小片蝽線粒體基因組及蝽科系統(tǒng)發(fā)育分析

摘 要：為了從線粒體基因組水平探討小片蝽 Sciocoris lateralis 在蝽科的分類地位，豐富蝽科線粒體基因組基本 數(shù)據(jù)，為蝽科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化研究提供一定的理論依據(jù)，通過高通量測序，首次測定并分析了小片蝽完整線粒體基 因組（Genbank 登錄號：OP531920），提取蝽科物種的 13 個蛋白編碼串聯(lián)序列（PCGs），使用最大似然法、貝葉斯 法 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 。 結(jié) 果 顯 示 ，小 片 蝽 昆 蟲 的 線 粒 體 全 基 因 組 長 度 為 15 445 bp，包 括 13 個 蛋 白 編 碼 基 因 （Protein-coding genes，PCGs）、2 個 rRNA 基 因（ribosome RNAs，rRNAs）、22 個 tRNA 基 因（transfer RNAs， tRNAs）和 1 個控制區(qū)（Control region）。小片蝽線粒體基因組結(jié)構(gòu)排序與其他蝽科物種一致，均無基因重排現(xiàn)象。 小片蝽線粒體全序列 AT 含量為 74.26%，GC 含量為 25.74%。13個蛋白編碼基因中，cox1、nad1和 nad6的起始密 碼子為 TTG，其余 10 個蛋白編碼基因的起始密碼子是 ATT、ATA、ATG。在所測得的 tRNA 基因中，trnS1 和 trnV 缺失 DHU 臂，其他 20 個 tRNA 均能折疊形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。基因錯配方式主要為 G-U 錯配。基于 13 個 PCGs 構(gòu)建的蝽科系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，小片蝽與斑須蝽的親緣關(guān)系最近并且位于蝽亞科分支，支持二星蝽 族 Eysarcorini和 Strachiini族的單系性，而棕蝽族 Caystrini和腹溝族 Halyini互為姐妹群，這與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果 一致；益蝽亞科與蝽亞科曼蝽屬（Menida）形成姐妹群關(guān)系，該系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)研究結(jié)果不一致。

關(guān) 鍵 詞 ：小片蝽；線粒體基因組；蝽科；系統(tǒng)發(fā)育

中 圖 分 類 號 ：Q969.35+1.6 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0078?11

蝽科 Pentatomidae 由 Leach 于 1815 年建立，是 蝽總科 Pentatomoidea 中種群數(shù)量最大的科，世界分布 10 亞科近 5 000 種。蝽科物種大部分為植食性 昆蟲，以刺吸式口器吸食蔬菜、果樹和森林等幼枝 嫩葉汁液，是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，例如，稻綠蝽 Nezara viridula危害水稻、赤條蝽Graphosoma rubrolineatum 危害傘形花科植物，此外，有部分是捕食性昆蟲， 蠋蝽 Arma custos 捕食鱗翅目、鞘翅目幼蟲等害蟲， 是生物防治的利用對象[1] 。小片蝽 Sciocoris latera? lis Fieber，1851 隸屬于半翅目 Hemiptera 蝽科 Pen? tatomidae 蝽亞科 Pentatominae 片蝽屬。該屬昆蟲 多分布于熱帶地區(qū)，國內(nèi)外對該屬的記錄也多為形 態(tài)特征描述。小片蝽蟲體較小且體色較暗；前胸背 板前側(cè)緣具一顯著的黃白色寬帶，向后不甚達(dá)側(cè)角 外緣；小盾片長寬約相等，端部寬闊圓鈍，基角凹陷 明顯，各胸節(jié)腹板黑色，中、后胸腹板凹槽狀；足黃 褐色。小片蝽以成蟲形態(tài)刺吸植物汁液，主要危害 油蒿、奇楠沉香等藥用植物[2-3] ，主要分布于我國廣 東、海南、云南等地[4] 。

