梨小食心蟲(chóng)卵黃原蛋白基因的鑒定及表達(dá)分析

摘 要：為明確重要果樹(shù)害蟲(chóng)梨小食心蟲(chóng)（Grapholita molesta）卵黃原蛋白（Vitellogenin，Vg）基因功能及其生殖 調(diào)控機(jī)制，為 GmVg 基因功能的深入研究奠定理論基礎(chǔ)，克隆鑒定了梨小食心蟲(chóng)卵黃原蛋白基因（GmVg）并進(jìn) 行生物信息學(xué)分析，通過(guò) qRT-PCR 分析 GmVg 在梨小食心蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期、不同性別和不同組織的表達(dá)模式。 結(jié)果表明，GmVg 基因全長(zhǎng) 5 573 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）5 364 bp，編碼 1 787 個(gè)氨基酸，信號(hào)肽長(zhǎng)度為 15 個(gè)氨基 酸，分子式為 C9041H14090N2544O2743S57；氨基酸組成中丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Gln）和絲氨酸（Ser）占比最大，分別為 8.2%、7.9% 和 7.8%，酸性殘基的數(shù)量（Asp+Glu）為 187 個(gè)，堿性殘基的數(shù)量（Arg+Lys）為 204 個(gè)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì) 分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為 204.1 ku 和 8.79，具有 Vitellogenin-N、DUF1943 和 VWD 共 3 個(gè)典型保守結(jié)構(gòu)域 。 GmVg 成蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高于卵、幼蟲(chóng)和蛹期，且羽化后 24 h 時(shí)達(dá)到峰值。GmVg 的表達(dá)具有性別特異性，在 雄蟲(chóng)中表達(dá)量極低。GmVg 在雌成蟲(chóng)頭部、卵巢和脂肪體中的表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性，其中脂肪體顯著高表達(dá)，分 別是頭部和卵巢表達(dá)量的 21.49 倍和 16.4 倍。

關(guān) 鍵 詞 ：梨小食心蟲(chóng)；卵黃原蛋白；基因克隆；發(fā)育時(shí)期表達(dá)；組織表達(dá)

中 圖 分 類(lèi) 號(hào) ：S436.612.2 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 ：A 文 章 編 號(hào) ：1002?2481（2024）02?0058?07

梨 小 食 心 蟲(chóng)（Grapholita molesta）屬 鱗 翅 目 （Lepidoptera）卷蛾科（Tortricidae），是一種全球性 的重要果樹(shù)害蟲(chóng)[1] ，可嚴(yán)重危害桃、梨、蘋(píng)果等多種 經(jīng)濟(jì)果樹(shù)[2] 。強(qiáng)大的生殖潛力是該蟲(chóng)暴發(fā)和擴(kuò)張的 重要原因，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)梨小食心蟲(chóng)生殖生理的研 究主要集中在生殖系統(tǒng)解剖和卵巢發(fā)育分級(jí)上[3] ，生殖相關(guān)基因的研究較少。卵黃原蛋白（Vitellogenin， Vg）是昆蟲(chóng)一類(lèi)重要的生殖蛋白，大部分昆蟲(chóng)的 Vg 在脂肪體產(chǎn)生，進(jìn)入血淋巴后被卵母細(xì)胞表面 的卵黃原蛋白受體（Vitellogenin receptor，VgR）捕 獲，通過(guò)胞吞作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的加 工和修飾，最后以晶體的形式在卵內(nèi)沉積為卵黃 蛋白，為胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，這一過(guò)程被稱(chēng)為卵 黃發(fā)生[4] 。

