黃連解毒湯調控lncRNA MALAT1減輕小鼠膿腫創面炎性焦亡的實驗研究

林尊友，翁美容，辛廷振，2

（1.福建中醫藥大學附屬福州中醫院，福建 福州 350001；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

創面愈合是影響肛周膿腫疾病轉歸的一個亟需解決的重要問題。鑒于臨床肛周膿腫術后，其創面常暴露于開放環境，且易受排泄物污染，故而常引起術后創面延遲愈合。創面愈合緩慢或不愈合不僅進一步加劇患者感染風險，而且導致患者持續疼痛不適，嚴重影響其日常生活［1-2］。研究表明，在內毒素（lipopolysaccharides，LPS）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎癥因子影響下，尤其在炎癥風暴持續作用下可引起細胞發生炎性焦亡，進而導致創口延遲愈合或不愈合發生［3-5］。因此，改善膿腫創面炎性焦亡狀態是促進肛周膿腫創面愈合的重要途徑［6］。

肛周膿腫所致創面愈合緩慢歸屬中醫學“肛癰”范疇，其核心病機多為機體濕熱蘊結、氣血凝滯堵塞肛門所致，故對其治則宜行清熱利濕、解毒養陰之法［7］。黃連解毒湯具有清熱利濕、解毒養陰之效，該方治療肛周膿腫及促進術后創面愈合具有良效［8］。lncRNA 肺腺癌轉移相關轉錄本（MALAT1）在創面愈合中發揮了關鍵調控作用［9］。研究證實，MALAT1可通過調節miR-378a/FGF2軸促進皮膚創面愈合［10］。另有研究表明，lncRNA MALAT1 與炎性焦亡存在密切聯系［11-12］。但黃連解毒湯是否通過調控lncRNA MALAT1，改善小鼠膿腫創面炎性焦亡的作用機制尚需進一步探討。

1 材 料

1.1實驗動物與藥物 48 只C57BL/6 雄性小鼠（SPF 級），由斯萊克（上海）實驗動物有限責任公司提供［實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005］；實驗動物常規飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心［使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007］，提供實驗過程及方法均符合福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求（審批號：FJTCM IACUC 202305T）；雷夫諾爾（廣東恒健制藥有限公司，批號：221205）；黃連解毒湯購于福建中醫藥大學附屬福州中醫院中藥房，方中黃連、黃芩、黃柏、梔子參照2020 版《中華人民共和國藥典》藥物配比（9∶6∶6∶9）制成水煎液，濃縮至質量濃度為1 g/mL，低溫下保存備用。

1.2實驗試劑 NLRP3（武漢Proteintech 公司，貨號：00090163）、Caspase-1（武漢Proteintech 公司，貨號：00092065）、IL-1β（武漢Proteintech 公司，貨號：00121535）、IL-18（武漢Proteintech 公司，貨號：00086146）、GAPDH（武漢Proteintech 公司，貨號：10029187）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號：71642J2）；lncRNA MALAT1（5'：GGCACTGAAGGCT TAATGTAGG，3'：AAGGTGTTACGGTAGGGTAGTC）、GAPDH（5'：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，3'：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）（福州尚亞生物技術有限公司）。

1.3實驗儀器 電泳儀（美國Bio-RAD 公司）；凝膠成像系統（GELDOC 2000 型，美國Bio-RAD 公司）；DNA 擴增儀（9600 型，美國PE 公司）；低溫高速離心機（64R型，美國Beckman公司）等。

2 方 法

2.1動物分組、造模及干預 將48 只C57BL/6 雄性小鼠經適應性喂養1 周后，采用隨機數字表法分為空白組12 只、造模小鼠36 只。造模小鼠予以皮膚開窗＋污染物覆蓋的改良小鼠膿腫創面模型法制備模型［13］，造模成功后再采用隨機數字表法分為模型組、中藥組和對照組各12 只。空白組小鼠進行常規飼養，模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃，中藥組先采用0.1%雷夫諾爾沖洗創面，1 次/d換藥，再給予5 g/kg黃連解毒湯水煎液灌胃給藥［14］；對照組小鼠采用0.1%雷夫諾爾沖洗創面，1 次/d 換藥，再給予等體積生理鹽水灌胃；灌胃劑量依據小鼠體質量調整，干預共2 周。干預結束后，經5%異氟醚吸入麻醉下處死各組小鼠，分離與收集小鼠膿腫創面皮膚組織。

2.2組織取材 末次灌胃后，各組小鼠經5 %異氟醚麻醉處死。分離與收集其小鼠膿腫創面組織，置于超低溫環境下凍存。

2.3觀察指標

2.3.1HE 染色觀察膿腫創面組織形態變化 取C57BL/6小鼠膿腫創面組織，置卡諾液中固定45 min，石蠟包埋、切片，行常規HE 染色，觀察各組膿腫創面組織形態變化。