蝽 科 昆 蟲 線 粒 體 基 因 DNA（Mitochondria DNA，mtDNA）是 雙 鏈 閉 合 的 環(huán) 狀 分 子 ，長 度 在 13～16 kb，mtDNA 包 含 13 個 蛋 白 質(zhì) 編 碼 基 因 （Protein-coding genes，PCGs），22 個 轉(zhuǎn) 運 RNA 基 因（Transfer RNAs，tRNAs）2 個核糖體 RNA 基因 （Ribosome RNAs，rRNAs），以及一個控制區(qū)（Control region），mtDNA 被廣泛用于物種的鑒定、種群遺傳 進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的研究中[5-6] 。截至 2022 年 8 月 ，NCBI 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）公布的半翅目蝽科昆蟲線粒體完整基因組序 列有 49 個，而關(guān)于片蝽屬的昆蟲線粒體完整基因 組未見報道。

本研究測定小片蝽線粒體基因組，首次詳細(xì)分 析該物種線粒體基因組結(jié)構(gòu)，繪制了 RNA 二級結(jié) 構(gòu) 圖 ，并 結(jié) 合 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 已 報 道 的 49 個 蝽 科 PCGs 串聯(lián)序列，構(gòu)建蝽科系統(tǒng)發(fā)育樹，從線粒體基 因組水平探討片蝽屬在蝽科中的分類地位，旨在探 討蝽科 4 亞科以及部分族間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集及 DNA 提取、測序

本試驗的昆蟲標(biāo)本小片蝽于 2021 年 7 月 28 日 采集自中國海南省海口市白沙門公園（20°07'13\"N， 110°33'53\"E），標(biāo)本采集后放入裝在無水乙醇溶液 的凍存管中，帶回實驗室后置于-20 ℃冰箱中保存， 證據(jù)標(biāo)本（SXAU2-98）目前保存在山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院昆蟲分類研究所中。

總 DNA 提取自小片蝽標(biāo)本的胸部肌肉，嚴(yán)格 按照試劑盒（TaKaRa Clontech DNA）使用手冊進(jìn) 行 DNA 提取，檢驗合格后，送至公司進(jìn)行高通量測 序（百 邁 克 生 物 技 術(shù)），使 用 全 基 因 組 鳥 槍 法 （Whole Genome Shotgun，WGS）策略，構(gòu)建不同插 入片段的文庫，利用第 2代測序技術(shù)（NextGeneration Sequencing，NGS），基于 Illumina NovaSeq 6000 測 序 平 臺 ，對 其 進(jìn) 行 雙 末 端（Paired-end，PE150）測 序，測序大小為 27 361 506 bp。

1.2 序列組裝、注釋與分析

使用 fastp（version 0.20.0，https：//github.com/ OpenGene/fastp）軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾 標(biāo)準(zhǔn)為：截除 Reads 中的測序接頭以及引物序列； 過濾掉平均質(zhì)量值小于 Q5 的 reads；過濾掉 N 含量 大于 5 的 Reads。經(jīng)過上述一系列的質(zhì)量控制之后 得 到 的 高 質(zhì) 量 Reads，稱 之 為 Clean Data，得 到 Clean Reads 數(shù)為 27 073 068。

利用 Geneious v. 11.0.5[7] 軟件進(jìn)行序列的組裝、 注釋。注釋完畢后，打開 MITOS Web 網(wǎng)頁（http：// mitos.bioinf.uni-leipzig.de/），將參數(shù)設(shè)置遺傳密碼 （Genetic code）選擇無脊椎動物（05-Invertebrate）， 然后上傳序列，該網(wǎng)頁可以預(yù)測 22 個 tRNAs 的位 置和二級結(jié)構(gòu)。rRNAs 基因邊界通過人工查驗與 已知蝽科的 RNA 基因比較來確定，控制區(qū)的位置 由相鄰基因的邊界來確定。使用 MEGA v.11.0 分 析其堿基組成和密碼子使用情況（RSCU）。AT 偏 斜（AT-skew）和 GC 偏斜（GC-skew）的計算方法 如下。

AT-skew=（A?T）/（A+T） （1）

GC-skew=（G?C）/（G+C） （2）

使用 DnaSP v.6.12.03[8] 計算蝽科每個 PCG 的 每個非同義位點的非同義替換數(shù)（Ka）和每個同義 位點的非同義替換數(shù)（Ks），不包括終止密碼子。將 組裝注釋完整的小片蝽的線粒體全基因組序列，上 傳至 NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫，登錄號為 OP531920。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

