枸杞多糖抗衰老的研究進(jìn)展

李毛毛 李潔華

細(xì)胞衰老是以永久性增殖停滯為顯著特點的細(xì)胞應(yīng)答[1],伴有細(xì)胞表型的改變,包括染色質(zhì)重塑、促炎因子分泌、自噬受損、代謝重編程[2-4]。衰老和心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、DM等與年齡相關(guān)的健康問題密切相關(guān)。細(xì)胞衰老發(fā)生在自發(fā)性內(nèi)源性應(yīng)激和外源性應(yīng)激下,包括癌基因激活和端?？s短(復(fù)制性耗竭)、持續(xù)的DNA損傷[5],其中DNA損傷是引起衰老最重要的因素[6]。

枸杞是一種干燥成熟的寧夏特產(chǎn)植物,屬于茄科,廣泛分布于歐亞大陸、非洲、北美洲和南美洲的干旱至半干旱環(huán)境中,具有豐富的藥用和食用功能[7]。枸杞富含多種功效成分,包含枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)、生物堿、枸杞色素、黃酮、氨基酸等[8]。枸杞的主要功能成分是多糖,具體來說就是LBP[9],它具有抗衰老、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、生殖保護(hù)和細(xì)胞保護(hù)活性[10]。近年來,LBP在抗衰老方面的作用愈加受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,眾多研究深入探討了LBP延緩衰老進(jìn)展的分子機(jī)制。本文系統(tǒng)地介紹了枸杞中可以延緩衰老的活性成分LBP,以期在臨床與預(yù)防保健中更好地應(yīng)用LBP。

1 LBP的組成及提取

1.1 LBP的組成 多糖是一種高分子化合物,它由多個單糖分子連接而成,并廣泛存在于動物細(xì)胞膜和植物細(xì)胞壁中。多糖作為高分子物質(zhì),其生物活性受到單糖組成和空間結(jié)構(gòu)等因素的影響[11]。LBP成分復(fù)雜,高達(dá)95%的LBP由聚糖組成,包括葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖以及巖藻糖[12]。

1.2 LBP提取方法 多糖的結(jié)構(gòu)、分子及理化性質(zhì)會因萃取方法的不同而不同,所得到不同萃取物的生物活性也不盡相同,LBP有著兩類提取方法:第一種是較為傳統(tǒng)的提取方法,包括經(jīng)典熱水萃取法(hot water extraction,HWE)、酸堿溶液萃取法、酒精萃取、發(fā)酵萃取、酶解萃取;第二種是較為新型的萃取方法,包括微波輔助萃取法、超聲輔助萃取和加壓液體萃取[13]。HWE操作的簡易性和低成本使其成為常用的多糖提取方法,然而,在提取過程中,過高的溫度可能會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)受損,影響其功能效用。發(fā)酵萃取設(shè)備簡單,操作安全方便,不產(chǎn)生有毒廢物,且其提取多糖的條件溫和、高效、可持續(xù)。酶解萃取需要維持酶的最佳活性,在最佳溫度及最適宜pH下進(jìn)行反應(yīng)。與HWE法提取多糖相比,新型萃取方法能夠提高提取效率、縮短提取時間、減少溶劑的消耗,增加多糖產(chǎn)出率[14-16]。

2 LBP抗衰老機(jī)制

2.1 LBP通過減少內(nèi)源性、外源性氧化DNA損傷來延緩衰老 DNA損傷可以分為兩種:一種是由于生物體內(nèi)部的自發(fā)性因素,例如活性氧(reactive oxygen species,ROS)和細(xì)胞代謝副產(chǎn)物等引起的內(nèi)源性損傷;另一種是由外界環(huán)境如電離輻射、紫外線、致突變化學(xué)物質(zhì)引起的外源性損傷[17-18]。細(xì)胞中ROS的主要來源之一為線粒體產(chǎn)生的大量氧自由基[19]。細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致ROS產(chǎn)生[20],ROS超過一定量會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化失衡,從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加和進(jìn)一步的DNA損傷[21]。ROS水平可通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性來消除,ROS過多時機(jī)體自身通過分泌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化因子對抗氧化應(yīng)激,維持氧化和抗氧化之間的平衡狀態(tài)。

核因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)是一種關(guān)鍵的氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子,HO-1是其下游基因。在生理條件下,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與抑制劑環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)結(jié)合。然而,當(dāng)細(xì)胞受損時,Nrf2會與Keap1解離并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,從而觸發(fā)下游HO-1表達(dá)。實驗表明,LBP可通過Nrf2/HO-1通路緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,表現(xiàn)為LBP提前處理可顯著降低ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平,有效地將顯著降低的抗氧化酶SOD和CAT的活性恢復(fù)到正常水平,使細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化之間達(dá)到平衡,最終緩解氧化應(yīng)激,進(jìn)而延緩衰老[22-23]。