2.3.2小鼠膿腫創面組織中lncRNA MALAT1 水平情況 采用TriZol 法提取各組小鼠皮膚創面組織中總RNA，進行反轉錄及PCR，待反應完畢，確認Realtime PCR 擴增曲線和溶解曲線，分析結果。觀察黃連解毒湯對小鼠膿腫創面組織中lncRNA MALAT1水平影響。

2.3.3小鼠皮膚創面組織中與炎性焦亡相關蛋白含量表達情況 提取小鼠膿腫創面組織總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量，制膠（12%分離膠與5%濃縮膠）后，進行上樣、電泳，依次進行轉膜，封閉，置于NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 一抗中充分反應，孵育二抗后進行顯影成像，分析結果。

2.4統計學方法 采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料若符合正態分布采用（±s）表示，采用方差分析進行組間比較，如果方差齊，兩兩比較選用LSD-t法；如果方差不齊，兩兩比較則選用Games-Howell法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結 果

3.1實驗動物情況 本次實驗過程各組小鼠均未出現意外死亡。

3.2HE 染色結果 與空白組比較，模型組肉芽組織新生毛細血管減少，周圍有大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，中藥組、對照組新生毛細血管增多；與對照組比較，中藥組炎性細胞浸潤程度減輕，成纖維細胞數量增多。見圖1。

圖1 HE 染色結果（×200）

3.34 組皮膚創面組織中lncRNA MALAT1 水平情況結果 qPCR 結果顯示：與空白組比較，模型組lncRNA MALAT1 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和對照組lncRNA MALAT1 水平顯著增高（P＜0.05）；與對照組比較，中藥組lncRNA MALAT1水平顯著增高（P＜0.05）。見表1。

表1 4組膿腫創面組織中lncRNA MALAT1水平比較（±s）

表1 4組膿腫創面組織中lncRNA MALAT1水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與對照組比較，3） P＜0.05。

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3.44 組膿腫創面組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達比較 與空白組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和對照組的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的蛋白含量表達顯著降低（P＜0.05）；與對照組比較，中藥組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白含量表達顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 4 組膿腫創面組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達比較（±s）

表2 4 組膿腫創面組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白含量表達比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與對照組比較，3） P＜0.05。

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圖2 4 組膿腫創面組織中相關蛋白條帶圖

4 討 論

一般而言，肛周膿腫創傷愈合需要經歷凝血及炎癥、肉芽組織形成、再上皮化、創面收縮等過程［15］。創面組織、細胞的炎癥狀態與分化功能的強弱，對創面愈合具有重要影響［16-17］。焦亡作為一種炎性程序性細胞死亡方式，通常由炎性小體NLRP3 引發。細胞發生炎性焦亡的過程主要由Caspase-1 介導的傳統信號通路介導，焦亡發生后會促使IL-1β 和IL-18 的前體加工裂解，轉變成為成熟的活性形式，進一步加劇創面的炎癥反應，導致創面延遲愈合［18-19］。

lncRNA MALAT1在促進傷口愈合過程中發揮了重要作用［20］。研究證實，敲低MALAT1 顯著抑制人成纖維細胞（HFF-1）的增殖、遷移和基質蛋白的表達，進而抑制傷口愈合［21］。過表達MALAT1 可提高DFU 成纖維細胞的活力，抑制其凋亡和焦亡［22］。本研究結果顯示，在小鼠膿腫創面組織中，MALAT1水平較空白組顯著降低，與相關研究報道一致［23］。

黃連解毒湯源自唐代《外臺秘要》，由黃芩、黃連、黃柏、梔子4 味中藥組方，方中黃連為君藥，發揮清瀉心和中焦火之效，黃芩性寒味苦，可清上焦之火為臣藥；佐以黃柏可瀉下焦之火；梔子為使藥，可通瀉三焦［24］。課題組前期臨床研究亦發現，黃連解毒湯可顯著降低肛周膿腫手術患者炎性因子水平，改善創口腫脹狀態，促進創口愈合［25］。本實驗形態學染色結果證實，經黃連解毒湯干預后，膿腫創面組織處的新生毛細血管、成纖維細胞數量明顯增多，炎性細胞浸潤程度顯著降低。此外，與模型組比較，中藥組和對照組的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的蛋白含量表達顯著降低，lncRNA MALAT1 水平顯著增高，而中藥組療效顯著優于對照組（P＜0.05）。進一步驗證了黃連解毒湯可通過抑制炎性焦亡，促進膿腫創面愈合的作用。

綜上表明，黃連解毒湯可有效減輕膿腫創面組織處的炎性焦亡，其作用機制與調控lncRNA MALAT1 與NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達密切相關。同時，本研究仍具有一定的局限性，如黃連解毒湯是否調控lncRNA MALAT1 與關聯miRNA構建的ceRNA 發揮作用的確切機制仍需深入研究。