達格列凈對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用機制研究

[摘要]"目的"探討達格列凈對糖尿病腎病（diabetic"nephropathy，DN）大鼠的腎臟保護作用及對AMP活化蛋白激酶（AMP-activated"protein"kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號通路表達的影響。方法"SPF級Wistar雄性大鼠40只，隨機分為正常組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組各10只。成功制備DN模型后，正常組大鼠給予普通飼料+生理鹽水灌胃；模型組大鼠給予高糖高脂飼料+生理鹽水灌胃；低劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達格列凈1mg/（kg·d）灌胃；高劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達格列凈10mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠連續干預12周。比較各組大鼠的腎功能指標、腎臟病理組織變化、p-AMPK和p-mTOR蛋白表達、Ⅰ型膠原（collagen"type"Ⅰ，COL"Ⅰ）、Ⅳ型膠原（collagen"type"Ⅳ，COL"Ⅳ）、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）水平。結果"模型組、低劑量組和高劑量組大鼠的血尿素氮（blood"urea"nitrogen，BUN）、血肌酐（serum"creatinine，SCr）、24h尿蛋白定量、p-mTOR蛋白表達、COL"Ⅰ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著高于正常組，p-AMPK蛋白表達顯著低于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的BUN、SCr、24h尿蛋白定量、p-mTOR蛋白表達、COL"Ⅰ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著低于模型組，p-AMPK蛋白表達顯著高于模型組（Plt;0.05）；高劑量組大鼠的BUN、SCr、24h尿蛋白定量、p-mTOR蛋白表達、COL"Ⅰ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著低于低劑量組，p-AMPK蛋白表達顯著高于低劑量組（Plt;0.05）。結論"達格列凈對DN大鼠具有良好的腎臟保護作用，其機制可能與調節AMPK/mTOR信號通路表達有關。

[關鍵詞]"達格列凈；糖尿病腎病；腎臟保護；AMPK/mTOR信號通路

[中圖分類號]"R587.2""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.10.015

Study"on"the"protective"mechanism"of"dapagliflozin"on"kidney"in"diabetic"nephropathy"rats

YE"Yuyan1，"WANG"Peng2，"FANG"Xia1，"YANG"Jing1

1.Department"of"Nephrology，"Jinhua"People’s"Hospital，"Jinhua"321000，"Zhejiang，"China;"2.Department"of"Pharmacy，"Jinhua"People’s"Hospital，"Jinhua"321000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"protective"effect"of"dapagliflozin"on"kidney"and"the"expression"of"AMP-activated"protein"kinase"（AMPK）/"mammalian"target"of"rapamycin"（mTOR）"signaling"pathway"in"diabetic"nephropathy"（DN）"rats."Methods"A"total"of"40"SPF"Wistar"male"rats"were"randomly"divided"into"normal"group，"model"group，"low-dose"group"and"high-dose"group，"with"10"rats"in"each"group."After"the"DN"model"was"successfully"prepared，"the"rats"in"normal"group"were"given"normal"diet"+"normal"saline"by"gavage，"the"rats"in"model"group"was"given"high"sugar"and"high"fat"feed"+"normal"saline"by"gavage，"the"rats"in"low-dose"group"was"given"high"sugar"and"high"fat"feed+1mg/（kg·d）"of"dapagliflozin"by"gavage，"the"rats"in"high-dose"group"was"given"high"sugar"and"high"fat"feed+10mg/（kg·d）"of"dapagliflozin"by"gavage."Rats"in"each"group"were"continuously"gavaged"for"12"weeks."Renal"function"indexes，"renal"pathological"changes，"p-AMPK"and"p-mTOR"protein"expression，"collagen"type"Ⅰ"（COL"Ⅰ），"collagen"type"Ⅳ"（COL"Ⅳ）"and"fibronectin"（FN）"of"all"groups"were"compared."Results"Blood"urea"nitrogen"（BUN），"serum"creatinine"（SCr），"24h"urinary"protein"quantity，"p-mTOR"protein"expression，"COL"Ⅰ，"COL"Ⅳ"and"FN"levels"of"rats"in"model"group，"low-dose"group"and"high-dose"group"were"significantly"higher"than"those"in"normal"group，"and"p-AMPK"protein"expression"was"significantly"lower"than"that"of"normal"group"（Plt;0.05）."BUN，"SCr，"24h"urinary"protein"quantity，"p-mTOR"protein"expression，"COL"Ⅰ，"COL"Ⅳ"and"FN"levels"of"rats"in"low-dose"group"and"high-dose"group"were"significantly"lower"than"those"in"model"group，"while"p-AMPK"protein"expression"was"significantly"higher"than"that"in"model"group"（Plt;0.05）."BUN，"SCr，"24h"urinary"protein"quantity，"p-mTOR"protein"expression，"COL"Ⅰ，"COL"Ⅳ"and"FN"levels"in"high-dose"group"were"significantly"lower"than"those"in"low-dose"group，"and"p-AMPK"protein"expression"was"significantly"higher"than"that"in"low-dose"group"（Plt;0.05）."Conclusion"Dapagliflozin"has"a"good"kidney"protection"effect"on"DN"rats，"and"its"mechanism"may"be"related"to"the"regulation"of"AMPK/mTOR"signaling"pathway.

