HSYA對人晶狀體上皮細胞系SRA01/04生物學特性的影響

李詩怡 王康 黃菊 張澳 張培培 謝迎賓

濱州醫學院附屬醫院眼科，濱州 256603

目前，手術仍是白內障患者復明的唯一方式，術后殘留的人晶狀體上皮細胞（HLECs）出現增殖、遷移及上皮-間質轉化（EMT），使后囊膜出現混濁與纖維化，稱為后發性白內障（PCO）。盡管手術方式及人工晶狀體材質與設計的改進均在一定程度上降低了PCO的發病率，但仍改變不了其為白內障術后最常見的并發癥。Nd∶YAG激光后囊膜切開術作為PCO唯一有效治療手段，仍無法避免黃斑水腫、視網膜脫離、眼壓升高及人工晶狀體損傷等并發癥的出現［1］。因此，有效抑制HLECs增殖、遷移及EMT成為防治PCO的關鍵。近年來，羥基紅花黃色素A（HSYA）被發現可抑制脂多糖誘導的非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲、遷移及EMT［2］，也有研究發現HSYA可延緩心、肺、腎等臟器纖維化［3-5］。現在HSYA在眼科，尤其是在晶狀體相關疾病中的研究較少［6-7］。本研究通過體外實驗觀察HSYA對人晶狀體上皮細胞系SRA01/04（HLEC-SRA01/04）增殖、遷移及EMT的影響，旨在探討HSYA在PCO防治中的價值。

材料與方法

1.細胞系及主要試劑儀器

HLEC-SRA01/04，廣州賽庫生物技術有限公司；HSYA，上海麥克林生化科技股份有限公司；重組人表皮生長因子（rhEGF），美國PEPROTECH公司；胎牛血清（FBS），南美洲Lonsera公司；增強型25%胰蛋白酶-EDTA消化液、四甲基偶氮唑藍（MTT）、Transwell細胞培養小室，廣州白鯊生物科技有限公司；兔單克隆抗增殖細胞核抗原（PCNA）抗體，Abcam；兔單克隆抗波形蛋白（Vimentin）抗體，武漢ABclonal公司；山羊抗兔過氧化物酶二抗，中衫金橋；實時熒光定量PCR（qPCR）單鏈合成試劑盒，北京全式金生物技術股份有限公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；自動酶標分析儀（AT-858），美國熱電Thermo公司；PCR擴增儀、qRT-PCR儀，德國Eppendorf公司。研究時間為2022年6月至2023年9月。

2.方法

2.1.HLEC-SRA01/04的培養 將HLEC-SRA01/04原代細胞復蘇后接種于4 ml的完全培養基中（含有20% FBS、1%青霉素鏈霉雙抗的DMEM高糖培養基），置于含體積分數為5% CO2、37 ℃的恒溫孵育箱中培養，2 d換液1次，根據細胞生長狀況，在細胞對數生長期內，細胞融合度為80%～90%時，按1∶3比例傳代培養。取4次傳代后的細胞進行后續實驗。

2.2.MTT法確定rhEGF誘導增殖的濃度 取對數生長期的細胞用胰酶消化，培養基（含2% FBS）重懸，血球計數板計數，T25培養瓶中細胞濃度為90×104個/ml，按每孔100 μl細胞懸液、4×103個細胞接種于96孔板中，待12 h細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入100 μl含0、1、5、10、50 μg/L rhEGF的低血清培養基，每個濃度樣本均設置5個復孔，分別處理24 h后，棄去孔中培養基，每孔加入40 μl濃度為5 mg/L的MTT溶液及160 μl含2% FBS的DMEM高糖培養基，在培養箱中孵育4 h后吸除孔內液體，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），待結晶完全溶解后，酶標儀在490 nm處檢測吸光度值（OD值），依據公式計算增值率（%）=（不同濃度細胞因子組平均OD值-空白對照組平均OD值）×100%/空白對照組的平均OD值。

