對照組目標基因-?Ct對照組18S?rRNA）［36］，每個試驗重復3次。

2?結果與分析

2.1?球刺盤孢細胞壁降解酶活性定性測定結果

球刺盤孢在離體條件下具有產生CWDEs的能力。分別在以羧甲基纖維素鈉和明膠作為誘導底物的GYP培養基上，球刺盤孢可以分泌纖維素酶和蛋白酶，在果膠瓊脂培養基上可分泌

果膠酶。其中，將球刺盤孢接種至含有0.5%?CMC的GYP平板，培養7?d后，通過染色可明顯觀察到菌絲覆蓋的培養基背景色由染色后的紅色變為黃色（圖1a），說明培養基中有纖維素酶的產生;于含有0.4%明膠的GYP平板上，球刺盤孢菌落周圍出現明顯的透明水解圈（圖1b），說明有蛋白酶產生;用1%十六烷基三甲基溴化銨水溶液浸沒接種球刺盤孢的果膠瓊脂平板后，其菌落周圍出現明顯的透明圈（圖1c），說明球刺盤孢能夠產生果膠酶水解培養基中的果膠進而形成水解圈;同時，對照組平板均無明顯變化?（圖1a′，b′和c′）。

2.2?球刺盤孢細胞壁降解酶活性的定量測定結果

2.2.1?標準曲線

分別測定不同濃度葡萄糖、D半乳糖醛酸和牛血清蛋白在540、540?nm和595?nm處的吸光度，以此繪制標準曲線。得到的標準曲線方程分別為：y=6.916?4x+0.017?9（R2=0.999?6），y=5.371?4x-0.036?6（R2=0.998?5）和?y=0.006?2x+0.016?1（R2=0.997?3）。

2.2.2?培養基中球刺盤孢分泌的細胞壁降解酶活性

離體條件下，在細胞壁降解酶誘導培養基中球刺盤孢可分泌

Cx、βGlu、PG和PMG，其酶活性隨著培養時間的增長，呈現先升高后降低的變化趨勢。其中，Cx和βGlu活性均在培養120?h時達到峰值，其酶活性分別為0.657?9?U/mL（圖2a）和0.6145?U/mL（圖2b），但與培養144?h時的酶活性無顯著差異

（P<0.05）;在底物為果膠的細胞壁降解酶誘導培養基中，球刺盤孢分泌的PG和PMG活性分別于培養后96?h和72?h達到峰值，分別為103.553?U/mL（圖2c）和137.849?U/mL（圖2d），達到峰值之后，PG活性相比PMG活性出現大幅度降低。由此可見，球刺盤孢經果膠誘導能夠產生大量的PG和PMG，且產生的細胞壁降解酶活性為：PMG＞PG＞Cx＞βGlu。

在PDB培養基中，球刺盤孢僅能產生PG和PMG。其中，PG和PMG活性分別于培養后120?h和96?h達到峰值，其酶活性分別為79.309?U/mL（圖3a）和163.955?U/mL（圖3b），達到峰值后其活性均顯著下降（P<0.05）。球刺盤孢于PDB培養基中培養24～192?h內，PG和PMG活性的變化范圍分別為19.445～79.309?U/mL和114.02～163.955?U/mL，?與含有底物的細胞壁誘導培養基中

所產生的PG和PMG活性相似，且PMG＞PG。

2.2.3?球刺盤孢侵染馬鈴薯莖稈后分泌的細胞壁降解酶活性

將球刺盤孢接種至馬鈴薯莖稈，檢測其侵染過程中PG、PMG、PGTE和PMTE的活性。結果表明，在接種后24～144?h，其在莖稈內分泌的PG、PMG和PGTE活性均大于0?U/mL?（或U/mg）（圖4a～c），但未檢測到PMTE活性。其中，PG活性在接種后48?h達到最大值，為26.50?U/mL（圖4a）;PMG活性在接種后72?h達到峰值，為77.61?U/mL（圖4b），顯著高于其他互作時間段的酶活性（P<0.05）。除此之外，在球刺盤孢接種馬鈴薯莖稈后24～120?h，PGTE活性較低，接種后144?h達到最大值，為0.16?U/mg（圖4c）。該結果表明，球刺盤孢在侵染馬鈴薯莖稈的過程中，能夠在馬鈴薯莖稈體內產生較多的PMG，其次為PG和PGTE，但不能產生PMTE。