本研究從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載 50 種蝽科（含本 研究測定的小片蝽）的昆蟲線粒體全基因組序列 （表 1），以盾蝽科的角盾蝽 Cantao ocellatus 和紫藍(lán) 麗盾蝽 Chrysocoris stollii 等 2 個物種作為外群。基 于貝葉斯法（Bayesian，BI）和最大似然法（MaximumLikelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9] 。其中，最大似 然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹在 PhyloSuite_1.2.2 軟件中 運行，由系統(tǒng)自動篩選最佳分區(qū)，分支置信度采用超快自展法（Ultrafast bootstraping）重復(fù) 100 000 次 計算所得。貝葉斯樹根據(jù)文獻(xiàn)[10]中運行計算得 知，當(dāng)分割頻率的標(biāo)準(zhǔn)差低于 0.01 時，該程序?qū)⑼?止運行。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組結(jié)構(gòu)特征

小片蝽的線粒體全基因組序列長度為 15 445 bp （圖 1），共 有 37 個 基 因 ，包 括 2 個 rRNAs、22 個 tRNAs和 13個 PCGs，以及 1個控制區(qū)。分析線粒體 基因組結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，小片蝽基因重疊共有 7 處，重疊 長度范圍在 1～8 bp，基因重疊最長的區(qū)域發(fā)生在 trnW和trnC基因之間，重疊數(shù)為8 bp（AAGCTTTA）； atp8 和 atp6 基因重疊為 7 bp（ATGATAA），nad4l 和 nad4 基因的重疊為 7 bp（TTATCAT）。最長基 因間隔發(fā)生在 nad1 和 trnS2 基因之間，間隔的長度 長達(dá) 24 bp。rrnS和 trnI之間的區(qū)域長度為 767 bp。

2.2 蛋白編碼基因（PCGs）

小 片 蝽 13 個 蛋 白 編 碼 基 因 包 括 atp8、atp6、 cox1、cox2、cox3、cytb、nad1、nad2、nad3、nad4、 nad4l、nad5、nad6。 有 4 個 蛋 白 編 碼 基 因（nad1、 nad4、nad4l、nad5）位于 N 鏈（Minor coding strand）， 其余 9 個位于 J 鏈（Major coding strand）。nad5 基因長度為 1 705 bp，是最長的蛋白編碼基因，最短的 是 atp8 基因，長度僅為 162 bp。ATN 是 atp8、atp6、 cox2、cox3、cytb、nad2、nad3、nad4、nad4l、nad5 的 起始密碼子，cox1、nad1 和 nad6 的起始密碼子是 TTG；終止密碼子均是 TAG 和 TAA，這種完整的 三聯(lián)體密碼子終止大部分的蛋白基因編碼，也有以 T 或 TA 終止蛋白基因編碼（表 2）。大多數(shù)蛋白編 碼基因中的 AT 含量都高于 70%，atp8 基因的 AT 堿基含量最高，達(dá) 79.63%，AT 堿基含量最低的是 cox1基因，含量為 68.64%。除了 nad1、nad4、nad4l、 nad5 基因的 AT-skew 值為負(fù)值外，其余 9 個基因 的 AT-skew 值為正值（表 3）

根據(jù)小片蝽相對密碼子使用頻率（RSCU）發(fā) 現(xiàn)，使用頻率最高的密碼子是 NNA（AUA、UUA、 CGA 等）和 NNU（AAU、AUU、UUU）；使用頻率 最 低 的 是 密 碼 子 是 NNG；而 AUC、GUG、CGC、 AGG 這 4 個密碼子的使用頻率為 0（圖 2）。

本研究通過計算同義替代率（Ks）、非同義替代 率（Ka）和每個 PCG 的 Ka/Ks 值，探索蝽科的進(jìn)化 模式，結(jié)果顯示，蝽科物種 13 個 PCGs 的 Ka/Ks 值 均低于 1（圖 3），說明 PCGs 均處于純化選擇階段 ， 因此，本研究選取物種的 PCGs 都可以用來分析蝽 科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。atp8 的 Ka/Ks 值最高（0.557）， 而 cox1 的 Ka/Ks 值最低（0.082）。