2.4.細胞劃痕實驗確定rhEGF誘導遷移及EMT的濃度 將對數生長期細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁且融合度達80%～90%時，替換低血清培養基，饑餓過夜，使用100 μl槍頭做細胞劃痕，磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗細胞碎片2遍，按實驗分組向每孔內分別加入含0、1、10、50 μg/L rhEGF的低血清培養基，固定同一劃痕位置，分別在培養箱中孵育24 h，用光學顯微鏡拍照，Image J軟件測定并分析細胞的遷移距離，依據下列公式計算各組的細胞遷移率（%）=（初始劃痕距離-遷移后劃痕距離）/初始劃痕距離×100%。

2.5.實驗分組 根據MTT法確定HSYA藥物在HLEC-SRA01/04細胞中24 h的IC50值為（76.520±0.954）μmol/L，48 h的IC50值為（66.094±2.508）μmol/L，故后續實驗HSYA的藥物濃度分組為0、20、40、70、100 μmol/L；根據MTT及細胞劃痕實驗結果，后續實驗中均使用5 μg/L rhEGF用于誘導增殖，50 μg/L誘導遷移及EMT。以下為后續實驗分組：空白對照組為僅低血清培養基培養的HLEC-SRA01/04；含0 μmol/L HSYA+rhEGF處理組；含20 μmol/L HSYA+ rhEGF處理組；含40 μmol/L HSYA+rhEGF處理組；含70 μmol/L HSYA+rhEGF處理組；含100 μmol/L HSYA+rhEGF處理組。

2.6.細胞劃痕實驗檢測不同濃度HSYA作用不同時間對rhEGF誘導的HLEC-SRA01/04遷移能力的影響 按2.4中實驗方式將細胞接種于6孔板并做細胞劃痕，按上述實驗分組處理細胞，固定同一劃痕位置，分別在培養箱中孵育0、24、48 h時，于顯微鏡下拍照記錄。

2.7.Transwell小室實驗檢測不同濃度HSYA作用24 h對rhEGF誘導的HLEC-SRA01/04遷移能力的影響 將SRA01/04細胞分組處理24 h后，分別消化并使用含雙抗無FBS培養基重懸，按每孔1×104個細胞接種于已水化好的上層小室中，在每個下層小室內置含30% FBS的完全培養基，于培養箱中孵育24 h，吸除小室內液并擦除上層小室內細胞，固定染色后，清洗染料，于倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件計數，細胞遷移率=視野中穿過濾過膜的細胞數，每組隨機選取3個不同視野取平均數。

2.8.蛋白印跡法（Western Blot）檢測PCNA及EMT標記物Vimentin的表達情況 按上述實驗分組，分別使用含5 μg/L及50 μg/L rhEGF的不同濃度HSYA溶液處理6孔板內貼壁細胞，培養24 h后，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液沖洗2遍后分組提取細胞內蛋白，二喹啉甲酸法測定總蛋白濃度，每個樣本總蛋白上樣量為30 μg，電泳、轉膜后，將轉好的膜置于快速封閉液中室溫封閉15 min，分別使用一抗稀釋液（5 μg/L組-抗PCNA抗體抗；50 μg/L組-Vimentin抗體）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，二抗稀釋液室溫孵育1 h，再次洗膜，滴加超敏發光液曝光、顯影。每個樣本重復3次實驗。Image J軟件分析處理目標條帶的光密度值。

2.9.逆轉錄熒光定量聚合鏈式反法（RT-qPCR）檢測PCNA及EMT標記物Vimentin的mRNA表達水平 按上述實驗分組處理細胞，給藥后24 h，使用Trizol法分組提取總RNA，反轉錄后，按qPCR反應體系，進行擴增。PCNA、Vimentin和β-肌動蛋白（β-actin）mRNA引物序列均由蘇州金唯智生物技術有限公司合成，引物序列（每個樣本設3個復孔）：PCNA-F：5’-GCTCCATCCTCAAGAAGGTGT-3’，PCNA-R：5’-GGAGCTAATATCCCAGCAGGC-3’；Vimentin-F：5’-AGGCGAGGAGAGCAGGATTT-3’；Vimentin-R：5’-AGTGGGTATCAACCAGAGGGA-3’；β-actin-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；β-actin-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

