瓜石湯聯合當歸芍藥散對多囊卵巢綜合征合并胰島素抵抗小鼠的影響

鄭鳳雀 林佳靜 劉 欣 楊煒煒 陳賽瓊 蘇汝旺 何 萍 李晶晶

(1 廣西醫科大學第四附屬醫院婦科,柳州,545007; 2 柳州市人民醫院檢驗醫學科,柳州,545026; 3 柳州市婦幼保健院婦科,柳州,545001)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是常見的一種婦科內分泌疾病,在育齡期女性中發病率為6%～10%[1],常表現為月經周期不規律、排卵障礙、高雄激素血癥、胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)等癥狀[2]。PCOS發病機制尚未明確,研究表明44%～70%的PCOS患者合并IR,以IR為中心的代謝紊亂是PCOS患者重要的病理生理改變[3]。POCS與輕度慢性炎癥密切相關,并且這種慢性炎癥狀態因合并IR而加重[4]。瓜石湯出自劉奉五先生的經典藥方,在治療月經病中有豐富的臨床經驗,在PCOS中也有較多報道。瓜石湯可調節卵巢激素水平,提高PCOS不孕患者的妊娠率[5]。當歸芍藥散在婦科炎癥治療中得到廣泛應用,其通過下調炎癥蛋白表達水平來改善內膜炎癥[6]。目前暫無瓜石湯合當歸芍藥散治療PCOS-IR的報道。本研究利用來曲唑聯合高脂飲食構建PCOS-IR小鼠模型,并探討瓜石湯合當歸芍藥散對小鼠性激素及內膜炎癥介質的影響,旨在為臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級C57BL/6L雌性小鼠50只,體質量20～25 g,8周齡,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(SCXK(湘)2019-0004),飼養于22 ℃恒溫條件下,06：00-20：00為光照周期持續約14 h,黑暗10 h,給予充足潔凈飼料和飲水。該研究動物實驗經過廣西醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會審批(倫理審批號：202207001)。

1.1.2 藥物 瓜石湯合當歸芍藥散由瓜蔞15 g(批號：P220873)、石斛12 g(批號：P221108)、玄參10 g(批號：P220884)、麥冬10 g(批號：P220043)、生地黃12 g(批號：P220193)、瞿麥12 g(批號：P220313)、車前子10 g(批號：P220702)、益母草12 g(P221050)、黃連3 g(批號：P220373)、牛膝12 g(批號：P220701)、當歸10 g(批號：P224001)、川芎6 g批號：P221583)、赤芍12 g(批號：220801)、茯苓20 g(批號：P220602)、澤瀉12 g(批號：P220106)、蒼術6 g(批號：P221466)、白術12 g(批號：P221943)組成,均購自廣西仙茱中藥有限公司;來曲唑片(規格：2.5 mg/片,江蘇恒瑞醫藥股份有限公司,批號：H19991001)。

1.1.3 試劑與儀器 小鼠卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、睪酮(Testosterone,T)、胰島素酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號：E-EL-M0511c、E-EL-M3053c、E-OSEL-M0003、E-EL-M1382c)、小鼠白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α;TNF-α)ELISA試劑盒(武漢三鷹生物技術有限公司,批號：KE10003、KE10007、KE10002);TRIzol(Invitrogen,美國,批號：15596026)、逆轉錄試劑盒(ThermoFisher,美國,批號K1682)、SYBRGreen Mix(ThermoFisher,美國,批號A25742);酶標儀(ThermoFisher,美國,型號：FC)、實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-qPCR)儀(ABI,美國,型號：7500)、倒置顯微鏡(Nikon,日本,型號：TS-10F)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照簡單隨機化原則,通過隨機數字表將小鼠隨機抽取編號,按1∶3的比例隨機分為對照組(13只)和造模小鼠(37只),對照組給予普通飼料喂養,不予以任何藥物干預。