2.2 LBP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡延緩衰老 激酶級聯(lián)包括磷酸肌苷3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。PI3K/Akt/mTOR信號通路是參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、遷移、代謝、增殖和存活的核心級聯(lián),與細(xì)胞凋亡和自噬密切相關(guān)。該信號通路在激活時可以減弱自噬,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞周期。必需的凋亡相關(guān)蛋白包括裂解的Caspase-3、Caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)。實驗表明,LBP可下調(diào)裂解Caspase-3/Caspase-3、LC3II/LC3I、Beclin-1,上調(diào)Bcl-2/Bax和p62表達(dá),磷酸化PI3Ks、Akt和mTOR,減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量[24]。

Bcl-2和bax是與凋亡密切相關(guān)的基因。Bcl-2是抑制凋亡的基因,bax是促進(jìn)凋亡的基因。Bax過度表達(dá)導(dǎo)致bax/bax同源二聚體的形成,從而促進(jìn)細(xì)胞死亡。Bcl-2過表達(dá)導(dǎo)致Bcl-2/bax異二聚體的形成,進(jìn)而防止細(xì)胞死亡。因此,Bcl-2/bax比值決定了細(xì)胞是否接收到誘導(dǎo)凋亡的信號。實驗表明,與H2O2一起孵育導(dǎo)致ARPE-19細(xì)胞中Bcl-2陽性表達(dá)顯著降低,bax陽性表達(dá)升高,Bcl-2/bax比值顯著降低,提示細(xì)胞凋亡增加。然而,在與H2O2孵育之前先用LBP處理H2O2,通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)bax的表達(dá),可顯著提高Bcl-2/bax的比值,表明LBP可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/bax的表達(dá)水平,進(jìn)而控制細(xì)胞凋亡,延緩衰老[25]。

p53參與DNA修復(fù)、代謝途徑控制和細(xì)胞衰老,其主要功能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯[26]。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,可阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程并參與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)[27]。當(dāng)DNA損傷導(dǎo)致的雙鏈斷裂未完全修復(fù)時,共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變激酶(ataxia telangiectasia-mutated,ATM)與ATM和Rad3相關(guān)激酶(ATM-and rads-related,ATR)的激活觸發(fā)p53的磷酸化,p53的磷酸化形式調(diào)節(jié)p21誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯,隨后觸發(fā)細(xì)胞衰老或凋亡。實驗表明,LBP通過抑制斑馬魚發(fā)育早期細(xì)胞死亡和凋亡,降低p53、p21和Bax基因的表達(dá)水平,增加Mdm2和TERT基因的表達(dá),緩解斑馬魚衰老[28]。

2.3 LBP通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬來延緩衰老 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊和加工的主要場所,當(dāng)細(xì)胞受到干擾因素的刺激時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)將被激活以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能[29]。但過度刺激會誘導(dǎo)凋亡轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達(dá)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡。自噬是指所有類型的細(xì)胞內(nèi)成分的溶酶體降解和再循環(huán),它是一種高度選擇性的細(xì)胞清除途徑,與維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)有關(guān)[30]。自噬是細(xì)胞自我保護(hù)的一種機(jī)制,但大量證據(jù)也表明,自噬可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)細(xì)胞毒性[31]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是最大的Ca2+貯存細(xì)胞器,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+不平衡,LBP可改善細(xì)胞內(nèi)Ca2+的失衡。實驗表明,LBP一方面顯著抑制PM2.5觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS的增加,恢復(fù)SOD的活性,并降低細(xì)胞內(nèi)MDA水平;另一方面LBP可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-CHOP凋亡信號,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),降低GRP78和CHOP的表達(dá),減少PM2.5誘導(dǎo)的自噬標(biāo)志蛋白LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化,使PM2.5誘導(dǎo)的自噬體水平、細(xì)胞凋亡和毒性顯著降低,進(jìn)而延緩衰老[32]。

