基于16S rDNA 測序對中重度牙周炎伴腦梗死患者齦下菌斑微生物群落結構分析

鐘曉雪，王 慧，陳敏哲，常 睿，賀小寧，2

（1.海南醫學院，海南 海口 570100；2.海南醫學院第二附屬醫院口腔科，海南 海口 570100）

牙周病是由多種致病因素引起的感染性疾病，牙菌斑生物膜是最主要的致病因素，以慢性牙周炎最常見。越來越多的證據表明，牙菌斑中的致病微生物及其代謝產物引起的全身炎癥和免疫反應是許多系統性疾病的潛在危險因素，包括心腦血管疾病、糖尿病、類風濕性關節炎和阿爾茨海默病等［1-4］。腦梗死是腦卒中的一種重要分型，由各種原因導致腦血管閉塞出現相應神經功能障礙的缺血性腦血管疾病，其病變基礎是動脈粥樣硬化。目前的證據表明，動脈粥樣硬化斑塊中具有復雜的微生物群，其微生物起源于口腔、腸道、呼吸道和皮膚［5］。多項研究通過多種檢測方法在患者動脈粥樣硬化斑塊中發現牙周致病菌［6，7］，提示主要來自齦下菌斑的牙周致病菌可能在動脈粥樣硬化斑塊形成和發展中起著重要作用。16S rDNA 測序是一種敏感、快捷并且準確的細菌組學檢測手段，可以較全面地評估宿主口腔齦下微生物群落組成結構［8］。據此，本研究采用16S rDNA 測序技術分析中重度牙周炎伴腦梗死患者齦下菌斑微生物群落結構特征及多樣性，并初步探討中重度牙周炎與腦梗死的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

篩選來自2021 年11 月～2023 年1 月某三甲醫院口腔科就診的中重度牙周炎患者10 例（PD 組），神經內科中重度牙周炎伴腦梗死患者10 例（CI-PD組）和體檢的健康人群10 例（CK 組）。其中PD 組患者年齡35～58 歲，平均（45.90±10.63）歲，男性6例，女 性4 例；CI-PD 組 患 者 年 齡54～70 歲，平 均（60.30±5.44）歲，男性6 例，女性4 例；CK 組患者年齡43～57 歲，平均（50.00±5.35）歲，男性5 例，女性5 例。本研究獲得醫院醫學倫理委員會審查批準（LW2021017），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.1 納入標準 35 歲≤年齡≤65 歲；至少有12顆牙齒存在，不包括第3 顆磨牙。

（1）牙周健康人群納入標準：無全身系統性疾病，口腔衛生良好，牙齦顏色正常，無紅腫出血溢膿，牙周袋探診深度（probing depth，PD）＜3 mm，無臨 床 附 著 喪 失（clinical attachment loss，CAL）等。（2）中重度牙周炎納入標準：參照《牙周病學》第四版教材①中度牙周炎：牙周袋≤6 mm，附著喪失3～4 mm，X 線片顯示牙槽骨水平型或角型吸收超過根長的1/3，但不超過根長的1/2，牙齒可能有輕度松動，多根牙的根分叉區可能有輕度病變，牙齦有炎癥和探診出血或有膿；②重度牙周炎：牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm，X 線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2，多根牙有根分叉病變，牙多有松動，炎癥較明顯。（3）腦梗死納入標準：需符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》的規定：①急性起病；②局灶性神經功能缺損（一側面部或肢體無力或麻木，言語障礙等），少數為全面神經功能缺損；③影像學出現責任病灶或癥狀/體征持續24 h 以上；④排除非血管性病因；⑤腦CT/MRI 排除腦出血。

1.1.2 排除標準 近半年行牙周治療者；復發性腦梗死、出血性腦卒中；長期使用抗生素及抗凝藥物者；其他部位嚴重感染、血液病、傳染性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、冠心病史、腫瘤、嚴重肝、腎功能不全以及高血壓患者；近3 個月服用任何影響系統性炎癥指標的藥物；1 個月內有大血管急性并發癥；半年內有大的手術、外傷史；處于妊娠期、哺乳期。

