miR-150-5p、miR-135b在糖尿病腎病患者中的表達(dá)及意義

馬利軍 劉占軍 韓繼明

1延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，延安 716000；2延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延安 716000

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）主要并發(fā)癥，表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿、血壓升高，若未積極處理，極易演變?yōu)榻K末期腎病（end stage renal disease，ESRD），5年生存率不足50.0%［1-2］。因此，需深入了解DN發(fā)病機(jī)制，尋找新的診療靶點(diǎn)，重點(diǎn)干預(yù)其發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)，延緩疾病進(jìn)展，促進(jìn)預(yù)后良好轉(zhuǎn)歸。微小核糖核酸（miRNA）屬于小分子非編碼RNA，可通過抑制靶基因mRNA參與生物體病理及生理過程［3］。相關(guān)研究表明，DN患者腎臟組織及外周血可見miR-150-5p、miR-135b等特異性miRNA表達(dá)，其水平升高與腎臟損傷有關(guān)，或可反映尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rates，UAER）、預(yù)后情況［4-5］。本研究對(duì)外周血miR-150-5p、miR-135b與UAER、預(yù)后關(guān)系展開討論分析，以期為DN患者病情及預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

1.臨床資料

采用前瞻性研究方法，選取2019年1月至2021年10月延安大學(xué)附屬醫(yī)院收治的85例DN患者作為DN組，另納入76例單純T2DM患者作為T2DM組，80例健康體檢者作為對(duì)照組。3組性別、年齡、體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 3組臨床資料比較

本研究經(jīng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過（S-S20230007）。

2.選取標(biāo)準(zhǔn)

⑴納入標(biāo)準(zhǔn)。符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：伴有多尿、不能解釋體質(zhì)量下降、多飲，任意血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L；符合DN診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：兩次晨尿尿蛋白肌酐比≥25 mg/g，3次UAER平均值20～200 μg/min，血肌酐＜265 μmol/L；年齡≥18歲；患者知曉并簽署知曉同意書；⑵排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腎臟疾??；妊娠或哺乳期；近3個(gè)月內(nèi)服用腎毒性藥物；1型糖尿??；臨床資料缺失，且依從性低下。

3.方法

⑴miR-150-5p、miR-135b檢測(cè)：入院后1～2 d，采集2 ml清晨空腹外周肘靜脈血，室溫下離心15 min（2 500 r/min，離心半徑6 cm），吸取400 μl上層血清，轉(zhuǎn)移至新離心管中，-80℃保存。應(yīng)用美國(guó)ABI公司7500型熒光定量酶標(biāo)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），PCR總反應(yīng)體系為15 μl，反應(yīng)條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85℃ 5 min。擴(kuò)增條件為95℃ 10 min一個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s、60℃ 60 s 45個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次，各個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct值，U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-150-5p、miR-135b相對(duì)表達(dá)水平，△Ct=Ct目的基因-Ctu6。⑵UAER評(píng)價(jià)：根據(jù)翟莎娜等［8］文獻(xiàn)將UAER分為＜30 mg/24 h、30～300 mg/24 h、＞300 mg/24 h 3個(gè)等級(jí)。⑶預(yù)后評(píng)價(jià)：DN患者均接受降糖、限制蛋白攝入量、降低尿蛋白等治療。治療后12個(gè)月采用門診或電話隨訪，腎小球?yàn)V過率（GFR）＜15 ml·min-1·1.73 m-2為發(fā)生ESRD。

4.觀察指標(biāo)

⑴3組外周血miR-150-5p、miR-135b水平。⑵DN組不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平。⑶外周血miR-150-5p、miR-135b水平與UAER相關(guān)性。⑷不同預(yù)后患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平。⑸外周血miR-150-5p、miR-135b水平預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD價(jià)值。⑹外周血miR-150-5p、miR-135b水平對(duì)DN并發(fā)ESRD危險(xiǎn)度的影響。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，Spearman分析外周血miR-150-5p、miR-135b水平與UAER相關(guān)性，繪制受試者操作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC），分析外周血miR-150-5p、miR-135b水平預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD價(jià)值，采用相對(duì)危險(xiǎn)度（RR）及其95%置信區(qū)間（CI）分析外周血miR-150-5p、miR-135b水平對(duì)DN并發(fā)ESRD危險(xiǎn)度的影響。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較

外周血miR-150-5p、miR-135b水平DN組＞T2DM組＞對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 3組外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較（±s）

