多胺調(diào)控青海草地早熟禾抗旱性

摘要：青海草地早熟禾（Poa pratensis L. cv. Qinghai）具有極強(qiáng)的耐寒性，已廣泛應(yīng)用于青海三江源退化高寒草地的修復(fù)，但對(duì)其抗旱性研究較少。本研究利用聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）模擬干旱處理青海草地早熟禾，測(cè)定其響應(yīng)干旱的生理變化，并檢測(cè)外源腐胺、亞精胺處理提高青海草地早熟禾抗旱性的效應(yīng)。結(jié)果顯示，PEG處理后，青海草地早熟禾脯氨酸、腐胺、亞精胺和精胺含量不斷升高，脯氨酸含量的變化與腐胺、亞精胺和精胺含量正相關(guān)；多胺合成關(guān)鍵酶基因ADC1，ADC2-1，SAMDC2，SPDS1基因的表達(dá)量也提高。外源腐胺與亞精胺預(yù)處理能夠提高青海草地早熟禾抗旱性和脯氨酸含量，本文研究結(jié)果表明，多胺通過(guò)調(diào)控干旱條件下脯氨酸的積累提高青海草地早熟禾抗旱性。

關(guān)鍵詞：青海草地早熟禾；多胺；脯氨酸；抗旱性

中圖分類號(hào)：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）04-1210-07

Polyamines Regulate Drought Tolerance in Kentucky Bluegrass Cultivar ‘Qinghai’

LI Yu-hui， LIU Rui， LUO Yu-rong， LU Shao-yun*

Abstract：The native Kentucky bluegrass cultivar ‘Qinghai’ （Poa pratensis L. cv. Qinghai），known for its high cold tolerance，has been extensively used in the restoration of degraded alpine grassland in the source of Three rivers in Qinghai Province. However，its drought tolerance remains unexplored. This study investigated the physiological responses of the ‘Qinghai’ cultivar to drought using polyethylene glycol （PEG） as a simulated drought treatment. We also examined the effects of exogenous putrescine and spermidine treatments on improving the drought tolerance. The results showed that proline，putrescine，spermidine，and spermine levels were continuously increased after treatment with PEG. This increase was accompanied by elevated transcript levels of genes involved in polyamine biosynthesis，including ADC1，ADC2-1，SAMDC2， and SPDS1. Proline levels showed a positive relationship with putrescine，spermidine，and spermine levels. In addition，pretreatment with exogenous putrescine and spermidine led to increased drought resistance and proline levels in ‘Qinghai’ under drought stress. It is suggested that polyamines regulate drought tolerance in ‘Qinghai’ through promoted proline accumulation under drought conditions.

Key words：Poa pratensis L. cv. Qinghai;Polyamines;Proline;Drought tolerance

草地早熟禾（Poa pratensis）是最重要的冷季型草坪草之一，在我國(guó)北方大部分地區(qū)均有種植和應(yīng)用［1］。草地早熟禾具有綠期長(zhǎng)、耐踐踏、耐修剪等優(yōu)點(diǎn)，但其生長(zhǎng)對(duì)水分的要求較高，干旱是限制其正常生長(zhǎng)和草坪質(zhì)量的主要非生物脅迫之一［2-3］。干旱條件下草地早熟禾游離脯氨酸含量增加［4-5］。干旱條件下光合碳還原途徑關(guān)鍵酶（核酮糖1，5-二磷酸羧化/加氧酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶）活性，蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉等碳水化合物的積累水平及其代謝關(guān)鍵酶（例如蔗糖磷酸合酶、蔗糖合酶）活性大小與草地早熟禾抗旱性有關(guān)［6-7］。此外，干旱下抗氧化保護(hù)酶活性及其基因表達(dá)、膜脂不飽和程度和不飽和脂肪酸（特別是亞麻酸和亞油酸）含量也與草地早熟禾抗旱性有關(guān)［8-10］。植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin，CTK）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、油菜素甾醇（Brassinosteroids，BR）也參與調(diào)控草地早熟禾抗旱性［11-13］。