自 1954 年 Telfer 在惜古比天蠶蛾（Halophora cecropia）中發(fā)現(xiàn)第 1 個(gè) Vg 蛋白以來(lái)[5] ，人們對(duì) Vg 的 研究逐漸增多，內(nèi)容涵蓋分子特性、生理功能與調(diào) 控通路等。Vg基因的序列全長(zhǎng)一般為 6～7 kb，編碼 蛋白分子質(zhì)量約為 200 ku，屬于載脂蛋白超家族[6] ， 最顯著的特征是在 N 末端存在聚絲氨酸區(qū)，此區(qū)域 附近通常含有切割位點(diǎn) R/KXXK/R，是一些內(nèi)源 蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)[7] ，此外還有 CL/ICG 基序、數(shù)量 不等的半胱氨酸殘基等保守結(jié)構(gòu)域。Vg基因具有性 別、發(fā)育時(shí)期和組織表達(dá)特異性，大部分昆蟲(chóng)的 Vg 在雌蟲(chóng)脂肪體特異表達(dá)，少部分在昆蟲(chóng)其余部位也 有表達(dá)，比如意大利蜜蜂（Apis mellifera）的卵巢及 雄峰和工蜂的脂肪體[8-9] 、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的表皮[10] 。Vg 的表達(dá)合成與卵黃發(fā)生 緊密相關(guān)，所以一般昆蟲(chóng)的 Vg 在卵巢發(fā)育的透明 期和卵黃沉積期開(kāi)始表達(dá)，成熟期達(dá)到高峰，到產(chǎn) 卵末期開(kāi)始下降，區(qū)別在于達(dá)到峰值的時(shí)間不同。 目前，Vg 被證明除了為昆蟲(chóng)卵巢和胚胎的發(fā)育提 供營(yíng)養(yǎng)外，在一些社會(huì)性昆蟲(chóng)中還有信息傳遞[11] 、 調(diào)節(jié)行為[12] 和介導(dǎo)免疫[13-14] 等功能。

Vg 的合成與沉積是昆蟲(chóng)生殖活動(dòng)中的關(guān)鍵環(huán) 節(jié)，直接影響到昆蟲(chóng)的卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生[15-16] ，目 前，Vg 基因已成為害蟲(chóng)控制的重要潛在靶標(biāo)，但梨 小食心蟲(chóng)未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究克隆鑒定了 梨小食心蟲(chóng) Vg 全長(zhǎng)序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 利用 qRT-PCR 分析 Vg 基因在梨小食心蟲(chóng)不同發(fā) 育階段、性別和組織中的表達(dá)模式，旨在為該基因 功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)嫘∈承南x(chóng)來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù) 學(xué)院生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件為溫度 26 ℃ 、光 周 期 L∶D=16 h∶8 h、相 對(duì) 濕 度 60%～ 80%。幼蟲(chóng)以人工飼料喂養(yǎng)，成蟲(chóng)用 10% 的蜂蜜 水浸潤(rùn)棉花球飼喂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成 在液氮中，用電 動(dòng)研磨棒快速研磨梨小食心蟲(chóng)各個(gè)時(shí)期的樣品至 粉 末 ，采 用 Trizol（TaKaRa，Dalian，China）按 步 驟 提取總 RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和超微量蛋白 核 酸 分 析 儀（BioDrop，Cambridge，UK）檢 測(cè) 總 RNA 的 質(zhì) 量 和 濃 度 。 使 用 HiScript? Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Vazyme，Nanjing，China）按說(shuō)明書(shū)步驟反轉(zhuǎn)錄 獲得 cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 梨小食心蟲(chóng) Vg 的克隆 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已獲得 梨小轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以 NCBI 其他已報(bào)道昆蟲(chóng) Vg 蛋 白序列建立本地 BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)篩出預(yù)測(cè)序 列，利用 Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，分 3段 進(jìn)行擴(kuò)增（圖 1）。

利用 Beacon Designer 7 軟件設(shè)計(jì)特異性定量 引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合 成（表 1）。PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 5 min； 95 ℃變性 15 s，50 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 5 min。用 1% 瓊脂糖凝膠電 泳分離，經(jīng)膠回收和連接轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，送 于上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序正確后拼 接序列。