1.2.2 給藥方法 模型組小鼠每天給予來曲唑1 mg/kg溶于1 mL1%的羧甲基纖維素鈉灌胃,同時給予高脂飼料(基礎飼料59.50%,豬油10%,蛋黃粉10%,蔗糖20%,膽酸鈉0.50%)喂養。每天給藥1次,連續給藥21 d。造模第15天開始通過陰道涂片(瑞氏染色)觀察小鼠動情周期連續10 d,動情周期紊亂為PCOS模型成功。造模21 d后分別取5只對照組及模型組小鼠,眼眶取血后處死,采用血糖儀測小鼠空腹血糖,2 500 r/min離心時間15 min,離心半徑10 cm,收集血清,采用ELISA法,按照試劑盒說明書操作測定血清空腹胰島素的水平。計算穩態模型胰島素抵抗指數(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。HOMA-IR>2.69提示IR模型成功。隨機挑選8只造模組小鼠作為模型組,8只作為中藥組。中藥組每天給予瓜石湯合當歸芍藥散10 mL/kg,對照組和模型組小鼠給予等體積的純凈水,連續給藥21 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 性激素測定 給藥21 d后,在動情間期,異氟烷麻醉小鼠,眼眶取血后處死,2 500 r/min,離心半徑10 cm,離心時間15 min,收集血清,-80 ℃保存;采用ELISA法,按照試劑盒說明書操作測定FSH、LH、T的水平。

1.2.3.2 內膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的測定 采取ELISA法測定組織上清液的炎癥介質。取下小鼠子宮,用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)沖洗組織以去除殘留的血液,剝離子宮內膜組織,稱取50 mg的組織,其余組織放入液氮保存,按組織重量(mg)：體積(μL)=1∶9的比例加入9倍體積的PBS,用組織勻漿器勻漿組織,3 000 r/min,離心半徑10 cm,離心時間10 min,收集組織上清,采用ELISA法,按照試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.2.3.3 內膜組織TNF-α、IL-1β、IL6 mRNA的測定 取上述液氮保存的小鼠子宮約20 mg,采用Trizol裂解法提取組織總RNA,用分光光度計評估RNA的質量和總量。按照逆轉錄試劑盒說明書分別去除DNA及逆轉錄。采用SYBR Green法進行RT-qPCR。GAPDH作為內參。引物見表1。

表1 小鼠炎癥介質和內參的引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析,計量資料采用均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析檢驗。以P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCOS-IR模型成功的判斷

2.1.1 動情周期 造模第15天開始通過陰道涂片觀察小鼠動情周期,對照組動情周期存在,動情前期以大量有核細胞為主,可見少量角化細胞,動情期以大量角化上皮細胞為主,少量有核細胞,動情后期可見角化上皮細胞、少量白細胞和有核細胞,動情間期以大量白細胞為主;模型組動情周期消失,大部分處于動情間期,提示PCOS模型成功。見圖1。

圖1 對照組和模型小鼠動情周期(瑞氏染色,×200)

2.1.2 空腹血糖、空腹胰島素水平 造模21 d后對照組小鼠空腹血糖為(4.52±0.45)mmol/L,空腹胰島素為(7.12±2.11) mIU/L,模型組空腹血糖為(7.24±1.68)mmol/L,空腹胰島素為(39.65±6.27) mIU/L,對照組HOMA-IR均<2.69,而模型組均高于2.69,提示IR模型成功。

2.2 各組小鼠干預后性激素水平的變化 干預21 d后,3組小鼠FSH水平差異無統計學意義(P=0.666)。模型組LH、T、LH/FSH水平高于對照組,而中藥組LH、T、LH/FSH水平低于模型組(P=0.000)。見圖2。

圖2 小鼠血清性激素水平

2.3 各組小鼠干預后TNF-α、IL-1β、IL-6的表達 干預21 d后,RT-qPCR結果顯示模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平高于對照組,而中藥組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平低于模型組;模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平高于對照組,而中藥組TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平低于模型組。見圖3。

圖3 小鼠內膜組織TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平

3 討論

PCOS是一種以促性腺激素分泌異常為特征的疾病,包括FSH、LH以及卵巢類固醇激素分泌增加,并且與胰島素抵抗有關。胰島素刺激雄激素合成,增加LH作用[7]。IR和高雄激素血癥的治療改善了激素、代謝和生殖功能。PCOS的發病機制尚未明確,明確其發病機制,尋找個體化治療方案對該疾病診治有重要意義。本研究成功構建PCOS-IR小鼠模型并給予瓜石湯合當歸芍藥散治療,得到了較好的效果。

