漬水和生物炭對紫花苜蓿幼苗生長和抗氧化酶活性的影響

摘要：豆科植物作為退化生態系統植被恢復的先鋒物種在紫色土區的適應機理尚不清楚。本研究以紫花苜蓿‘三得利’（Medicago sativa L. ‘Sanditi’）為研究對象，紫色土為基質，通過溫室盆栽實驗，進行漬水和生物炭添加（0.5%，質量比）處理，研究植物株高、根長、生物量和葉片過氧化氫酶（Catalase，CAT）與過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性等。結果表明：漬水處理僅增加植物莖長和全長；生物炭添加處理增加植物株高、地上部分生物量和總生物量，降低植物根莖長度比、根冠比和CAT與POD活性，且上述效應在漬水條件下也同樣存在；生物炭添加對CAT活性影響的時間長于POD。綜上，紫花苜蓿能適應一定的漬水環境，生物炭可作為紫色土漬水環境的改良劑，并能夠促進紫花苜蓿生長與生物量的累積。本研究為紫花苜蓿在南方濕熱地區種植與管理提供了案例參考和數據支撐。

關鍵詞：紫花苜蓿；水分脅迫；生物炭；抗氧化酶；生物量

中圖分類號：S541 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）04-1087-07

Effects of Waterlogging and Biochar Addition on the Growth and Antioxidant Enzyme Activity of Alfalfa Seedlings

ZHOU Zhi-dong1， ZHANG Yu1， LI Xiang-ru1， YANG Shi-jian1， YANG Jing1， TAN Jing1， LIU Ying-cheng1， CHEN Yuan-qi2，3*

Abstract：The adapting mechanism of legume plants as pioneer species in degraded ecosystems is still unclear in the purple soil area. Therefore，in this study，the Medicago sativa L. ‘Sanditi’ was selected and planted in the purple soil collected from a subtropical hilly slope. This pot experiment with the treatments of waterlogging and biochar addition （0.5%，w/w） was conducted in a greenhouse. The plant height，root length，biomass （above，below，and total），leaf catalase （CAT） and peroxidase （POD） activities of M. sativa were investigated. The results showed that waterlogging treatment only increased its stem length and total length. Biochar addition significantly increased plant height and biomass，but decreased the ratio of root-to-shoot length，the ratio of root biomass to aboveground biomass，and CAT and POD activities. These effects of biochar addition were also observed under the condition of waterlogging. Moreover，there was a longer term effect of biochar addition on CAT activity than on POD activity. These findings indicated that M. sativa could adapt to a certain waterlogged environment，and biochar could be applied to the waterlogged purple soil as an ameliorant. Biochar addition could promote the growth and biomass accumulation of M. sativa. Together，this study provides a case reference and data support for planting and management of M. sativa in the hot and humid southern region of China.

Key words：Alfalfa;Water stress; Biochar;Antioxidant enzymes;Biomass

紫色土是我國重要的土地資源，主要分布于長江以南和四川盆地廣大低山丘陵，衡陽是湖南紫色土的兩大主要分布區之一，其面積達19.73萬hm2［1］。紫色土坡地生態脆弱，養分不協調，有機質和氮含量都較低［2］。紫色土地區植被遭破壞后，表土易流失，林草恢復十分困難，是我國南方極具代表性的生態災難區之一［3］。豆科植物作為退化生態系統植被恢復的先鋒物種，在紫色土丘陵坡地的植被恢復中具有良好的效果［4］。擁有“牧草之王”美譽的苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上種植最廣泛和最重要的飼料作物［5］，因此，適宜的苜蓿種植，不僅能促進該區域的植被恢復，亦對當地畜牧業發展具有重要影響。紫花苜蓿‘三得利’（Medicago sativa L. ‘Sanditi’）兼具產量、品質和長勢等優勢，為我國長江中下游地區苜蓿的最佳選擇品種之一［6-7］，且具有一定耐澇性［8］。