3.統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，采用單因素方差分析法，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.MTT比色法測定HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（表1）

表1 不同濃度rhEGF對HLECs增殖的影響（±s）

表1 不同濃度rhEGF對HLECs增殖的影響（±s）

注：rhEGF為重組人表皮生長因子，HLECs為人晶狀體上皮細胞，OD為吸光度；與陰性對照組比較，aP＜0.05

組別OD值增殖率（%）0 μg/L rhEGF（陰性對照組）1 μg/L rhEGF 5 μg/L rhEGF 10 μg/L rhEGF 50 μg/L rhEGF 0.492±0.018 0.520±0.011a 0.650±0.019a 0.573±0.008a 0.545±0.011a 1.000 1.058±0.030 1.322±0.068a 1.163±0.043a 1.108±0.019a

HLECs經不同濃度rhEGF培養后，1 μg/L rhEGF濃度組、5 μg/L rhEGF濃度組、10 μg/L rhEGF濃度組、50 μg/L rhEGF濃度組OD值及增殖率均高于陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

當讀者在頭腦中對這首詩進行精細復述時，lover這個詞在譯者的先驗里應該與美好的愛情有關，這就會抑制讀者關于“dream”噩夢、夢魘的相關聯想，只會激活其夢或者夢想的概念。“drive”可能激活開車、駕駛、驅趕、發動等動作，但與后面的“orioles”會為譯者提供物體的背景情景來幫助判斷所要提取的意義，在此處要選取“驅趕”之意。以此類推，根據上下文提供背景的模擬運演，本詩構建出的情景模型是一位少女正在夢中與自己的心上人約會，不料被枝頭啼叫的黃鸝鳥驚醒，盡管鳥兒歌聲動聽，但打斷了少女與情人的約會。通過這一心理過程讀者理解的詩的主體是少女思念情人。

2.不同濃度及時間下HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（表2）

表2 不同濃度及時間下HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（±s）

表2 不同濃度及時間下HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（±s）

注：rhEGF均為5 μg/L；HSYA為羥基紅花黃色素A，rhEGF為重組人表皮生長因子，HLECs為人晶狀體上皮細胞，OD為吸光度；與陰性對照組比較，aP＜0.05；與24 h增殖抑制率比較，bP＜0.05

48 h增殖抑制率（%）0 14.3±3.7a 27.4±3.1a 42.6±2.7a 59.2±2.2a 81.0±1.0ab組別0 μmol/L HSYA+rhEGF（陰性對照組）20 μmol/L HSYA+rhEGF 40 μmol/L HSYA+rhEGF 60 μmol/L HSYA+rhEGF 80 μmol/L HSYA+rhEGF 100 μmol/L HSYA+rhEGF 24 h OD值0.562±0.005 0.494±0.008a 0.455±0.026a 0.384±0.016a 0.260±0.003a 0.164±0.003a 24 h增殖抑制率（%）0 12.1±0.6a 19.0±3.8a 31.5±2.2a 53.7±0.4a 70.8±0.3a 48 h OD值0.692±0.022 0.592±0.018a 0.502±0.006a 0.394±0.008a 0.282±0.016a 0.131±0.005a

不同濃度HSYA與5 μg/L rhEGF共同作用于HLECs不同時長后，隨著HSYA濃度升高，孔內OD值逐漸減小，HSYA對HLECs增殖抑制率逐漸升高，表現出明顯的濃度依賴性；同一濃度作用下，HSYA對HLECs的48 h增殖抑制率均高于24 h，但僅有100 μmol/L濃度組差異有統計學意義（P＜0.05），其余各濃度組24 h與48 h的抑制率差異均無統計學意義（均P＞0.05）；作用24 h后，HSYA對HLECs的IC50值為（76.520±0.954）μmol/L，48 h的IC50值為（66.094±2.508）μmol/L。