1.2 實驗方法

（1）記錄基本信息；（2）牙周臨床檢查與記錄：受檢人群的剩余牙數（不計智齒）、牙周探診深度、臨床附著水平及探診出血（bleeding on probing，BOP）；（3）拍攝曲面斷層片；（4）齦下菌斑收集：受檢人均在取樣前3 h 內禁止飲食和刷牙，選取探診最深的上頜第一磨牙和下頜第一磨牙的位點作為樣本，先刮盡齦上菌斑，使用菌斑染色劑檢測齦上菌斑去凈后，囑患者清水漱口，棉卷隔濕，氣槍吹干牙面，使用無菌齦下刮治器刮取牙周袋內菌斑將其置于含1 mL PBS 的2 mL 無菌EP 管，并在冰浴條件下快速轉移至1 000 r/min 離心機中離心5 min，棄上清液，留取沉淀，放入冰盒封存至-80 °C 冰箱中備用，送至廣州華研基因科技有限公司運用Illumnia NovaSeq 6000 測序平臺對16S rDNA V3-V4 區進行建庫測序，使 用Qiime（Version 1.9.1）、 R（Version 3.5.2）、mothur 及SPSS 等軟件進行生物信息學分析。

1.3 統計學方法

采用GraphPad、SPSS 等軟件進行數據分析，定性資料采用卡方檢驗，計量資料以（±s）表示，兩組間進行比較時，使用Welch's T 檢驗和Wilcoxon秩和檢驗；多組間進行比較時，使用TukeyHSD 檢驗和Kruskal-Wallis 秩和檢驗；雙變量之間差異性采用Anosim 相似性分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組間牙齒剩余數和牙周臨床指標比較

通過對3 組間牙齒剩余數和牙周臨床指標進行統計分析，得出CI-PD 組牙齒剩余數少于CK 組和PD 組，且與CK 組間差異具有統計學意義（P＜0.05）；CI-PD 組和PD 組的牙周探診深度、探診出血和臨床附著喪失組間差異無統計學意義（P＞0.05），但兩組均明顯比CK 組嚴重，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組間牙齒剩余數和牙周臨床指標比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of the missing teeth and periodontal clinical index among the three groups（n=10，±s）

表1 3 組間牙齒剩余數和牙周臨床指標比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of the missing teeth and periodontal clinical index among the three groups（n=10，±s）

注：與CK 組相比，*P＜0.05。

CAL(mm)0.000±0.000 2.825±0.874*3.350±1.460*134.604＜0.001組別CK 組PD 組CI-PD 組FP牙齒剩余數（顆）27.700±0.675 27.000±1.054 22.800±4.733*8.791 0.001 BOP(%)10.333±3.123 63.000±14.589*60.500±10.475*223.333＜0.001 PD(mm)0.250±0.439 2.950±0.714*3.025±0.800*129.177＜0.001

2.2 微生物群落結構分析

2.2.1 測序樣本數據 對30 個齦下菌斑樣本進行16S rDNA 測序，數據過濾后平均每個樣本獲得了76 588 條Clean reads，平 均 生 成70 166 條Effective tags。在97%的相似度水平下對序列進行聚類，共獲 得 操 作 分 類 單 元（operational taxonomic units，OTU）數 目 為8 008，平 均 每 個 樣 本 產 生266 條OTU。

2.2.2 α 多樣性分析 代表α 多樣性的Observedspecies（Sob）指數和Shannon 指數表明PD 組樣本α多樣性顯著大于CK 組（P＜0.05），其余組間樣本α多樣性無顯著差異，提示健康人群患有牙周炎后齦下菌群微生物多樣性會發生變化（圖1、2）。對本研究30 個樣本進行稀釋曲線分析，隨著測序深度增加，當序列數超過50 000 時，稀釋性曲線總體趨于平緩，說明本研究齦下微生物群落的測序數據量合理（圖3）。

圖1 CK組、PD組、CI-PD組Observed-species指數比較圖Fig 1 Comparison of Observed-species index among CK group， PD group and CI-PD group

圖2 CK 組、PD 組、CI-PD 組Shannon 指數比較圖Fig 2 Comparison of Shannon index among CK group，PD group and CI-PD group

圖3 稀釋曲線圖Fig 3 Rarefaction curve

2.2.3 β 多樣性分析 在不同組間微生物群落差異的β 多樣性研究中，基于主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和相似性分析結果看出組間差異大于組內，PD 組與CI-PD 組（R=0.110 9）兩組間樣本接近，組間樣本β 多樣性差異無統計學意義（P＞0.05），可說明兩組齦下菌斑物種組成相似度較高，而PD 組與CK 組（R=0.539 8）和CI-PD 組與CK 組（R=0.790 4）兩組間樣本均基本分開，組間β多樣性有顯著差異，具有統計學意義（P＜0.01），說明PD 組和CI-PD 組與CK 組中齦下菌斑物種組成相似度較低（圖4）。

圖4 基于樣本間β 多樣性指數的PCoA 散點圖Fig 4 PCoA scatter plot based on β diversity index between samples