南方濕熱地區降水量高，易發生洪澇災害［9］。梅雨季節土壤易積水，即使擁有良好排水系統的農田仍會長期處于水分飽和狀態［10］。澇漬會阻礙細胞的氧化磷酸化過程，導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累，致使細胞出現大面積凋零，影響植物生長發育［11］。在漬水條件下，植物通過增強ROS清除系統來保護自身組織［12］，其中過氧化氫酶（Catalase，CAT）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）在ROS清除系統中發揮重要作用，兩者常被作為各種脅迫處理的測量指標［13］。關于漬水對紫花苜蓿生長和生理變化的影響已有一些研究報道［14-15］，如董慧［15］發現漬水后5個苜蓿品種株高、根系長度和根干重均下降，POD、CAT和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性則表現為先升后降。生物炭作為常用的土壤改良劑，具有比表面積大、吸附能力強、對環境污染小和促進植物生長等優點［16-17］。研究表明施加生物炭能增加漬害脅迫下的小麥（Triticum aestivum L.）株高和主根長［18］，以及番茄（Solanum lycopersicum L.）根長和干物質積累［19-20］，也能增加干旱脅迫下紫花苜蓿地上生物量［21］。盡管如此，關于施加生物炭對漬水條件下紫花苜蓿的生長及抗氧化酶系統的影響目前仍不清楚，這不利于紫花苜蓿在我國南方濕熱地區的種植與推廣。

綜上所述，本研究以紫色土為基質，紫花苜蓿為研究對象，通過漬水和生物炭添加處理，利用盆栽實驗，研究紫花苜蓿幼苗生長和抗氧化酶活性對漬水與生物炭添加的響應，為改善紫色土區植被恢復和南方濕熱地區紫花苜蓿的管理提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生物炭購自河南眾信藍天環保裝備有限公司，以雞糞為原料，以氮氣作為保護氣體在抽屜式炭化爐中500℃燒制而成。生物炭的基本化學性質如下：有機碳含量314.73 g·kg-1，氮含量36.91 g·kg-1，磷含量28.66 g·kg-1，pH值為10.24。紫花苜蓿種子購自西安千沃草業科技有限公司。紫色土取自衡陽常寧市蘭江鄉低山丘陵坡地的棄耕地（26°24′0.82″ N，112°18′47.09″ E，海拔約90 m），該地區屬亞熱帶季風性濕潤氣候，四季分明，雨量充沛，近3年生長季4—10月的月平均高溫為30.1℃，月平均低溫為21.3℃。土壤樣品于2022年4月上旬采集，深度為0～20 cm，采集后帶回實驗室過5 mm篩，去除碎屑和巖石后混勻備用。土壤基本理化性質：土壤有機質含量為（5.28±0.85） g·kg-1，全氮含量為（0.38±0.12） g·kg-1，全磷含量為（0.11±0.03） g·kg-1，pH值為7.64。

1.2 試驗設計與方法

本研究共設置4個處理，分別為：對照（CK），漬水處理（W），添加生物炭（0.5%，B）。漬水并添加生物炭（0.5%，WB）。每個處理4個重復。對照組土壤含水量為最大田間持水量的70％，漬水處理土壤含水量為最大田間持水量的115%，處理均在間苗后統一進行。

盆栽實驗開始于2022年4月中旬，在湖南科技大學生物園溫室內進行，室內溫度設定為25℃，自然光照。每個花盆（3.78 L，口徑15 cm×高度14 cm）裝入的土壤質量約為1.00 kg（干重），選取大小一致、顆粒飽滿、無病蟲害的苜蓿種子均勻地播種于花盆中，覆土1 cm，每盆30粒種子，共16盆。每2～3天澆水（去離子水）1次，待幼苗至3葉期進行間苗。間苗后每盆保留長勢相同的幼苗6株，按照實驗設計進行生物炭添加和漬水實驗處理。生物炭添加組每盆添加0.5%（w/w）的生物炭，即將土倒出裝入封口袋中與生物炭充分混合后放回盆中；漬水處理和對照處理也均將土倒出裝入封口袋中再次混勻放回盆中，但不添加生物炭。間苗后土壤水分含量均采用稱重法進行調節。在實驗處理后的第14天（14 d），21天（21 d），56天（56 d），63天（63 d）和84天（84 d）分別測定其株高和植物葉片的過氧化氫酶（CAT）與過氧化物酶（POD）活性，實驗結束時進行破壞取樣測定植物的根莖長、根莖鮮重和干重。