3.細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA對rhEGF誘導的HLECs遷移的影響

不同濃度rhEGF作用24 h后，0、1、10、50 μg/L組的遷移率分別為（45.6±9.7）%、（46.1±3.1）%、（58.3±6.8）%、（83.1±2.7）%，隨著rhEGF濃度增加，細胞遷移率逐漸增加，除0 μg/L與1 μg/L組間外，其余各組間差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖1、圖2。

圖1 細胞劃痕實驗測定不同濃度rhEGF對HLECs遷移率的影響

圖2 不同濃度組rhEGF作用于HLECs后的劃痕實驗結果

4.細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA對rhEGF誘導HLECs遷移的影響

不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導的HLECs 24、48 h后，各組細胞劃痕實驗結果見圖3。空白組及0、20、40、70、100 μmol/L組的24 h細胞遷移率分別為（46.9±1.8）%、（90.0±1.5）%、（88.4±2.1）%、（43.3±6.6）%、（31.5±16.2）%、（5.82±5.2）%，48 h細胞遷移率分別為（81.1±2.3）%、100%、（95.5±0.1）%、（72.6±3.5）%、（58.5±6.1）%、（37.4±7.1）%，隨HSYA濃度增加，HLECs遷移率逐漸下降，具有濃度依賴性，各組數據經單因素ANOVA檢驗發現，0 μmol/L與20 μmol/L組間在24 h和48 h作用時長下，差異均無統計學意義（均P＞0.05），證明當HSYA濃度≥40 μmol/L時，HSYA可明顯抑制50 μg/L rhEGF誘導HLECs的遷移（圖4、圖5）。

圖3 不同HSYA濃度組作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs 24 h及48 h后的劃痕實驗

圖4 細胞劃痕實驗測定不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs的24 h遷移率

圖5 細胞劃痕實驗測定不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs的48 h遷移率

5.Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA對rhEGF誘導HLECs遷移的影響

Transwell小室實驗結果顯示：空白組及0、20、40、70、100 μmol/L組的細胞數分別為（171.667±20.407）個、（290.222±24.135）個、（198.667±16.826）個、（161.222±5.981）個、（134.111±6.850）個、（67.444±7.351）個，其中40 μmol/L與70 μmol/L濃度組的穿膜細胞數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組的穿膜細胞數

圖7 不同HSYA濃度組作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs 24 h后的Transwell小室實驗

6.Western blot法分析各組內PCNA及Vimentin含量

空白組與0 μmol/L HSYA組PCNA及Vimentin相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；各組蛋白PCNA及Vimentin表達量隨HSYA濃度升高而降低，其中0 μmol/L與40、70、100 μmol/L組內PCNA及Vimentin含量比較（均P＜0.05），當HSYA濃度≥40 μmol/L時，可明顯抑制rhEGF誘導HLECs內PCNA與Vimentin的表達（圖8～10）。

圖8 Western Blot法測定各組PCNA及Vimentin蛋白的表達水平

圖9 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞PCNA蛋白的相對表達量

圖10 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞的Vimentin相對表達量

7.RT-qPCR法分析各組內PCNA及Vimentin的mRNA表達量

PCNA及Vimentin的mRNA含量均隨HSYA的濃度升高而降低，其中當HSYA濃度≥40 μmol/L時，PCNA與Vimentin的mRNA表達量與0 μmol/L組相比，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖11、圖12。