表2 3組外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較（±s）

注：DN組為糖尿病腎病患者，T2DM組為2型糖尿病患者，對(duì)照組為健康體檢者；DN為糖尿病腎病，T2DM為2型糖尿病

miR-135b 3.96±0.51 1.24±0.48 0.66±0.12 1 519.26＜0.001組別DN組T2DM組對(duì)照組F值P值例數(shù)85 76 80 miR-150-5p 3.36±0.68 1.03±0.62 0.78±0.21 560.11＜0.001

2.DN組不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較

DN組UAER＞300 mg/24 h患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平＞UAER 30～300 mg/24 h患者＞UAER＜30 mg/24 h患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 DN組不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較（±s）

表3 DN組不同UAER患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較（±s）

注：DN為糖尿病腎病，UAER為尿白蛋白排泄率

項(xiàng)目UAER＜30 mg/24 h UAER 30～300 mg/24 h UAER＞300 mg/24 h F值P值例數(shù)27 38 20 miR-150-5p 2.73±0.51 3.42±0.64 4.10±0.92 23.53＜0.001 miR-135b 3.02±0.49 3.87±0.61 5.40±0.87 78.25＜0.001

3.外周血miR-150-5p、miR-135b水平與UAER相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，DN患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平與UREA呈正相關(guān)（r=0.783、0.835，均P＜0.001）。見圖1、圖2。

圖1 糖尿病腎病患者外周血miR-150-5p與UAER相關(guān)性（85例）

圖2 糖尿病腎病患者外周血miR-135b水平與UAER相關(guān)性（85例）

4.不同預(yù)后患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較

治療后12個(gè)月隨訪，85例DN患者2例因地址更換失訪，3例因電話號(hào)碼更換失訪，15例發(fā)生ESRD［18.75%（15/80）］。發(fā)生ESRD患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平均高于未發(fā)生ESRD患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病腎病患者不同預(yù)后外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較（±s）

表4 糖尿病腎病患者不同預(yù)后外周血miR-150-5p、miR-135b水平比較（±s）

注：ESRD為終末期腎病

項(xiàng)目發(fā)生ESRD未發(fā)生ESRD t值P值例數(shù)15 65 miR-150-5p 4.41±0.55 3.14±0.38 10.67＜0.001 miR-135b 4.67±0.61 3.81±0.42 6.53＜0.001

5.外周血miR-150-5p、miR-135b水平預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD價(jià)值

ROC顯示，外周血miR-150-5p預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的AUC為0.733（95%CI0.623～0.826），截?cái)嘀禐?.49，敏感度及特異度分別為53.33%、87.69%；外周血miR-135b預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的AUC為0.829（95%CI0.729～0.904），截?cái)嘀禐?.38，敏感度及特異度分別為66.67%、90.77%；兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的AUC為0.944（95%CI0.868～0.983），敏感度及特異度分別為86.67%、87.69%。見圖3。

圖3 DN患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的ROC（85例）

6.外周血miR-150-5p、miR-135b水平對(duì)DN并發(fā)ESRD危險(xiǎn)度的影響

以ROC獲取外周血miR-150-5p、miR-135b水平最佳截?cái)嘀禐榻绶譃楦咚胶偷退?，?jīng)RR假設(shè)檢驗(yàn)，可認(rèn)為外周血miR-150-5p、miR-135b高水平和低水平對(duì)DN并發(fā)ESRD的RR均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=2.133、2.895，P=0.033、0.004）。外周血miR-150-5p、miR-135b高水平患者并發(fā)ESRD的RR分別為低水平的3.619倍、10.889倍。見表5。

表5 外周血miR-150-5p、miR-135b水平對(duì)DN并發(fā)ESRD危險(xiǎn)度的影響

討論

DN發(fā)病率是糖尿病總?cè)藬?shù)的20.0%～40.0%，典型病理特征是腎小管基底膜及腎小球基底膜增厚、腎小球間質(zhì)纖維化、腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性堆積，綜合作用下誘發(fā)蛋白尿，甚至腎功能衰竭［9-11］。DN發(fā)病機(jī)制迄今未明，深入探究其發(fā)病機(jī)制對(duì)確定合理防治措施，促進(jìn)預(yù)后改善意義重大［12-13］。