2.4 LBP的其他抗衰老機(jī)制 慢性炎癥會通過分泌細(xì)胞因子,促進(jìn)炎癥、重塑細(xì)胞外基質(zhì)和不利地改變非衰老細(xì)胞的行為,加劇氧化損傷,誘導(dǎo)ROS、H2O2和羥基自由基的產(chǎn)生,加劇DNA損傷,加速衰老和相關(guān)疾病的發(fā)生[33]。LBP可以通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)水平,減少促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生來抑制炎癥因子的釋放,延緩衰老[34]。從LBP中進(jìn)一步提純可得到枸杞糖肽(lycium barbarum glycopeptide,LbGp),實驗表明,LbGp 促進(jìn)了FADS1和FADS2(FADS1、FADS2 是 二十二碳六烯酸產(chǎn)生的關(guān)鍵酶)的高mRNA表達(dá),誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌二十二碳六烯酸,抑制 MAPK-NF-κB/焦亡相關(guān)通路,進(jìn)而使得p-p-65、細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1p45、Gasdermin D、GSDMD-N(裂解的Gasdermin D,一種細(xì)胞焦亡的執(zhí)行因子)、NOD樣受體蛋白-3(NOD-like receptor protein-3,NLRP3)、IL-1β以及IL-18蛋白表達(dá)降低,延緩衰老[35]。

轉(zhuǎn)錄因子DAF-16是人叉頭盒O(forkhead box protein,OFOXO)的同源物,是胰島素/胰島素樣生長因子(IGF-1)信號通路(insulin/IGF-1 signaling pathway,IIS)下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子,是氧化應(yīng)激和衰老過程的主要下游調(diào)節(jié)因子之一,通過IIS影響秀麗隱桿線蟲的衰老速度。實驗表明,LbGp 可使DAF-16 靶基因(ctl-1、ctl-2、sod-2和sod-3)的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。LbGp延緩衰老進(jìn)展的作用通過調(diào)節(jié)IIS和生殖信號通路介導(dǎo),進(jìn)而激活應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子DAF-16、熱休克因子-1(heat shock factor,HSF-1)、熱休克蛋白-16.2(heat shock protein-16.2,hsp-16.2)和SKN-1以及核受體DAF-12,從而觸發(fā)下游長壽相關(guān)靶基因的表達(dá)以延長壽命[36-37]。

3 總結(jié)與展望

衰老是一個持續(xù)性的過程,發(fā)生在所有生命形式中。由于衰老細(xì)胞影響各種生理和病理過程,包括癌癥和與年齡相關(guān)的疾病,積極探索抗衰老療法具有重要意義。LBP作為傳統(tǒng)中藥枸杞的提取物,其主要通過以下機(jī)制延緩衰老:(1)通過增加抗氧化酶的表達(dá),實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化的平衡,緩解ROS的過量產(chǎn)生,減少內(nèi)源性DNA損傷,防止細(xì)胞周期停滯,改善衰老進(jìn)程;(2)通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá),減少凋亡細(xì)胞數(shù)量,控制衰老進(jìn)程;(3)通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+水平和減少自噬來改善細(xì)胞衰老;(4)通過減少促炎因子的釋放來調(diào)控衰老進(jìn)展。本綜述中的大多數(shù)研究僅評估了模式生物(如秀麗隱桿線蟲、斑馬魚、小鼠)的壽命、抗氧化酶、炎癥因子和衰老標(biāo)志物水平。它們雖然在一定程度上與人類衰老狀態(tài)相似,但不能完全復(fù)制LBP在人類體內(nèi)抗衰老的作用方式。因此,為更好地將LBP應(yīng)用于臨床及預(yù)防保健中,仍需要大量體內(nèi)外實驗以及臨床試驗。體內(nèi)研究不僅將證實衰老的相關(guān)生理,而且還將深入了解衰老是由誘導(dǎo)因子和靶細(xì)胞之間的相互作用直接誘導(dǎo)的,還是由其他細(xì)胞類型(例如巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)間接介導(dǎo)的。此外,對LBP延緩衰老進(jìn)展機(jī)制的研究也局限于相關(guān)途徑、相關(guān)蛋白水平的變化,對其在衰老分子機(jī)制中的作用尚不明確。隨著分離提取技術(shù)的逐漸進(jìn)步,LBP又可進(jìn)一步提純出其他物質(zhì),關(guān)于這些物質(zhì)的功效及作用機(jī)制目前研究較少。未來隨著新技術(shù)的逐漸發(fā)展,關(guān)于LBP的研究將會進(jìn)入新的階段,其延緩衰老的作用機(jī)制也會更清晰明了,由此會探索出LBP更全面、系統(tǒng)地應(yīng)用于延緩衰老進(jìn)程、預(yù)防保健和改善年齡相關(guān)疾病進(jìn)展中的具體方法,進(jìn)而達(dá)到延長壽命、改善年齡相關(guān)疾病病人生存狀態(tài)的目的。