青海草地早熟禾（Poa pratensis L.cv. Qinghai）具橫走的地下莖，耐寒性極強(qiáng)、草質(zhì)優(yōu)良、適口性好、產(chǎn)草量高，非常適于在青藏高原海拔3 000～4 500 m高寒地區(qū)種植［14-15］，是青海省三江源區(qū)“黑土灘”退化草地修復(fù)的優(yōu)選草種［16］。由于青海草地早熟禾對(duì)水分要求高于其他鄉(xiāng)土草種，限制了它在青藏高原更廣泛區(qū)域的應(yīng)用，生態(tài)功能未能充分發(fā)揮。此外，全球氣候變暖疊加的干旱脅迫也將進(jìn)一步降低草地生產(chǎn)力。因此，提高青海草地早熟禾抗旱性是青海退化草地修復(fù)、提高草地生產(chǎn)力的需要，但目前對(duì)青海草地早熟禾響應(yīng)干旱的生理生化機(jī)制研究很少。

多胺是植物體內(nèi)重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，外源多胺能提高植物抗逆性［17］。過(guò)表達(dá)多胺合成關(guān)鍵酶基因ADC，ODC和SAMDC的轉(zhuǎn)基因植物提高了腐胺、精胺與亞精胺的含量，并提高對(duì)多種逆境（如干旱、鹽害、冷害、凍害和病害）的抗性［17-19］。多胺也調(diào)控草坪草的抗逆性，低溫下結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）內(nèi)源腐胺和亞精胺含量上升［20］。過(guò)表達(dá)狗牙根（Cynodon dactylon （L.） Persoon）CdSAMDC1的轉(zhuǎn)基因假儉草（Eremochloa ophiuroides （Munro） Hack.）中檢測(cè)到較高的內(nèi)源亞精胺和精胺含量，耐寒性顯著增強(qiáng)［21］。此外，外源施加腐胺、亞精胺和精胺可顯著提高假儉草的耐旱性［22］。劉南清的研究表明，噴施0.1 mmol·L-1 腐胺和亞精胺能顯著提高假儉草的耐寒性［23］；安勐潁等報(bào)道外源亞精胺能提高草地早熟禾幼苗的耐鹽性［24］。這些研究表明，多胺調(diào)控草坪草抗逆性，但多胺與草地早熟禾抗旱性的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。

本文研究了青海草地早熟禾響應(yīng)干旱的生理生化機(jī)制，闡明多胺在調(diào)控青海草地早熟禾抗旱性中的作用，并檢測(cè)外源腐胺、亞精胺處理提高青海草地早熟禾抗旱性的效應(yīng)，旨為探究提高青海草地早熟禾抗旱性的有效化學(xué)調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

將青海草地早熟禾種子（由青海大學(xué)劉穎博士提供）均勻的播撒于裝有營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1）的花盆中（直徑18 cm，深度16 cm），在控溫溫室（25℃）自然光照下培養(yǎng)8周。將上述幼苗根系洗凈后，放入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d（培養(yǎng)條件設(shè)置為：光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·S-1，溫度25℃，光/暗14 h/10 h），使幼苗根系恢復(fù)生長(zhǎng)。

（1）為研究植物對(duì)干旱的生理響應(yīng)，將上述材料移到含20% PEG-6000 的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行滲透脅迫處理（模擬干旱）：在處理2，6 h時(shí)剪取葉片，液氮速凍后于-80℃冰箱保存，用于基因表達(dá)分析；在處理2，4，6 d時(shí)剪取葉片，用于生理生化分析，以PEG-6000處理前的樣品為對(duì)照。