PCOS與慢性炎癥密切相關。PCOS的常見癥狀如高雄激素血癥、胰島素抵抗、肥胖是引起炎癥反應的因素。肥胖是一個慢性炎癥,其特征是具有較高的炎癥介質、趨化因子和氧化應激標志物水平[8]。雄激素可以刺激前脂肪細胞向脂肪細胞分化,促進肥胖的發展。TNF-α是一種炎癥介質,由顆粒-黃體細胞、卵巢巨噬細胞和免疫細胞分泌。研究發現,TNF-α可能與PCOS的IR和雄激素過量有關,其在肥胖和IR模型中過度表達,干擾胰島素信號轉導,誘導IR[9]。有研究已將PCOS患者血清TNF-α水平變化作為治療效果觀察指標[10],因此探索TNF-α與PCOS之間的聯系對于PCOS的診治具有重要意義。IL-6是由各種細胞產生的內分泌細胞因子,如單核細胞和脂肪組織細胞。有研究顯示IL-6在PCOS女性中較高,并且與體脂百分比增加有直接關系[11-13]。PCOS女性血漿TNF-α和IL-6水平升高反映了一種慢性炎癥,可能是通過降低脂肪細胞中脂聯素的表達,參與了IR的發展[14]。IL-1β是炎癥反應的重要介質,參與細胞增殖、分化和凋亡。CAI等[15]分析了PCOS女性和健康婦女血清,結果顯示,PCOS女性血清IL-1β水平均高于健康對照組。本研究中構建的小鼠PCOS-IR模型的內膜組織TNF-α、IL-6、IL-1β高于對照組小鼠,支持PCOS-IR與炎癥相關這一觀點。

PCOS的治療方式包括如改變生活方式、促排卵、高睪酮治療、胰島素增敏劑、補充肌醇、葉酸和維生素D、輔助生殖技術治療和手術治療[16]。由于藥物的不良反應,對PCOS患者更傾向于使用天然抗氧化劑、抗炎藥調節代謝、高胰島素血癥和高血脂[17]。WANG等[18]的一項Meta分析表明目前沒有足夠的證據證明中西醫結合治療PCOS的療效優于單純西藥治療。中醫、多靶向治療、抗炎、抗氧化藥物以及生活方式的改變可以通過減輕炎癥反應使PCOS女性受益[19]。中藥通過促甾體激素反應來表達雌激素受體蛋白,從而減少雄激素和增加葡萄糖攝取,改善PCOS患者的癥狀。瓜石湯作為一個經典藥方,有滋補腎陰及清熱活血功效。其能夠調節月經、穩定體內性激素水平、改善子宮和卵巢的血液循環,從而調節生殖內分泌。除此之外,還具有抗炎、抑菌功效。研究發現瓜石湯可改善非肥胖型PCOS患者LH、T、LH/FSH比值等指標[20]。另一項研究發現瓜石湯可降低血清LH、T、LH/FSH比值及胰島素水平,并且體質量及體質量指數有下降趨勢[21]。當歸芍藥散有補血活血、清熱解毒、消腫排膿、健脾祛濕功效,在改善婦科炎癥方面也得到廣泛應用。研究證實當歸芍藥散通過影響大鼠慢性子宮內膜炎模型的炎癥蛋白表達及炎癥通路來改善大鼠子宮內膜炎癥[6,22]。本研究利用瓜石湯聯合當歸芍藥散治療PCOS-IR小鼠,認為瓜石湯聯合當歸芍藥散可降低血清LH、T,通過降低子宮內膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表達來改善子宮內膜炎癥。

綜上所述,本研究認為PCOS-IR與TNF-α、IL-1β、IL-6的升高有關,是一種慢性炎癥性疾病。瓜石湯聯合當歸芍藥散可調節性激素,改善高雄激素血癥,同時可降低子宮內膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表達,改善內膜炎癥狀態。但本研究存在一定的局限性,未進行藥物治療后小鼠生育能力的評估。

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