1.2.3 梨 小 食 心 蟲(chóng) Vg 生 物 信 息 學(xué) 分 析" 利 用 NCBI 的 BLAST 功能將其與數(shù)據(jù)庫(kù)其他物種 Vg 序列進(jìn)行同源性序列比對(duì)。通過(guò)在線(xiàn)工具ProtParam （http：//web. expasy. org/protparam/）預(yù) 測(cè) 其 理 論 分 子 量 、等 電 點(diǎn) 、氨 基 酸 組 成 等 。 采 用 NCBI 的 CDD（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）在線(xiàn)程序進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。采 用 SignalP 4.1 Server（http：//www. cbs. dtu. dk/ser? vices/SignalP/）對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。使 用 MEGA 7.0 軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）對(duì) 4 個(gè)目（鱗翅目、鞘翅目、半翅目和雙翅目）16 個(gè)物 種的Vg蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)1 000次[17] 。

1.2.4" 梨 小 食 心 蟲(chóng) Vg 的 時(shí) 空 表 達(dá) 分 析" 利 用 qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)梨小食心蟲(chóng) GmVg 在不同時(shí)期 （卵、幼 蟲(chóng)、蛹 和 成 蟲(chóng)）以 及 成 蟲(chóng) 不 同 性 別 和 組 織 （頭、脂肪體和卵巢）的表達(dá)情況。具體取樣時(shí)期如 下：卵，1～3 d 混樣；幼蟲(chóng)和蛹均為整個(gè)齡期的混 樣；成蟲(chóng)，羽化后 24、48、72、120 h 的雌蟲(chóng)。組織中 的頭部、脂肪體和卵巢均來(lái)自羽化一天內(nèi)未交配的 雌蟲(chóng)；雄蟲(chóng)樣品為同一批羽化的整頭雄成蟲(chóng)。所有 樣品均設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

以 β-tubulin 為內(nèi)參，使用 ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光 定量 PCR 儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA， USA）完成qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2?ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上 下 游 引物各 0.8 μL，10×cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。 反 應(yīng) 程 序 為 ：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40次循環(huán)；熔解曲線(xiàn)程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。設(shè)置 3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采 用 2-ΔΔCt 法 計(jì) 算 基 因 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量 ，使 用 SPSS.26.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析， 應(yīng) 用 Tukey's HSD 法 進(jìn) 行 差 異 顯 著 性 檢 驗(yàn)（Plt; 0.05），通過(guò) GraphPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmVg 基因克隆

以梨小食心蟲(chóng)雌成蟲(chóng)腹部 cDNA 模板，分 3 個(gè) 部分進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，3 個(gè) 部分均得到預(yù)期大小條帶（圖2），分別為2 291、1 904、 2 020 bp。測(cè)序正確后進(jìn)行拼接，命名為 GmVg。

2.2 GmVg 序列分析

克 隆 獲 得 GmVg 序 列 全 長(zhǎng) 為 5 573 bp（Gen Bank 登錄號(hào)為 OQ545589），開(kāi)放閱讀框（ORF）為 5 364 bp，編碼 1 787個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 為204.1 ku，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為8.79，信號(hào)肽長(zhǎng)度為15個(gè)氨 基酸，具體序列為 MKLLVLATFVALVAS，分子式 為 C9041H14090N2544O2743S57，氨基酸組成中丙氨酸（Ala）、 谷 氨 酸（Gln）和 絲 氨 酸（Ser）占 比 最 大 ，分 別 為 8.2%、7.9% 和 7.8%。酸性殘基的數(shù)量（Asp+Glu） 為 187個(gè)，堿性殘基的數(shù)量（Arg+Lys）為 204個(gè)。

將 GmVg 與其他鱗翅目昆蟲(chóng)，包括大豆食心蟲(chóng)（Leguminivora glycinivorella）、云 杉 卷 葉 蛾（Cho? ristoneura fumiferana）、旖鳳蝶（Iphiclides podalirius）、 月 形 天 蠶 蛾（Actias selene）、阿 波 羅 蝶 （Parnassius apollo）、玉帶鳳蝶（Papilio polytes）、柑橘鳳蝶（Pa? pilio xuthus）和 冬 尺 蠖 蛾 （Operophtera brumata）的 Vg 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，梨小食心蟲(chóng)與 大豆食心蟲(chóng)的 Vg蛋白序列相似度最高，為 84.76%， 與其余昆蟲(chóng) Vg 蛋白序列相似度均在 55%～58% （圖 3）。此外，DGXR、半胱氨酸殘基和聚絲氨酸基 序在這些鱗翅目昆蟲(chóng)中高度保守。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