圖11 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞PCNA 的mRNA相對表達量

圖12 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞的Vimentin mRNA相對表達量

討論

白內障術后殘留的HLECs異常增殖、遷移及分化是導致后囊膜出現白色纖維化混濁的主要原因，臨床上PCO的病理改變主要分為再生型和纖維化型，前者為殘余晶狀體細胞在手術機械刺激后出現的異常增殖與分化，后者可見紡錘形細胞的出現、基質沉積和后囊膜皺縮［8］，患者自身基礎疾病（如糖尿病）、年齡、術式、人工晶狀體材質都與PCO的發病率有關系［9］。在對發病機制的進一步研究發現，白內障術后眼內炎癥因子的表達明顯增加，可刺激表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子、纖維生長因子等細胞因子進入激活狀態，它們在PCO的發生、發展中起著關鍵作用［10-11］。

EGF最早發現于小鼠頜下腺，在人體內由十二指腸及頜下腺分泌，存在于人所有的體液中，且人晶狀體中可檢測到相應受體的表達［12-13］。Majima［14］在確保低血清中無rhEGF的前提下，提出EGF可有效促進晶狀體上皮細胞（LECs）的增殖潛力，其中，1 μg/L的EGF作用較好，而10 μg/L的EGF還可以促進LECs的纖維化。Kampmeier等［13］提出5 μg/L EGF可誘導HLEC-SRA01/04增殖。胡艷紅等［15］添加不同濃度rhEGF培養牛晶狀體上皮細胞，發現當rhEGF濃度為50 μg/L時，促生長作用明顯。進一步研究發現，使用EGF可抑制人晶狀體上皮細胞系HLE-B3 Ad12/SV40增殖、遷移及細胞內基質收縮［16］。Jang等［17］提出EGF可通過細胞外調節蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路介導基質金屬蛋白酶的表達，促進HLECs發生遷移。本研究選取rhEGF構建體外PCO模型發現，rhEGF可有效促進HLEC-SRA01/04增殖，而HLEC-SRA01/04的遷移表現出對rhEGF明顯的濃度依賴性。

紅花也稱草紅花或刺紅花，具有活血化瘀、通經止痛功效，而HSYA是紅花黃色素的主要活性成分［18-19］，具有抗炎、調控細胞凋亡、抑制新生血管生成、抗凝等多種藥理作用［6］，不僅可抑制肺癌［2］、結直腸癌［20］及食道癌［21］等腫瘤細胞增殖與分化，還可抑制3T3-L1前脂肪細胞［22］、臍靜脈內皮細胞［23］、成纖維細胞［24-25］、血小板衍生生長因子［26］或脂多糖［27］誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移，逆轉心、肝、肺等臟器纖維化［3-5，28］。近年來，也有眼科學者發現，紅花黃色素可改善糖尿病大鼠視網膜的血流灌注，拮抗小鼠視網膜光損傷［29-30］。HSYA可降低高糖環境下血管內皮細胞的VEGF表達，并抑制其增殖［31］；紅花黃色素可上調抗氧化蛋白表達水平，使晶狀體免受氧化損傷［7］。

本研究在采用體外rhEGF誘導HLEC-SRA01/04模擬PCO的發生發展過程，觀察HSYA對其增殖、遷移及EMT的影響。MTT、細胞劃痕及Transwell小室實驗結果顯示，HSYA可以抑制rhEGF誘導的HLEC-SRA01/04增殖與遷移，具有較好濃度依賴性。HSYA可抑制間質細胞標記物Vimentin mRNA與蛋白的表達，具有較好濃度依賴性，使HLECs的遷移能力下調。近年來與PCO發病機制相關的細胞因子及基因［32-34］研究不斷深入，對于HSYA對HLECs生物學特性影響的具體作用靶點，仍需進一步實驗探究。

綜上所述，HSYA可抑制rhEGF誘導的HLECs增殖、遷移及EMT，并下調PCNA與Vimentin基因及蛋白表達，提示HSYA有希望成為PCO防治中的新型藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李詩怡：醞釀和設計試驗，實施研究，采集、分析/解釋數據，起草文章，統計分析；王康：醞釀和設計試驗，統計分析；黃菊：醞釀和設計試驗，分析/解釋數據；張澳、張培培：醞釀和設計試驗，采集數據；謝迎賓：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經費，指導，支持性貢獻