[Key"words]"Dapagliflozin;"Diabetic"nephropathy;"Kidney"protection;"AMPK/mTOR"signaling"pathway

糖尿病是常見的內分泌疾病，其患病率逐年增加，已成為引起全球慢性腎臟疾病的主要原因[1-2]。據統計，約40%的糖尿病患者會發生糖尿病腎病（diabetic"nephropathy，DN），且伴DN患者的死亡率較單純糖尿病患者高3倍以上，嚴重威脅人們的生命安全[3]。因此，尋找延緩DN的治療方法是當前研究的熱點[4]。達格列凈具有多種藥理作用，可發揮良好的腎臟保護作用[5]。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated"protein"kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號通路在調控細胞自噬和衰老中發揮重要作用，且與終末期腎病發病機制有一定的相關性[6]。基于此，本研究探討達格列凈對DN大鼠腎臟保護作用及對AMPK/mTOR信號通路表達的影響，以期為臨床治療DN及其機制研究提供參考。

1""材料與方法

1.1""實驗材料

1.1.1""實驗動物""SPF級Wistar雄性大鼠40只，體質量（190±10）g，購自浙江鷹旸醫藥研發有限公司，許可證號：SYXK（浙）2021-0033。適應性飼養5d，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照每12h明暗交替。

1.1.2""實驗藥物""達格列凈片（阿斯利康制藥有限公司）。

1.2""主要試劑

p-AMPK一抗（英國Abcam公司），p-mTOR（英國Abcam公司），大鼠Ⅰ型膠原（collagen"type"Ⅰ，COL"Ⅰ）試劑盒（上海佰利萊生物科技有限公司），大鼠Ⅳ型膠原（collagen"type"Ⅳ，COL"Ⅳ）試劑盒（上海佰利萊生物科技有限公司），大鼠纖維連接蛋白（fibronectin，FN）試劑盒（上海佰利萊生物科技有限公司）。

1.3""方法

1.3.1""實驗分組""40只大鼠隨機分為正常組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組各10只。

1.3.2""模型準備""正常組大鼠給予自由飲水和普通飼料，其余各組大鼠給予高糖高脂飼料。高糖高脂飼料配方：65%基礎飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1.5%混調劑+1%膽酸鈉。連續喂養4周后。2型糖尿病模型構建：過夜禁食12h后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素100mg/kg，當血糖（白天）空腹6h維持在11.2～16.7mmol/L時即模型構建成功。成功構建的2型糖尿病大鼠模型在鏈脲佐菌素處理后4周測定24h尿蛋白，若大鼠24h尿蛋白≥30mg，提示DN模型大鼠構建成功。

1.3.3""給藥方法nbsp;"正常組大鼠給予普通飼料+生理鹽水灌胃；模型組大鼠給予高糖高脂飼料+生理鹽水灌胃；低劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達格列凈1mg/（kg·d）灌胃；高劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達格列凈10mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠均灌胃12周。