2.2.4?球刺盤孢細胞壁降解酶對馬鈴薯莖稈的浸解作用

將羧甲基纖維素鈉（圖5a）和果膠（圖5b）誘導后的濃縮酶液接種至馬鈴薯莖稈72?h后，其接種部位組織被浸解，出現褐色和梭形壞死癥狀，與接種球刺盤孢（圖5c）的發病癥狀相似。其中，與接種纖維素酶液后的馬鈴薯莖稈相比，果膠酶液在馬鈴薯莖稈上的活性較高，對植物細胞壁組織的浸解作用較強，能夠明顯造成馬鈴薯莖稈變褐。接種無菌水的馬鈴薯莖稈并未表現出任何組織壞死等癥狀（圖5d）。結果表明，果膠酶在球刺盤孢侵染過程中發揮重要作用，可作為毒力因子，加速對馬鈴薯莖稈的浸解，可促進球刺盤孢的順利侵入。

2.2.5?球刺盤孢侵染過程中PG基因的相對表達量

采用RTqPCR對4個含有信號肽，且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的PGs基因［屬于糖苷水解酶28家族（GH28）］在球刺盤孢侵染過程中的表達量進行分析，發現Cluster14407.17878?和Cluster14407.16352在球刺盤孢侵染的整個過程中（3～96?h）持續上調表達。其中，Cluster14407.17878在接種后24?h顯著上調表

達（P<0.05），其相對表達量是對照的21.38倍;Cluster14407.16352在接種后48?h顯著上調表達（P<0.05），其相對表達量是對照的45.50倍

。除此之外，Cluster83170.0在接種后24?h開始上調表達，且在24?h時表達量最高，為對照的41.36倍，在接種后96?h的表達量顯著低于其他互作時間段的表達量（P<0.05）。Cluster84997.0僅在接種后24?h和48?h上調表達。通過RTqPCR測定發現，球刺盤孢的4個PGs基因主要在其侵染馬鈴薯后24?h和48?h共表達（圖6）。

3?結論與討論

植物細胞壁含有多種組分，還能抵御病原菌的入侵。然而，為了能夠打破寄主植物的物理屏障順利進入寄主植物細胞，并在寄主體內定殖和擴展，病原菌會分泌大量的CWDEs降解植物細胞壁組分，以加速其侵染過程［15］。通常，果膠酶、纖維素酶和蛋白酶的活性與病原菌的致病性相關［37］。球刺盤孢在含誘導底物的平板上可以產生果膠酶、纖維素酶和蛋白酶。同時，在纖維素和果膠誘導下可產生Cx、βGlu、PG和PMG。果膠酶是致病真菌產生的一類重要的細胞壁降解酶，在病原菌早期致病過程中發揮重要作用，其降解植物細胞壁果膠成分，從而促進病原菌的侵入［3839］。在本研究中，PG和PMG在離體和活體條件下均于培養后或接種后24?h被檢測到，其活性經底物誘導培養96?h和72?h達到峰值，且高于Cx和βGlu的活性。但有研究表明，立枯絲核菌Rhizoctonia?solani經果膠誘導48?h才能產生PG和PMG，隨著培養時間的增加，其活性逐漸增加，分別于培養10?d和12?d達到峰值［40］。本研究中，球刺盤孢在細胞壁降解酶誘導培養液中產生最多的CWDEs是PMG，其次是PG、Cx和βGlu，?其中，PMG的活性范圍為86.59～137.849?U/mL，在誘導后72?h達到峰值。在山藥組織中，草酸青霉Penicillum?oxalicum的βGlu酶活性低于果膠酶和Cx［41］，本研究結果與此一致。本研究結果表明，球刺盤孢在果膠誘導下會產生大量的果膠酶，果膠酶可能是病原菌的一個致病因子。