2.3 tRNAs 基因

在小片蝽線粒體基因組 tRNA 總長度 1 478 bp， 14 個 tRNA 基 因（trnI、trnM、trnW、trnL2、trnK、 trnD、trnG、trnA、trnR、trnN、trnS1、trnE、trnT、 trnS2）位于 J 鏈，8 個 tRNA 基因（trnQ、trnC、trnY、 trnF、trnH、trnP、trnL1、trnV）位于 N 鏈，每個 tRNA 基因的長度在 63～73 bp。22 個 tRNA 基因的堿基 含 量 為 A（38.23%）、T（37.01%）、G（13.94%）、C （10.83%）。在小片蝽 22 個轉(zhuǎn)運 RNA 基因的二級 結(jié)構(gòu)中，基因 trnS1（GCT）和 trnV（TAC）因缺失了 DHU 臂而不能形成典型的二級結(jié)構(gòu)。22 個 tRNAs 二級結(jié)構(gòu)中，除了典型的堿基配對（A-U 和 G-C） 外，還出現(xiàn) 21 對錯配，例如 G-U（圖 4）。

2.4 rRNAs 基因與控制區(qū)

小片蝽線粒體基因中，rrnL 基因和 rrnS 基因 位于 J 鏈，堿基含量為 A（31.97%）、T（45.00%）、G （15.02%）、C（8.02%）。rrnL 基因長度為 1 274 bp， 位 于 trnV 與 trnL1 之 間 ，預(yù) 測 的 二 級 結(jié) 構(gòu) 包 括 有 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ等 5 個結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域 III 缺 失，同時形成了 44 個莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖 5）。rrnS 基因長 度為 797 bp，位于控制區(qū)和 trnV 之間，其 5'末端與 控 制 區(qū) 相 鄰 ，該 二 級 結(jié) 構(gòu) 包 括 3 個 結(jié) 構(gòu) 域 ，由 約 26 個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成（圖 6）。控制區(qū)長度為 767 bp，介于 rrnS 與 trnI基因之間。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以盾蝽科 2 個物種作為外群、蝽科 4 亞科 50 個 物種作為內(nèi)群，基于 13 個 PCGs 構(gòu)建的 2 個系統(tǒng)發(fā) 育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基本一致。結(jié)果顯示，小片蝽 與斑須蝽 Dolycoris baccarum 的親緣關(guān)系更近；支 持二星蝽族 Eysarcorini 和 Strachiini 的單系性，棕蝽 族 Caystrini和腹溝族 Halyini互為姐妹群；益蝽亞科 類群很好地聚為一支，并和蝽亞科部分類群聚類到 一起，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為：（（蠋蝽屬 Arma+藍(lán)蝽屬 Zi? crona）+（（疣 蝽 屬 Cazira+ 喙 蝽 屬 Dinorhyn? chus）+（（曙厲蝽屬 Eocanthecona+益蝽屬 Picro? merus））），短喙蝽亞科的 2 個屬聚在一起，也和蝽亞 科部分物種聚為一支，而舌蝽亞科中的 3 個物種并 沒有聚為一支，不支持其單系性（圖 7、8）。

3 結(jié)論與討論

小片蝽線粒體基因組總長度為 15 445 bp，包括 了 13 個蛋白編碼基因（PCGs），22 個轉(zhuǎn)運 tRNA， 2 個核糖體 rRNA 基因和 1 個控制區(qū)，小片蝽線粒 體 基 因 組 序 列 結(jié) 構(gòu) 和 順 序 與 其 他 蝽 科 物 種 的 相 同[11-13] 。 堿 基 組 成 分 析 結(jié) 果 顯 示 ，小 片 蝽 線 粒 體 基 因 組 全 序 列 堿 基 含 量 組 成 為 A（42.86%）、T （31.40%）、C（14.92%）、G（10.82%），AT 含 量 為 74.26%，AT 偏斜值（AT-skew）為 0.154，GC 偏斜 值（GC-skew）為-0.159。

根據(jù)相對密碼子使用頻率（RSCU）分析發(fā)現(xiàn)， 小片蝽密碼子的使用頻率具有不均質(zhì)性，NNU、 NNA 的相對同義密碼子使用頻率比較高，堿基 A 和 U 的出現(xiàn)頻率高于 G 和 C，說明了第 3 位密碼子 富含堿基 AT，這可能是 PCGs 序列中 AT 偏斜大于 GC 偏斜的原因。其中位于 N 鏈蛋白質(zhì)編碼基因的 T 含量都達(dá)到了 50% 以上，而位于 J 鏈的 T 含量在 30%～39%，因此位于編碼 N 鏈蛋白質(zhì)編碼基因中 T 偏斜值較大，具有明顯的 AT 偏好性。起始密碼 子既有典型的 ATN，也有非典型的 TTG；大部分 蛋白編碼基因終止密碼子為 TAA 或者 TAG，少部 分基因終止密碼子為 TA 或 T，這種情況在半翅目 昆蟲線粒體組中較為常見[14-15] 。