近年miRNA在DN診斷及療效評(píng)估中發(fā)揮重要作用，其在DN中的靶向調(diào)控作用有望成為新型治療靶點(diǎn)。因此，有必要了解DN患者體內(nèi)miRNA種類及表達(dá)情況［14-16］。miR-135b最初多用于肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌鑒別診斷，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其在腎臟疾病中存在過量表達(dá)，且表達(dá)主要位于腎小管上皮細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞，提示其可能參與腎臟疾病發(fā)病過程［17-18］。田霖林等［19］指出，DN患者外周血miR-135b水平高于健康體檢人群，推測(cè)與其調(diào)控Smad5基因促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖及腎臟纖維化有關(guān)，本研究結(jié)果與其一致。與上述研究不同的是，本研究采用UREA來評(píng)價(jià)腎功能損傷程度，UREA水平升高提示腎功能損傷程度相對(duì)嚴(yán)重［20-21］。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，外周血miR-135b水平隨UAER升高而升高，可見下調(diào)miR-135b水平有望延緩腎損傷，控制DN進(jìn)展。隨訪發(fā)現(xiàn)，ESRD患者外周血miR-135b水平高于非ESRD患者，具有ESRD預(yù)測(cè)價(jià)值，與吳忠璟等［22］觀點(diǎn)相近。推測(cè)原因?yàn)椋適iR-135b具有細(xì)胞毒性，可誘發(fā)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎癥等一系列病變，加劇DN病情進(jìn)展，最終導(dǎo)致其演變?yōu)镋SRD。進(jìn)一步研究表明，miR-135b高水平患者并發(fā)ESRD的RR是低水平的10.889倍，95%CI1.503～78.872，充分佐證miR-135b參與DN病情進(jìn)展和惡化，抑制miR-135b表達(dá)有望成為DN治療新靶點(diǎn)之一。

miR-150主要功能為抑制惡性腫瘤增殖分化、促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、減少Ⅰ型膠原纖維含量，尤適用于淋巴細(xì)胞相關(guān)性惡性腫瘤及免疫性疾病鑒別診斷［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度miR-150可通過細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)阻礙蛋白1上調(diào)促纖維因子表達(dá)，誘發(fā)腎組織纖維化病變，可作為腎臟纖維化生物標(biāo)志物之一［24］。miR-150-5p是由miR-150前體的5，端臂加工而來，結(jié)構(gòu)、功能相似。筆者推測(cè)miR-150-5p可能參與DN發(fā)生發(fā)展的整個(gè)病理過程。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，DN組外周血miR-150-5p水平＞T2DM組＞對(duì)照組（均P＜0.05），說明miR-150-5p與DN發(fā)病有關(guān)，與楊翠伶［25］研究結(jié)論相近。外周血miR-150-5p水平與UREA呈正相關(guān)，考慮原因與DN患者存在長(zhǎng)期血糖異常狀態(tài)有關(guān)，極易損傷內(nèi)皮功能，導(dǎo)致血管收縮，引起腎臟損害，而隨著腎臟損害程度加重，與之相關(guān)的miR-150-5p水平表達(dá)異常升高，形成惡性循環(huán)，增加ESRD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前，關(guān)于DN患者miR-150-5p的研究多集中于疾病預(yù)測(cè)或病情評(píng)估，鮮少報(bào)道m(xù)iR-150-5p水平與DN預(yù)后關(guān)系［22-24］。本研究對(duì)此展開討論分析，發(fā)現(xiàn)外周血miR-150-5p預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的AUC為0.829，miR-150-5p高水平患者并發(fā)ESRD的RR是低水平的3.619倍，95%CI1.105～11.856，臨床可將外周血miR-150-5p作為DN并發(fā)ESRD的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，有利于降低ESRD發(fā)生率。另外，外周血miR-150-5p、miR-135b單一預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD價(jià)值仍存在一定局限性，故本研究擬嘗試探討兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的AUC達(dá)0.944，優(yōu)于各指標(biāo)單一預(yù)測(cè)，可為臨床早期預(yù)測(cè)ESRD提供有利參考信息。

綜上所述，外周血miR-150-5p、miR-135b水平與DN患者UAER呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)DN并發(fā)ESRD的重要輔助手段，為臨床診治提供可靠數(shù)據(jù)支持。但本研究樣本量偏少，隨訪時(shí)間過短，今后需擴(kuò)大樣本量，增加隨訪時(shí)間進(jìn)行更為深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明馬利軍：研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、采集數(shù)據(jù)、文章撰寫、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、統(tǒng)計(jì)分析；劉占軍：研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、采集數(shù)據(jù)、文章修改、統(tǒng)計(jì)分析；韓繼明：研究設(shè)計(jì)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、指導(dǎo)