2.2.4 物種分布比較 （1）在PD 組和CI-PD 組中，門水平最多的物種是擬桿菌門（Bacteroidetes），其次是梭桿菌門（Fusobacteria）。而CK 組中，門水平最多的物種是放線菌門（Actinobacteria），其次是梭桿菌門（圖5）。3 組人群中，在屬水平上最多的物種均為梭桿菌屬（Fusobacterium），但是PD 組和CIPD 組中第二多的物種為卟啉單胞菌屬（Porphyromonas），CK 組中第二多的物種為放線菌屬（Actinomyces）（圖6）。

圖5 3 組樣本齦下菌群在門水平上的豐度Fig 5 The abundance of subgingival flora in three groups of samples at the phylum level

圖6 3 組樣本齦下菌群在屬水平上的豐度Fig 6 The abundance of subgingival flora in three groups of samples at the genus level

（2）對3 組人群的齦下菌群物種分布進行交集分析，結果顯示，3 組中共有OTU 數量為192 個，其中CK 組和CI-PD 組共有的OTU 數量僅為7 個，CK組和PD 組共有的OTU 數量41 個，PD 組和CI-PD組共有的OTU 數量53 個。CK 組、PD 組和CI-PD組獨有的OTU 數量分別為40 個、28 個和101 個，顯示了CI-PD 組齦下菌群物種豐富度最高，其次是CK 組，最低是PD 組。在菌屬水平上，3 組共有的菌屬 數 量 為52 個，CK 組、PD 組 和CI-PD 組 獨 有 的 菌屬為15 個、3 個和32 個。

2.2.5 不同組間差異菌群比較

2.2.5.1 3 組人群齦下菌群差異分析 在屬水平上，CKvs.CI-PD、CKvs.PD 和PDvs.CI-PD 分別有23個、23 個和15 個差異物種（圖7）。CKvs.CI-PD、CKvs.PD 分別有1 個和7 個特有差異菌屬。其中，CKvs.PD、CKvs.CI-PD 和PDvs.CI-PD 有2 個 共有差異物種奈瑟菌屬和羅氏菌屬，這2 個菌屬在CK組中的豐度顯著高于PD 組和CI-PD 組。

圖7 齦下菌群屬水平差異物種韋恩圖Fig 7 Vene diagram of horizontal difference species of subgingival flora

結果顯示，與CK 組相比，PD 組和CI-PD 組中卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬、產絲菌屬和TG5 顯著增多；而放線菌屬、棒狀桿菌屬、奈瑟菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、羅氏菌屬、鏈球菌屬和心桿菌屬顯著減少。此外，CI-PD 組的勞特普羅式菌屬和嗜血桿菌屬豐度顯著低于CK 組。CI-PD 組與PD 組齦下菌群相比，CI-PD 組齦下菌群中的奈瑟菌屬、勞特羅普氏菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、羅氏菌屬、嗜血桿菌屬、心桿菌屬均顯著低于PD組（表2）。

表2 3 組差異菌屬豐度分析Tab 2 Analysis of the abundance of three groups of differential bacteria

2.2.5.2 ROC 曲線分析 受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析通過統計ROC 曲 線 下 面 積（area under curve， AUC）大 小 評估物種作為生物標記的正確性。在AUC＞0.5 的情況下，AUC 越接近于1，說明準確性越高。默認根據T 檢驗、秩和檢驗將PD 組、CI-PD 組分別與CK組間的顯著差異物種逐一進行ROC 曲線分析，分別獲得PD 組、CI-PD 組的微生物菌屬生物標記（圖8、9）。

圖8 CK 組與PD 組的菌群標志物ROC 曲線Fig 8 ROC curve of flora markers in CK group and PD group

圖9 CK 組與CI-PD 組的菌群標志物ROC 曲線Fig 9 ROC curve of flora markers in CK group and CIPD group

3 討論

研究表明牙周炎和腦梗死之間存在關聯［9］，然而，目前還缺乏基于齦下菌斑微生物群落討論兩者相關性的研究。16S rDNA 存在于所有生物體中，因其在結構和功能上具有高度的保守性，所以常被用于微生物測序。研究表明16S rDNA 的9 個可變區（V1-V9）中V3-V5 區較適于齦下菌群多樣性的研究［10］。因此，本研究采用16S rDNA 的V3-V4 區測序技術對中重度牙周炎伴腦梗死患者的齦下菌斑微生物群落結構特征及多樣性行初步研究。