（2）為研究多胺提高抗旱性的效應(yīng)，將光照培養(yǎng)箱內(nèi)溶液培養(yǎng)的材料分為3組（對(duì)照組：繼續(xù)用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。腐胺處理組：用含0.2 mmol·L-1腐胺的營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處理1 d。亞精胺處理組：用含0.2 mmol·L-1亞精胺的營(yíng)養(yǎng)液預(yù)處理1 d）。然后將這些材料以含20% PEG-6000的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行干旱脅迫處理，分別在處理3和6 d時(shí)剪取葉片，進(jìn)行生理生化分析。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 相關(guān)含水量和相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 參照Liu等［25］的方法測(cè)定相對(duì)含水量和相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.2 脯氨酸含量的測(cè)定 脯氨酸含量參照Yang等［26］的方法并進(jìn)行改進(jìn)。取烘干后的葉片 0.01 g左右（根據(jù)實(shí)際可調(diào)整），置于帶蓋試管中，提取液為提前配制好的 5%的磺基水楊酸，向每個(gè)試管中加入5 mL提取液，水浴鍋中沸水浴 10 min，冷卻至室溫后，吸取1 mL左右（根據(jù)實(shí)際可調(diào)整體積），置于新的試管中，加入2 mL冰乙酸和3 mL的酸性茚三酮顯色液，沸水浴40 min，冷卻至室溫后，分別加入5 mL甲苯充分搖勻，靜置，可看到紅色物質(zhì)被萃取出來(lái)，待穩(wěn)定后測(cè)定 520 nm下的OD值，并通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算脯氨酸含量。

1.2.3 多胺含量的測(cè)定 參照Chen等［27］的方法并進(jìn)行改進(jìn)測(cè)定葉片的游離多胺含量。取0.1 g葉片，液氮冷凍后冰上研磨，將粉末轉(zhuǎn)移到含有2 mL預(yù)冷的5%高氯酸的離心管中，4℃下提取1 h；在4℃下高速離心30 min后取500 μL上清液，加入苯甲酰氯7 μL、2 mol·L-1 NaOH 1 mL，渦旋30 s，37℃孵育20 min；加入2 mL飽和NaCl溶液混勻，加入2 mL乙醚，室溫離心；吸取1 mL上清液真空干燥，加入1 mL 36%甲醇溶解，過(guò)0.45 μm濾膜，保存在上樣瓶中進(jìn)行HPLC測(cè)定。HPLC測(cè)定條件為：C18反向柱，上樣體積為15 μL，250×4.6 mm、流動(dòng)相為36%甲醇，紫外掃描檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為233 nm。

1.2.4 基因表達(dá)分析 參照Liu等［25］方法提取葉片RNA，分析基因的相對(duì)表達(dá)量。使用Trizol法提取總RNA，稱取 0.1 g左右青海草地早熟禾葉片轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨葉片成粉末狀，然后向粉末中加入1 mL的Trizol并混勻；參照艾克瑞生物公司的使用說(shuō)明進(jìn)行后續(xù)RNA的提取。采用qRT-PCR分析多胺合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，以Actin作為內(nèi)參基因。

實(shí)驗(yàn)中用到的所有引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2019以及SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，結(jié)果數(shù)值平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Duncan’s法統(tǒng)計(jì)分析Plt;0.05水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱對(duì)青海草地早熟禾水分狀況和脯氨酸含量的影響

葉片相對(duì)含水量反映植物的水分狀況，相對(duì)電導(dǎo)率反映植物質(zhì)膜受傷害程度。正常條件下青海草地早熟禾葉片的相對(duì)含水量為99.8%，相對(duì)電導(dǎo)率為4.8%。以20% PEG處理2，4，6 d后，葉片的相對(duì)含水量不斷降低，分別為83.7%，60.9%，34.3%（圖1A），其相對(duì)電導(dǎo)率不斷升高，分別為24.8%，64.4%，72.5%（圖1B），表明隨著PEG處理時(shí)間延長(zhǎng)，植物膜系統(tǒng)受傷害程度不斷加深。

脯氨酸是植物細(xì)胞的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，隨著PEG處理時(shí)間延長(zhǎng)，脯氨酸含量不斷增加，處理前及處理2，4，6 d后，脯氨酸含量分別為0.26，0.38，0.66和1.23 mg·g-1 DW，處理6 d時(shí)較處理前提高了3.73倍（圖1C）。