1.3 測定指標

1.3.1 抗氧化酶活性的測定 每次試驗時，于當天上午挑取植株中上部長勢相近的葉片取下迅速裝進密封袋中，采用高錳酸鉀滴定法測定其過氧化氫酶（CAT）活力，愈創木酚法測定其過氧化物酶（POD）活力。具體操作步驟見李合生［22］的方法。

1.3.2 生長指標的測定 株高測定：以植株近地端為測量起點，植株嫩葉分支末端為終點，用直尺測量株高。

實驗結束后，收集每個盆栽處理中的植株。洗凈植株根部泥土，用濾紙吸水干燥。用直尺測量根長（主根長度）、莖長（苜蓿植株最高分枝的地上部分高度）、植株全長；使用分析天平稱量鮮重，再將植株的根部和地上部分分開，分別稱量根鮮重和莖鮮重；將每盆植株地上地下部分樣品用信封袋封裝于烘箱中130℃殺青30分鐘后于65℃烘干至恒重，再分別稱量根干重、地上部分干重和總重；通過干重和鮮重計算植株含水率。

1.4 數據統計及分析

實驗數據用Excel 2019記錄整理，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗處理對相同時間植物同種酶活力、株高以及實驗結束后植株根長、莖長、根莖比、含水率和地上地下部分干重的影響，并使用LSD進行多重比較；使用兩因素重復測量方差分析（Two-way repeated-measures ANOVA）比較時間、漬水和生物炭處理對苜蓿株高及酶活性的影響；使用兩因素方差分析（Two-way ANOVAs）檢驗漬水和生物炭對紫花苜蓿植株根長、莖長、根莖比、根干重、地上部分干重、總重、根冠比和含水率的影響。數據分析使用SPSS 17.0完成，作圖用GraphPad Prism 8.0。

2 結果與分析

2.1 漬水和生物炭添加下紫花苜蓿株高的變化

重復測量方差分析表明，漬水（W）對紫花苜蓿株高無顯著影響；生物炭處理（B）顯著增加了紫花苜蓿的株高（Plt;0.05）；漬水和生物炭處理之間交互作用對紫花苜蓿株高無顯著影響。單因素方差分析結果顯示，從14 d到84 d，B組株高比CK組分別高57.3%，61.6%，40.0%，21.7%；WB組株高比W組分別高69.4%，1.3%，36.3%，33.8%（圖1）。

2.2 漬水和生物炭添加下紫花苜蓿抗氧化酶活性的變化

重復測量方差分析表明，漬水處理（W）對紫花苜蓿抗氧化酶（POD和CAT）活性影響不顯著；生物炭處理（B）顯著改變抗氧化酶POD和CAT的活性（Plt;0.01）；漬水處理（W）和生物炭處理（B）之間交互作用對紫花苜蓿抗氧化酶活性無顯著影響。

對相同時間各處理POD酶活性的單因素方差分析結果顯示，在第14 d時，B組與CK組有顯著差異，B組下降46.9%；WB組顯著低于W組，WB組下降55.6%；WB組與B組無顯著差異。14 d以后，相同時間各組之間POD酶活性均無顯著差異。相較于POD酶活性，CAT酶活性受生物炭影響時間更長，在多個時間段表現為顯著降低（Plt;0.05），且在早期（21 d）降低效果最為顯著（Plt;0.01）。第21 d和56 d的CAT酶活性，B組與CK組差異顯著，它們分別比CK組低29.3%和23.2%，而W組與CK組無顯著差異；WB與B組比無顯著差異，但WB組比W組顯著低37.3%和19.4%；第84 d的CAT酶活性，與W組相比，WB組顯著降低了36.1%（圖2A，2B）。