1.4""觀察指標

1.4.1""樣本收集處理""①尿液和血清標本收集：干預12周后留取大鼠24h尿液檢測24h尿蛋白定量，腹主動脈取血，測定大鼠血尿素氮（blood"urea"nitrogen，BUN）、血肌酐（serum"creatinine，SCr）；②腎臟標本：干預12周后處死大鼠，腹部向上固定于解剖臺上，剪開腹部皮層，充分暴露腹腔，分離腎臟，于腎門處離斷腎蒂，將腎臟取出置于冰盒上，使用組織鑷仔細剝離腎臟包膜，將去除包膜的腎臟置于標本盒中，–80℃保存。

1.4.2""腎臟組織染色及免疫組織化學""①蘇木精-伊紅染色（hematoxylin"and"eosin"staining，HE染色）：4%多聚甲醛固定大鼠腎臟組織，酒精梯度脫水；分別置于二甲苯和乙醇等比例混合溶液中2h，再將其置于二甲苯（Ⅰ）溶液10min和二甲苯（Ⅱ）溶液10min；包埋石蠟組織；固定于切片機上，切片4μm，載玻片上晾干，60℃烤箱中烘干備用，萊卡熒光顯微鏡觀察拍照。②Masson染色：將大鼠腎臟組織切片脫蠟，依次用自來水和蒸餾水洗；再以Weigert蘇木精液或Regaud蘇木精染液染核5～10min，充分水洗；再給予Masson麗春紅酸性復紅液5～10min；2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷鉬酸水溶液分化3～5min；不經水洗，直接采用光綠液或苯胺藍染5min；0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固，使用萊卡熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4.3""蛋白質印跡檢測""取大鼠腎臟組織用冷磷酸鹽緩沖液（phosphate"buffer"saline，PBS）清洗，切至約1mm3，液氮下研磨，提取蛋白樣品。蛋白濃度應用BCA試劑盒檢測，30μg蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳凝膠100V電泳2h，400mA聚偏二氟乙烯膜轉膜2h，5%脫脂牛奶封閉2h，一抗[p-AMPK"1∶1000、p-mTOR"1∶1000、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（recombinant"glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase，GAPDH）1∶2000]4℃孵育過夜，Tris緩沖鹽溶液清洗3次，每次10min，二抗[山羊抗兔（鼠）免疫球蛋白G"HRP"1∶3000]室溫孵育2h，ECL發光液曝光成像，Image"J軟件分析條帶灰度值。

1.4.4""酶聯免疫吸附測定""采用酶聯免疫吸附測定法檢測COLⅠ、COL"Ⅳ、FN水平。

1.5""統計學方法

采用SPSS"26.0軟件處理數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""各組大鼠的腎組織病理情況

正常組大鼠的腎小管排列整齊，腎間質無異常，腎小球結構形態正常；模型組大鼠的腎間質有少量炎癥細胞浸潤，腎小球體積增大、系膜區增生，腎小管輕度擴張，腎小管上皮細胞空間泡變性，小動脈管壁增厚；低劑量組和高劑量組大鼠的腎間質、腎小管和腎小球結構排列較整齊，且大鼠的腎小球系膜區增生改善，腎小球體積縮小，腎小管損傷明顯減少，見圖1、圖2。

2.2""各組大鼠的腎功能指標比較

模型組、低劑量組和高劑量組大鼠的BUN、SCr和24h尿蛋白定量均顯著高于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的BUN、SCr和24h尿蛋白定量水平均顯著低于模型組，且高劑量組低于低劑量組（Plt;0.05），見表1。

2.3""各組大鼠的p-AMPK、p-mTOR蛋白表達比較

模型組、低劑量組和高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達顯著低于正常組，而p-mTOR蛋白表達顯著高于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達顯著高于模型組，而p-mTOR蛋白表達顯著低于模型組（Plt;0.05）；高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達顯著高于低劑量組，而p-mTOR蛋白表達顯著低于低劑量組（Plt;0.05），見表2、圖3。