2.2 干旱對(duì)青海草地早熟禾多胺含量及關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

多胺在植物抗逆性調(diào)控中起重要作用，進(jìn)一步測(cè)定了PEG處理對(duì)腐胺、亞精胺和精胺含量的影響。結(jié)果顯示，PEG處理后青海草地早熟禾腐胺、亞精胺和精胺含量不斷升高，PEG處理6 d時(shí)腐胺、亞精胺和精胺含量分別比處理前提高了1.01，0.95倍和1.56倍（圖2A-C）。

進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)多胺生物合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行qRT-PCR分析。精氨酸脫羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）是腐胺合成關(guān)鍵酶，ADC1表達(dá)在PEG處理2 h就受到誘導(dǎo)，6 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量與2 h時(shí)相近，是處理前的2.9倍（圖3A）；ADC2-1的相對(duì)表達(dá)在處理2 h時(shí)略有升高，6 h時(shí)升高至處理前的10.6倍（圖3B）。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）和亞精胺合酶（Spermidine synthase，SPDS）是亞精胺和精胺合成的關(guān)鍵酶，PEG處理2 h時(shí)SAMDC和SPDS的相對(duì)表達(dá)量與處理前差異不顯著，處理6 h時(shí)分別是處理前的2.87倍（圖3C）和1.61倍（圖3D）。

2.3 青海草地早熟禾多胺與脯氨酸含量的相關(guān)性分析

進(jìn)一步對(duì)PEG處理下青海草地早熟禾多胺與脯氨酸含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，腐胺、亞精胺以及精胺含量的變化均與脯氨酸含量的變化呈顯著的正相關(guān)性（圖4A-C），表明隨著干旱脅迫的加劇，青海草地早熟禾多胺含量的增加會(huì)促進(jìn)脯氨酸積累增加，進(jìn)一步提高青海草地早熟禾抗旱性。

2.4 外源多胺對(duì)青海草地早熟禾抗旱性的影響

為進(jìn)一步證明多胺在調(diào)控青海草地早熟禾抗旱性中的作用，測(cè)定了外源腐胺和亞精胺對(duì)青海草地早熟禾抗旱性的影響。結(jié)果顯示，隨著PEG處理時(shí)間延長(zhǎng)，相對(duì)含水量逐漸降低（圖5A），相對(duì)電導(dǎo)率不斷升高（圖5B）；腐胺和亞精胺處理植株的葉片含水量高于對(duì)照（圖5A），相對(duì)電導(dǎo)率低于對(duì)照（圖5B）。在PEG處理6 d時(shí)，腐胺和亞精胺處理植株的相對(duì)含水量分別為52.6%和49.3%，兩者間差異不顯著，均高于對(duì)照植株的40.7%（圖5A）；腐胺和亞精胺處理植株的相對(duì)電導(dǎo)率分別為32.5%和36.3%，兩者間差異不顯著，均低于對(duì)照植株的48.9%（圖5B）。結(jié)果表明，腐胺和亞精胺預(yù)處理提高了青海草地早熟禾的抗旱性。

PEG處理前，腐胺和亞精胺處理的植株與對(duì)照植株間脯氨酸含量沒(méi)有顯著差異。PEG處理后所有植株的脯氨酸含量都迅速提高，腐胺和亞精胺處理植株的脯氨酸含量都顯著高于對(duì)照植株（圖5C）。例如，對(duì)照植株在PEG處理3 d和6 h時(shí)，脯氨酸含量分別為處理前的1.3和4.0倍，腐胺處理植株的脯氨酸含量分別為處理前的2.9和6.1倍，亞精胺處理植株的脯氨酸含量分別為處理前的2.5和7.3倍（圖5C）。結(jié)果表明，外源多胺處理提高干旱條件下青海草地早熟禾的脯氨酸含量。