2.3 漬水和生物炭添加下紫花苜蓿生物量的變化

兩因素方差分析表明（表1），漬水處理（W）顯著影響紫花苜蓿莖長和全長（Plt;0.05）；生物炭處理（B）顯著影響紫花苜蓿根莖長度比（Plt;0.05）。紫花苜蓿植株長度的單因素方差分析結果表明（表2），各處理之間植物根長無顯著差異。莖長和全長則表現為漬水并添加生物炭處理（WB）均顯著高于對照（CK） （Plt;0.05），其他處理之間無顯著差異；漬水處理（W）的莖長和全長均值高于對照（CK），漬水并添加生物炭（WB）的莖長和全長均值也稍高于生物炭添加處理（B），但均未達到顯著水平。根莖長度比表現為生物炭添加處理（B）低于對照（CK），漬水并添加生物炭處理（WB）低于漬水處理（W），但各處理之間均無顯著差異（表2）。總之，漬水處理增加紫花苜蓿的莖長和全長，生物炭處理降低植物的根莖長度比。

兩因素方差分析表明（表1），漬水處理（W）對紫花苜蓿生物量和含水率均無顯著影響，生物炭處理（B）顯著影響植物生物量的地上部分干重、總干重和根冠比（Plt;0.01），漬水處理和生物炭處理（W×B）之間交互作用對植物生物量無顯著影響。單因素方差分析結果表明，對于紫花苜蓿根干重，各處理間均無顯著差異。地上部分干重則表現為生物炭添加（B）和漬水并添加生物炭處理（WB）顯著高于對照（CK），且漬水并添加生物炭處理（WB）顯著高于漬水處理（W） （Plt;0.05）。各處理間總生物量干重的差異的格局與地上部分生物量干重差異相同，生物炭添加（B）顯著高于對照（CK），且漬水并添加生物炭處理（WB）顯著高于漬水處理（W） （Plt;0.05）。植物根冠比在處理后相比對照（CK）均有所下降，生物炭添加（B）和漬水并添加生物炭處理（WB）均顯著低于對照（CK） （Plt;0.05）。含水率在各處理間變化不顯著。故生物炭添加顯著增加植物地上部分生物量和總生物量的干重，降低植物根冠比。

3 討論

3.1 漬水和生物炭添加對紫花苜蓿抗氧化酶系統影響

長期漬水環境會使植物根部組織受低氧脅迫，破壞ROS產生與消除之間的動態平衡，引起植物細胞中ROS的大量累積［13］，導致脂質過氧化和甲基乙二醛含量呈增加趨勢，危害植物生長［23］。植物為維持其穩定性常采取提高抗氧化酶活性的適應策略，POD和CAT分別是植物體內清除過氧化物、過氧化氫的抗氧化酶，具有分解過氧化氫、保護酶系統相對穩定和降低活性氧對植物損害的作用，其活性可作為評價植物耐淹性的指標［24］。實驗處理早期，紫花苜蓿POD和CAT酶含量較高，隨后下降，這可能與紫色土較高含量的碳酸鈣有關［25］。有研究報道鈣信使系統參與ROS相關的應激信號傳導，在植物細胞外刺激與細胞內反應偶聯方面發揮著重要作用，一定濃度的外源性鈣會增強植物對ROS敏感性，從而提高抗氧化酶活性［26-27］。過量的過氧化氫被視為一種有害物質，但它也是參與植物生長發育、細胞間信號傳導的一種信號因子，對植物生長有著重要作用［28］。本研究添加生物炭組（B）在實驗早期及添加生物炭組（B）和漬水并添加生物炭組（WB） 在實驗后期其植物CAT活性分別較對照組（CK）和漬水組（W）顯著降低，其原因可能是生物炭添加后紫花苜蓿養分條件得到一定程度的改善，在較好的生長環境下，細胞中ROS含量下降，植株不需要維持高強度的抗氧化酶活性［11］。劉曉涵等［29］發現氯化鈉脅迫下的煙草（Nicotiana tabacum L.）幼苗施加生物炭45天后抗氧化酶活性顯著下降，該結果支持了本研究的結論。有學者認為植物在面對外來非生物脅迫時，POD與CAT酶活性會表現出互補關系［30］，但在本研究中并未觀察到這一現象。本研究中生物炭施加早期紫花苜蓿POD和CAT酶活性都受到抑制，但CAT酶活性恢復更慢，這可能是由于CAT酶活性對生物炭的敏感性高于POD酶活性且受外界脅迫后波動更大［31］。