2.4""各組大鼠的COLⅠ、COL"Ⅳ和FN水平比較

COL"Ⅳ和FN水平均顯著高于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的COLⅠ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著低于模型組，且高劑量組低于低劑量組（Plt;0.05），見表3。

3""討論

DN常見癥狀主要為持續性蛋白尿、腎功能損傷、水腫等，最終可發展為終末期腎病[7-11]。因此，采取科學有效的方法治療DN尤為關鍵。

近年來，鈉-葡萄糖耦聯轉運體2（sodium-glucose"linked"transporter"2，SGLT-2）抑制劑已被證實具有較好的腎臟保護作用[12-13]。SGLT-2抑制劑主要通過阻斷近端小管對葡萄糖的重吸收從而促進尿糖排泄，發揮降糖作用。SGLT-2抑制劑除降低血糖外，還可減少心血管事件發生[14-15]。達格列凈是SGLT-2抑制劑代表藥物，主要通過抑制腎近曲小管對葡萄糖的重吸收，從而使過量的葡萄糖從尿中排出，以此降低血糖[16-17]。本研究表明，達格列凈可顯著減輕腎臟病理損傷，降低BUN、SCr和24h尿蛋白定量，顯著改善DN大鼠的腎臟功能。

研究表明，DN的發病過程與腎臟細胞外基質大量沉積和腎臟細胞自噬功能受抑制等關系緊密[18]。腎臟細胞在糖尿病狀態下，其自噬功能受抑制，無法及時有效地清除毒性物質，導致其在細胞內大量堆積，損害細胞、加速衰老，導致腎臟損傷。自噬參與多種腎臟疾病的發生發展，自噬障礙使細胞內活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）增加，加重炎癥反應，從而促進細胞凋亡。AMPK是一種在能量耗竭條件下激活的營養素敏感激酶，mTOR是自噬過程中的關鍵調控分子，mTOR的激活在生理條件下可阻斷自噬。AMPK的激活對mTOR有抑制作用，此為自噬信號激活的經典通路之一。AMPK/mTOR信號通路在調控細胞自噬和衰老中發揮重要作用[19]。AMPK和mTOR經蛋白磷酸化可調節細胞代謝與自噬水平，抑制mTOR激酶信號通路、激活AMPK信號通路均可誘導細胞自噬以延緩衰老，延長生物體壽命[20]。本研究表明，低劑量組和高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達顯著高于模型組，而p-mTOR蛋白表達顯著低于模型組，由此可見達格列凈可通過上調p-AMPK蛋白表達及下調p-mTOR蛋白表達而發揮腎臟保護作用。

綜上所述，達格列凈對DN大鼠具有良好的腎臟保護作用，其機制可能與調節AMPK/mTOR信號通路表達有關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] WANG"S，"ZHANG"X，"WANG"Q，"et"al."Histone"modification"in"podocyte"injury"of"diabetic"nephropathy[J]."J"Mol"Med"（Berl），"2022，"100（10）："1373–1386.

[2] SULAJ"A，"KOPF"S，"VON"RAUCHHAUPT"E，"et"al."Six-month"periodic"fasting"in"patients"with"type"2"diabetes"and"diabetic"nephropathy："A"proof-of-concept"study[J]."J"Clin"Endocrinol"Metab，"2022，"107（8）："2167–2181.

[3] 劉翠蘭，"楊文，"劉圣君，"等."益腎化濕顆粒聯合骨化三醇對糖尿病腎病患者的臨床療效[J]."中成藥，"2023，"45（1）："86–89.

[4] 李國玲，"匡彬，"張舒，"等."基于AMPK/eNOS信號通路探討黃芪甲苷改善糖尿病腎病大鼠腎損傷的作用及機制研究[J]."廣州中醫藥大學學報，"2023，"40（3）："701–707.

[5] 張志勇，"李明旭，"于海，"等."達格列凈治療糖尿病腎病84例臨床療效觀察[J]."第二軍醫大學學報，"2021，"42（9）："1062–1066.

[6] 楊耀堂，"孫緒敏，"于德娟."維生素D3通過調控AMPK/mTOR信號通路對糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化的影響[J]."中國中西醫結合腎病雜志，"2023，"24（2）："144–147.