GmVg 與其他物種 Vg 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育 和保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖 4 所示。

通過(guò) NCBI 的 CDD 在線(xiàn)工具分析發(fā)現(xiàn)，梨小食 心蟲(chóng) Vg 蛋白序列中存在 3 個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域，N 末端存在 Vitellogenin-N（30—746 位氨基酸）結(jié)構(gòu) 域，DUF1943 結(jié)構(gòu)域（787—1 050 位氨基酸），C 末 端存在 VWD（Von Willebrand factor type D domain） 結(jié)構(gòu)域（1 455—1 625 位氨基酸）（圖 4）。16 種昆蟲(chóng) 的 Vg 保守基序分析發(fā)現(xiàn)，Motif 1～Motif 5 最保守， Motif 6 在鱗翅目昆蟲(chóng)中高度保守，Motif 10 在不同 物種中數(shù)目差異較大（圖 4）。

利用軟件 MEGA 7.0，采用 NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā) 育樹(shù)，結(jié)果表明（圖 4），梨小食心蟲(chóng) Vg 與其他鱗翅 目昆蟲(chóng)聚為一支，其中與小卷蛾亞科（Olethreutinae） 的大豆食心蟲(chóng) Vg 親緣關(guān)系最近，與多序列比對(duì)結(jié) 果相同。所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)結(jié)果 一致，這在一定程度上反映了梨小食心蟲(chóng) Vg 在物 種中的進(jìn)化位置和親緣關(guān)系。

2.4 GmVg在梨小食心蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

GmVg 在成蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高于卵期、幼蟲(chóng) 期和蛹期的表達(dá)量，且卵期和幼蟲(chóng)期的表達(dá)水平極 低。從蛹期開(kāi)始，GmVg 表達(dá)量開(kāi)始升高，羽化后 24 h GmVg 的表達(dá)量達(dá)到峰值，之后 4 d 內(nèi) GmVg 表達(dá)量與羽化后 24 h GmVg 的表達(dá)量相比顯著降 低，但依舊維持在較高的水平（圖 5）。

2.5 GmVg 在梨小食心蟲(chóng)不同組織和性別中的表 達(dá)模式

GmVg 在梨小食心蟲(chóng)雌蟲(chóng)的頭部、卵巢和脂肪 體中表達(dá)具有組織特異性，GmVg 在雌蟲(chóng)脂肪體顯 著高表達(dá)，其表達(dá)量分別是頭部和卵巢表達(dá)量的 21.49 倍和 16.4 倍（圖 6）。同時(shí) GmVg 的表達(dá)具有 性別特異性，在雄成蟲(chóng)中表達(dá)量極低（圖 6）。

3 結(jié)論與討論

卵黃原蛋白為大部分卵生生物胚胎的發(fā)育提 供營(yíng)養(yǎng)，其正確合成與沉積是種群繁衍的基礎(chǔ)[18] 。 本 研究克隆鑒定了梨小食心蟲(chóng) GmVg 全長(zhǎng)序列，序 列分析發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽長(zhǎng)度為 15，與草地貪夜蛾（Spodop? tera frugiperda）[10] 一 致 ，斜 紋 夜 蛾（Spodoptera li? tura）Vg信號(hào)肽長(zhǎng)度為 17[19] ，煙粉虱（Bemisia tabaci） 為 28[20] 。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)所有昆蟲(chóng) Vg 均含有 Vitellogenin-N、DUF1943 和 VWD 共 3個(gè)保 守結(jié)構(gòu)域。不同目的昆蟲(chóng) Vg保守基序數(shù)目不同，其 中，Motif 6（YGHCHHRVDYHFGVPEGAEWTG TAHKPEEDQFIKRATVSRILAGKQGPIY）在 鱗 翅 目 中 高 度 保 守 ，在 其 他 目 昆 蟲(chóng) 中 未 見(jiàn) 該 基 序 。