通過計算線粒體基因的替代率，蝽科物種 13 個 PCGs 的 Ka/Ks 值均低于 1，說明該基因均處于純 化選擇階段，atp8 的 Ka/Ks 值最高，進(jìn)化速率快。 這類進(jìn)化速率較快的基因（例如 atp8、nad4l、nad6） 的 AT 含量都比較高；cox1 的 Ka/Ks 的比值最低， 進(jìn)化速率緩慢。這類進(jìn)化速率較慢的基因（例如 cox1、cox2、cox3、cytb）的 AT 含量普遍偏低，綜上 可知，堿基的 AT 含量偏斜與進(jìn)化速率相關(guān)，cox1 基因結(jié)構(gòu)相對保守。因此，廣泛利用 cox1 基因進(jìn) 行近緣種間的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究[16-20] 。

對小片蝽 22 個 tRNA 的二級結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)， trnS1 和 trnV 缺失了 DHU 臂不能正常折疊形成典 型的三葉草型二級結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，半翅目昆蟲的 trnS1 基因均缺少 DHU 臂，還有一些物種的 tRNA 也缺失 DHU 臂，例如菜蝽屬物種 trnS1 和 trnV 均 缺失 DHU 臂，tRNAs 基因存在一些堿基錯配的現(xiàn) 象，錯配最多是堿基 G 與堿 U，這些情況在蝽科物 種很常見[6，13，19-21，22-23] 。基于 13 個 PCG 構(gòu)建的蝽科 ML 和 BI 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，小片蝽處于蝽亞科 分支，小片蝽與斑須蝽 D.baccarum 的親緣關(guān)系最 近，但該分類單元的單系性仍需通過更廣泛的類群 取樣來檢驗；腹溝族 Halyini與棕蝽族 Caystrini族間 存在關(guān)系，具有較高的支持率，且這 2 個族的物種 形態(tài)特征有相似之處：臭腺溝緣長、揮發(fā)域面積大 且界限明顯等；綠蝽族 Nezarini 和等片族 Antestiini 聚為一簇。形態(tài)分類上，Rider 將綠蝽族 Nezarini 的 珀蝽屬 Plautia 暫時放置于等片族 Antestiini 內(nèi)，本 研 究 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 支 持 這 一 結(jié) 論 。 結(jié) 果 還 顯 示 ， Strachiini 形 成 一 個 單 系 群 ，秦 嶺 菜 蝽 Eurydema qinlingensis 是 Strachiini 分 化 較 早 的 一 支 ；二 星 蝽 族 Eysarcorini 2 個 屬 二 星 蝽 屬 Eysarcoris、輝 蝽 屬 Carbula 形成穩(wěn)定的分支，結(jié)果高度支持該族的單 系性，與學(xué)者研究結(jié)果一致[24] ；益蝽亞科是一個單 系，但與蝽亞科曼蝽屬 Menida 形成姐妹群關(guān)系，舌 蝽亞科 3 個族物種與蝽亞科聚在一起，說明舌蝽亞 科不是一個單系群，而是與蝽亞科形成并系群，短 喙蝽亞科物種聚為一支并與蝽亞科蝽族形成姐妹 群。有研究認(rèn)為，應(yīng)該重新審視益蝽亞科、短喙蝽 亞科、舌蝽亞科在蝽科的亞科地位，建議將它們作 為蝽亞科的族級階元看待[25] 。

本研究通過對小片蝽線粒體全基因組的報道， 豐富了蝽科線粒體基因組數(shù)據(jù)庫，同時為蝽科系統(tǒng) 發(fā)育關(guān)系的進(jìn)一步探討提供了一定的理論基礎(chǔ)。 對蝽科的深入研究還需后期補充大量蝽科物種基 因組，同時，需結(jié)合形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性等進(jìn)一步闡 明蝽科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從而構(gòu)建更合理的蝽科各階 元間的進(jìn)化關(guān)系。

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