3.2 漬水和生物炭添加對紫花苜蓿幼苗生長的影響

株高是苜蓿生長發育狀況的直接體現，生物量是衡量植物生長狀況和生產力的重要指標，兩者都是苜蓿推廣需要考慮的重要因素［32］。本研究發現漬水處理（W）對紫花苜蓿株高和生物量的影響較小，表明其具有良好的耐漬性，可見該紫花苜蓿能夠適應南方濕熱地區較長期的漬水環境。本研究發現生物炭添加增加株高，促進生物量累積。這可能與生物炭較高的養分含量有關，一定量的生物炭添加能夠提高土壤中的氮、磷含量，增加土壤速效養分，從而促進植株生長，提高植物生物量［33-34］。Wang等［35］發現生物炭添加能夠提高苜蓿的水分利用率，減少土壤儲水量，增加飼料產量。這與本文中漬水處理下，生物炭添加會顯著提高苜蓿地上部分干重相一致，也表明生物炭可作為漬水環境種植苜蓿的一種土壤改良劑。

根冠比是飼料營養價值評估的的指標之一，較小的根冠比有助于提高經濟效益［36］。本研究發現漬水處理下生物炭添加對紫花苜蓿根長的影響并不顯著，這與漬害條件下施加5％生物炭對番茄根長的影響［20］以及施用生物炭后小麥總根長和總根面積無顯著差異［18］的結果類似。在水分飽和的土壤中植物會降低生物量向地下根系的分配［37］，這與本研究中漬水處理降低苜蓿根莖比和根冠比的結果一致。由此可見，輕度的漬水處理和生物炭添加有利于紫花苜蓿水分和養分獲取，改變苜蓿地上地下生物量的分配格局，使更多的生物量分配到地上部分。由于本研究為室內盆栽實驗，盆內土壤相對淺薄，可能減弱了漬水對土壤透氣性的影響等，與野外環境存在一定差異，因此，結論具有一定的局限性。

4 結論

研究發現，生物炭添加能夠增加紫花苜蓿株高、地上部分生物量和總生物量，降低植物根莖長度比、根冠比和抗氧化酶POD與CAT的活性。漬水處理對紫花苜蓿生物量影響很小，但是增加其莖長和全長。此外，漬水處理下施加生物炭仍能夠增加紫花苜蓿株高和生物量。因此，生物炭可作為南方低山丘陵區紫色土紫花苜蓿栽培及植被恢復的土壤改良劑。本研究為我國南方低山丘陵區紫色土的植被恢復與土地利用提供了參考依據。

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-09-26；修回日期：2023-11-26

基金項目：湖南省自然科學基金（2018 JJ3148）；湖南省教育廳科學研究項目（23A0385，21C0359）；湖南省經濟作物遺傳改良與綜合利用重點實驗室科學基金開放項目（E22117） 資助

作者簡介：周志東（2001-），男，漢族，湖南郴州人，碩士研究生，主要從事植物生態學研究，E-mail：2325553601@qq.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：chenyq2016@163.com