Motif 10（SSSSSSSSSSSSSES）為連續(xù)的絲氨酸， CHEN 等[21] 研究表明，此區(qū)域進(jìn)化速率較快。本研 究發(fā)現(xiàn)，梨小食心蟲(chóng)和大豆食心蟲(chóng) Vg 中只含有 1 個(gè) Motif 10，其他鱗翅目昆蟲(chóng)均存在 2 個(gè)，半翅目與雙翅目昆蟲(chóng) Vg 序列 C 端也發(fā)現(xiàn)此基序，但是數(shù)量不 一，而鞘翅目中不存在 Motif 10。DGXR 和半胱氨 酸殘基對(duì) Vg 蛋白寡聚化反應(yīng)是必需的[22] ，在鱗翅 目昆蟲(chóng)中高度保守，與本研究結(jié)果一致。此外發(fā) 現(xiàn)，GICG 基序在梨小食心蟲(chóng)中突變?yōu)?GVCG，與小 菜蛾突變情況一致[23] ，其原因和影響有待進(jìn)一步 探討。 GmVg 在梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)期的表達(dá)量顯著高 于其他發(fā)育時(shí)期，亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[24] 、 草 地 貪 夜 蛾[10] 和 大 眼 長(zhǎng) 蝽（Geocoris pallidipen? nis）[25] 等昆蟲(chóng) Vg 基因的表達(dá)量也均在成蟲(chóng)期最高， 區(qū)別在于表達(dá)高峰期不同，梨小食心蟲(chóng) Vg 表達(dá)高 峰為羽化后第 1 天；與亞洲玉米螟相同，草地貪夜 蛾為羽化后第 4 天；大眼長(zhǎng)蝽在羽化后第 22 天達(dá)到 高峰，推測(cè)這可能與昆蟲(chóng)卵黃發(fā)生的時(shí)期不同有 關(guān)。眾多研究表明，昆蟲(chóng)的 Vg 在雌蟲(chóng)脂肪體特異 性高表達(dá)[23-26] ，本研究結(jié)果為與上述結(jié)論一致。本 研究發(fā)現(xiàn)，GmVg 除在雌蟲(chóng)中表達(dá)外，其在整頭雄 蟲(chóng)中也可被檢測(cè)到，但相關(guān)研究報(bào)道較少，GmVg 在雄蟲(chóng)中的功能還有待進(jìn)一步研究。卵黃發(fā)生是 昆蟲(chóng)生殖活動(dòng)中最重要的一環(huán)，而 Vg 是其中的關(guān) 鍵因子，可作為害蟲(chóng)生殖調(diào)控的靶標(biāo)基因。向杏仁 蛾（Cadra cautella）注射 Vg-dsRNA 后，Vg 表達(dá)量 下調(diào)，產(chǎn)卵量顯著降低，且由于卵黃沉積受到影響， 大量的卵不能正常孵化[26] 。小菜蛾注射 Vg-dsRNA 后，羽化 5 d 內(nèi)的總產(chǎn)卵量也顯著下降[23] 。此外，它 還 是 一 個(gè) 多 效 性 蛋 白 ，將 工 蜂（Apis mellifera）的 Vg 干擾后，改變了其生命周期，使其提前進(jìn)行覓食 活動(dòng)，并伴隨其他一些行為和生理變化[27] 。在梨小 食心蟲(chóng)中 Vg 是否具有這些功能，還需進(jìn)一步利用 如 RNAi等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究克隆鑒定了梨小食心蟲(chóng) GmVg 基因，明 確了 GmVg 在梨小食心蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期、性別和不 同組織的表達(dá)模式，為梨小食心蟲(chóng) GmVg 功能的深 入研究及作為害蟲(chóng)防治潛在靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)奠定了一 定理論基礎(chǔ)。

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