本研究中，中重度牙周炎患者和中重度牙周炎伴腦梗死患者的齦下菌斑微生物群落結構較為相似，但兩組齦下菌斑微生物多樣性均較健康人群發生變化。與健康人群相比，中重度牙周炎患者和中重度牙周炎伴腦梗死患者的齦下菌群中擬桿菌門、卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬、互養菌屬TG5 和纖毛菌屬豐富度較高。同樣，Park 等人采用高通量測序技術的研究表明牙周炎患者齦下菌斑中擬桿菌門、梭桿菌門、卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬和密螺旋體屬豐度較高，鏈球菌屬和梭桿菌屬在健康人群中豐度較高［11］。Tsai 等［12］采用qPCR 和16S rRNA 測序方法對重度慢性牙周炎患者的牙菌斑檢測發現優勢菌門屬是厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、普雷沃氏菌屬、卟啉單胞菌屬、密螺旋體屬和纖毛菌屬。表明牙周炎核心微生物在不同牙周炎人群中相對穩定，且這些菌屬的增加提示它們可能在中重度牙周炎和腦梗死中發揮作用。劉冬宇等對缺血性腦卒中伴慢性牙周炎患者與慢性牙周炎患者的齦下菌斑分析發現牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌及福賽坦氏菌分布無區別，但具核梭桿菌檢出率與慢性牙周炎病變程度呈正比關系［13］。張閣等［14］發現福賽坦氏菌可能與缺血性腦卒中關系更密切。研究發現動脈粥樣硬化斑塊中檢測的牙周致病菌主要是伴放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌、普雷沃氏菌及中間普氏菌等［15，16］。由于本研究測序鑒定是齦下菌群門屬水平，未來研究可進行宏基因測序鑒定到菌種水平，進一步探索缺血性腦卒中伴中重度牙周炎患者的齦下菌群優勢菌種與腦梗死之間相關性。此外，體外及動物體內研究發現卟啉單胞菌屬中的牙齦卟啉單胞菌可以通過影響內皮細胞黏附分子、促炎細胞因子和趨化因子等表達，從而進一步促進內皮功能障礙導致動脈粥樣硬化［17，18］。

本研究發現中重度牙周炎患者和中重度牙周炎伴腦梗死患者的齦下菌斑中放線菌屬、棒狀桿菌屬、奈瑟菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、羅氏菌屬、鏈球菌屬和心桿菌屬的豐度顯著低于健康人群，而健康人群中奈瑟菌屬和羅氏菌屬的豐度相對較高，與先前研究結果一致［19，20］。這些菌屬的減少表明中重度牙周炎和腦梗死可能與正常牙周菌群的失衡有關，導致為宿主提供保護作用的一些有益菌屬減少，正常菌群內的失衡使宿主容易受到病原菌的攻擊，這可能增加中重度牙周炎和腦梗死的風險。

本項研究值得注意的是中重度牙周炎伴腦梗死患者的齦下菌斑中奈瑟菌屬、勞特羅普氏菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、羅氏菌屬、嗜血桿菌屬和心桿菌屬的豐度較中重度牙周炎患者更低。提示這些菌屬在齦下菌斑微生物群落中的低豐度可能在腦梗死疾病中起著重要作用。

當微環境發生變化時，齦下菌斑微生物群落穩態失衡，而微生物群落和宿主之間存在相互影響的關系，不平衡的微生物群落影響宿主的反應，導致炎癥水平發生變化，不僅推動牙周炎的發生、發展，而且可能是牙周炎與腦梗死之間關聯的關鍵紐帶。另外，研究發現積極控制牙周菌斑可以對腦梗死和牙周炎的防治產生積極影響［21，22］。

綜上所述，本研究分析了中重度牙周炎人群、中重度牙周炎伴腦梗死人群及牙周健康人群齦下菌斑微生物群落結構和物種多樣性，這為進一步了解牙周炎及腦梗死人群的齦下微生物群落與宿主相互作用提供一定的參考內容。牙周炎人群齦下微生物的改變與腦梗死的因果關系目前仍無法得出結論，未來的研究需要在加大樣本量基礎上，結合蛋白質組學和代謝組學技術的多組學研究方法，對微生物組在不同條件下的優勢菌群及產生的功能蛋白質和代謝物進行分析，將有助于在牙周炎的早期發現潛在的生物標志物，以及了解復雜的齦下微生物群落的失衡對腦梗死主要病理基礎動脈粥樣硬化形成的機制和程度的影響。

作者貢獻度說明：

鐘曉雪：實驗設計，數據收集，執筆撰寫；王慧：實驗設計，數據收集；陳敏哲、常睿：數據整理及分析；賀小寧：審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。