3 討論

干旱是影響高原地區(qū)牧草種植的主要非生物脅迫因子之一，尋找提高植物耐旱性的方法對(duì)于高寒牧草產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義［28］。葉片相對(duì)含水量常用來(lái)作為反映植物遭受干旱脅迫后的水分虧缺程度的重要指標(biāo)［29］。在干旱脅迫對(duì)6種高寒禾草的生理響應(yīng)研究中，6種禾草的葉片相對(duì)含水量均隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而下降［30］。本研究中，隨著PEG模擬干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，青海草地早熟禾的葉片相對(duì)含水量不斷降低，表明青海草地早熟禾遭受水分虧缺逐漸加重。干旱脅迫下，植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，細(xì)胞受到一定程度的損傷，而通過(guò)測(cè)定外滲液電導(dǎo)率的變化能夠反映出質(zhì)膜受損的程度并體現(xiàn)植物抗逆性的強(qiáng)度［30］。本研究中青海草地早熟禾隨著干旱程度的加劇，其葉片相對(duì)電導(dǎo)率也不斷提高，表明其細(xì)胞膜受損程度不斷加重，植株對(duì)干旱的耐受性也逐漸降低。脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物適應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［25］。本研究中，隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，青海草地早熟禾的葉片脯氨酸含量逐漸增加，這有利于降低其滲透勢(shì)，保持正常的水分生理功能，以適應(yīng)干旱脅迫，這與董沁等對(duì)七種野生早熟禾（Poa L.）在干旱條件下的脯氨酸響應(yīng)結(jié)果一致［31］。

多胺作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［32-33］。本研究中，干旱脅迫下，青海草地早熟禾多胺合成相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)，且內(nèi)源腐胺、精胺與亞精胺含量也顯著提高，說(shuō)明青海草地早熟禾內(nèi)源多胺參與了干旱脅迫下的逆境調(diào)控。有研究表明內(nèi)源腐胺、精胺和亞精胺含量的升高有利于提高鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）和番茄（Solanum lycopersicum L.）的抗旱性［34-35］，說(shuō)明在干旱脅迫下，植物內(nèi)源多胺含量的增加，有利于增強(qiáng)植物的抗旱性。鑒于這一特性，通過(guò)人工干預(yù)外源施加多胺而提高內(nèi)源多胺含量，成為提高植物抗旱性的一種有效策略。本研究中，PEG模擬干旱條件下，與正常不施加多胺處理組相比，外源施加腐胺或亞精胺處理青海草地早熟禾的相對(duì)電導(dǎo)率增加的幅度更小，且能維持更高的相對(duì)含水量，說(shuō)明外源施加多胺能緩解干旱脅迫對(duì)青海草地早熟禾的損傷，增強(qiáng)了青海草地早熟禾抗旱性。這與干旱脅迫下，外源施加多胺對(duì)匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera L.）［36］、假儉草［37］以及青海扁莖早熟禾（Poa pratensis var. anceps‘Qinghai’）［38］等結(jié)果一致。

研究還發(fā)現(xiàn)，PEG處理過(guò)程中青海草地早熟禾腐胺、亞精胺和精胺含量的變化與脯氨酸含量的變化顯著正相關(guān)，外源腐胺和亞精胺處理提高了脯氨酸含量，表明干旱條件下草地早熟禾脯氨酸含量的提高受到多胺含量的調(diào)控。這與外源多胺提高干旱脅迫下青海扁莖早熟禾［38］和白車軸草（Trifolium repens L.）［39］脯氨酸積累，增強(qiáng)抗旱性結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論

在干旱脅迫條件下，青海草地早熟禾葉片的相對(duì)含水量下降，相對(duì)電導(dǎo)率增加，脯氨酸含量快速上升；腐胺、亞精胺和精胺的含量增加與多胺合成關(guān)鍵酶基因ADC1，ADC2-1，SAMDC2，SPDS1的表達(dá)量提高有關(guān)，而且多胺含量升高與脯氨酸積累正相關(guān)，表明內(nèi)源多胺調(diào)控青海草地早熟禾對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)。外源腐胺與亞精胺預(yù)處理可以顯著提高青海草地早熟禾抗旱性，這可能與多胺提高脯氨酸含量，從而降低干旱傷害有關(guān)。本研究為利用多胺等外源物質(zhì)提高青海草地早熟禾抗旱性提供了參考。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-08-29；修回日期：2023-10-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U21A20241）資助

作者簡(jiǎn)介：李鈺輝（1998-），男，漢族，廣東湛江人，碩士研究生，主要從事草坪草的抗逆研究，E-mail：20203164108@scau.edu.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：turflab@scau.edu.cn