通過活體接種發現，球刺盤孢侵染馬鈴薯后?48?h?和72?h，馬鈴薯莖稈內PG和PMG活性最高，分別為26.50?U/mL和77.61?U/mL。但有研究表明，Colletotrichum可在誘導培養基中產生大量PG，而在寄主植物活體組織內檢測不到PG［12］，這與本研究結果不同。PG在球刺盤孢侵染馬鈴薯的過程中可能發揮重要作用。此外，在球刺盤孢侵染馬鈴薯莖稈后24～48?h，莖稈內PG活性相比其他互作時間段高，說明PG可能在球刺盤孢的活體營養階段協助病原菌侵入寄主植物并引起病害癥狀。有研究表明，PGTE可在玉米彎孢霉葉斑病菌Curvularia?lunata侵染玉米后72?h產生，并在外源鐵的作用下可導致植物病害發生［33］。球刺盤孢在侵染馬鈴薯時，馬鈴薯莖稈內也檢測到PGTE，但在侵染后24～120?h內其活性水平較低，于侵染后144?h活性顯著升高，說明PGTE可能在球刺盤孢的死體營養階段發揮作用。在馬鈴薯莖稈上接種CMC和果膠誘導的酶液，進一步證實了果膠酶和纖維素酶具有降解植物細胞壁的作用，且果膠誘導的粗酶液相比CMC誘導的粗酶液在馬鈴薯莖稈上引起的浸腐癥狀更明顯。同樣，Babalola［42］認為，纖維素酶和果膠酶能夠促進Fusarium?compactum侵入分枝列當Orobanche?aegyptiaca，并造成其死亡率大于50%。以上研究結果表明，球刺盤孢分泌的果膠酶可能在降解馬鈴薯植株細胞壁和促進球刺盤孢侵染過程中發揮重要作用，尤其是PG和PMG。

除此之外，BenDaniel等［31］設計簡并引物，克隆了球刺盤孢的果膠裂解酶基因，并證實其可作為致病因子影響球刺盤孢的致病性。而在本文中，通過對球刺盤孢侵染馬鈴薯后上調表達的4個PGs基因的動態表達情況進行監測，初步確定其與球刺盤孢的侵染過程具有相關性。其中，這4個PGs基因在球刺盤孢侵染后24?h共同顯著上調表達，而通過生理生化檢測，球刺盤孢產生的PG活性峰值出現在其侵染馬鈴薯后48?h，這主要是因為病原菌生理生化的表現常受控于基因表達的調控，因此基因的表達往往早于生理生化特征的表現［43］，證實了本試驗的結論。除此之外，Cluster14407.17878?和?Cluster14407.16352在球刺盤孢侵染馬鈴薯后3～96?h內持續上調表達。Cluster83170.0和?Cluster84997.0在侵染馬鈴薯后24?h開始被誘導表達，其中，Cluster84997.0僅在侵染馬鈴薯后24?h和48?h表達，表明其可能在球刺盤孢侵染中期參與對馬鈴薯細胞壁的降解，而玉蜀黍黑粉菌Ustilago?maydis分泌的PG在其侵染后10?d才能被檢測到［44］，說明PG家族內的不同基因在不同病原菌的不同侵染時期發揮重要作用。糖苷水解酶28家族（GH28）的CWDEs通常具有協同作用和功能冗余現象，其中一個基因編碼的CWDEs活性會受到其他CWDEs的影響［45］。有報道表明，缺少多聚半乳糖醛酸酶基因pgxB的黑曲霉Aspergillus?niger對蘋果果實的致病性明顯降低，但是，通過RTqPCR檢測發現，同一家族內其他PG基因（pgal、pgall、pgaA、pgaC、pgaD和?pgaE）的表達量明顯增加，且PG活性也明顯升高［46］。在本試驗中，球刺盤孢分泌的PG活性在其侵染后48?h最高，而球刺盤孢的4個PGs基因在其侵染后24?h顯著共上調表達，且不同時間段4個PG基因的表達量存在差異，該結果表明，這4個PGs基因可能在球刺盤孢侵染馬鈴薯的整個過程具有協同作用。然而，關于它們在球刺盤孢致病過程中的作用，以及它們各自之間的互作機制，還需有待進一步研究。

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