雅魯藏布江中游拉薩裸裂尻魚環境DNA檢測及生物量評估

李冰 馮秀 朱仁 隋曉云 賈銀濤 陳毅峰

摘要：建立快速和準確的環境DNA（eDNA）檢測方法，可為魚類的長期監測提供便利，為魚類資源保護和管理提供技術支撐。2019年在雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地采集了20種魚和水樣，針對拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）設計Cytb基因的特異性引物和探針，利用微滴式數字PCR（ddPCR）檢測水樣中eDNA拷貝數，并分析其與生物量和豐度之間的相關性。結果顯示，正反向引物及探針序列與其他19種魚之間的平均錯配堿基數分別為6.8、6.9和3.6，且對其基因組DNA進行ddPCR擴增沒有熒光信號。通過對比ddPCR和網捕2種方法，70%樣點中檢測結果相同，剩余30%樣點都是網捕未捕獲但ddPCR檢出的情況。在拉魯濕地和雅魯藏布江干流的樣點中，水樣eDNA拷貝數與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均具有顯著的相關性，拉魯濕地水樣eDNA與二者的相關系數分別為0.987和0.647，雅魯藏布江水樣eDNA與二者的相關系數分別為0.786和0.756，表明eDNA技術是魚類分布和生物量監測的有效方法。eDNA檢測易受到近緣物種和水體理化性質的影響。

關鍵詞：環境DNA；微滴式數字PCR；拉薩裸裂尻魚；物種檢測；雅魯藏布江中游

中圖分類號：Q503? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2024）02-0084-08

環境DNA（eDNA）指從空氣、水、土壤、排泄物、沉積物等環境樣品中提取的DNA（Bohmann et al，2014）。環境DNA技術通過對eDNA進行定性和定量分析，進而獲得eDNA中的生物多樣性信息，已逐漸發展成為魚類多樣性監測的新方法（徐念和常劍波，2016；吳昀晟等，2019；王夢等，2022）。與傳統方法相比，環境DNA技術具有靈敏度高、省時省力、環境友好、對調查對象無損傷、不依賴于分類學專家等優點（邢迎春等，2022）。魚類的eDNA監測主要有2個方面，即通過高通量測序和eDNA宏條形碼（eDNA metabarcoding）對多物種進行檢測，及通過定量PCR對特定物種進行檢測（高天翔等，2018）。高通量測序和eDNA宏條形碼雖然能同時檢測多物種，但由于擴增引物及測序過程的偏差，對單一物種豐度的評估不理想（Balasingham et al，2018）；而定量PCR使用物種特異引物，可對單一目標物種的存在和生物量進行檢測（Doi et al，2015）。

常用的定量PCR包括實時熒光定量PCR（qPCR）和微滴式數字PCR（ddPCR）等，在魚類eDNA研究中均有應用（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；Brys et al，2021；Wang et al，2021）。qPCR技術雖具有快速、簡單、經濟等特點，可用于分析eDNA中目標物種的相對豐度，但需要制作標準曲線，且在目的序列含量低或含有大量其他序列的情況下靈敏度和精確度會受限制（王芮等，2021）；而ddPCR可在沒有參考曲線的情況下提供目標物種DNA的絕對定量，在魚類生物量調查中更具有優勢（Doi et al，2015）。ddPCR是一種定量分析核酸的技術，通過把反應體系分散到10 000～20 000個微滴中，再由PCR擴增和陽性信號讀取，計算得出樣本中DNA最初拷貝數，從而實現對DNA的絕對定量（Hindson et al，2011）。研究表明，與qPCR相比，ddPCR的誤差更小，且更適用于低濃度下的eDNA檢測（Rusch et al，2018）。

拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）裂腹魚亞科（Schizothoracinae）裸裂尻魚屬（Schizopygopsis）（陳毅峰和曹文宣，2000），自然分布于雅魯藏布江中上游干支流水體中，是我國特有的高原性魚類，也是西藏地區主要經濟魚類之一，對研究生物地理學、系統演化和營養生理等方面具有極為重要的科學參考價值（He & Chen，2007；Liang et al，2017; 曾本和等，2019）。隨著近幾十年來西藏經濟的快速發展，水利設施建設、外來物種入侵及環境污染等導致拉薩裸裂尻魚資源出現急劇下降的趨勢（楊漢運等，2010；朱挺兵等，2017），拉薩裸裂尻魚已被列入中國脊椎動物紅色名錄（蔣志剛等，2016）。此外，拉薩裸裂尻魚由于生長緩慢、性成熟晚、繁殖力低等特點，其資源一旦遭到破壞，將很難得到恢復（邵儉等，2019）。因此，建立快速、便捷、準確的eDNA檢測方法，對拉薩裸裂尻魚資源狀況進行長期監測，可為其資源保護和管理提供科學依據。本研究在雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地采集魚類和水樣，針對拉薩裸裂尻魚，設計物種特異的Cytb引物和探針，評估其擴增效果，利用ddPCR檢測水樣中eDNA拷貝數，并分析其與物種生物量與豐度之間的相關性。

1? ?材料與方法

1.1? ?樣品采集

2019年在雅魯藏布江中游干流（YJ1～YJ8）、拉魯濕地（LL1～LL10）和茶巴朗濕地（CBL1～CBL5）設置23個樣點（圖1）開展樣本采集工作。使用地籠（開口40 cm×30 cm，長8 m）經10～12 h起捕采集2個濕地的魚類樣本；對于雅魯藏布江的樣點，除了使用地籠之外，還使用三層流刺網（網目2～8 cm，高1.5 m，長20 m）作業0.5 h采集魚類樣本。統計拉薩裸裂尻魚的個體數量和體重，剪取部分個體的一小塊鰭條組織保存在無水乙醇中。用采水器采取上、中、下層混合水樣共1 L，在4 h內用真空抽濾泵和混合纖維濾膜（直徑47 mm，孔徑0.45 μm）對水樣進行抽濾。每個樣點采集3個平行水樣，并設置1個陰性對照。濾膜立即放入2 mL無酶無菌離心管，并置于液氮中保存，直至放入實驗室的超低溫（-80℃）冰箱。每次采集水樣和抽濾之后，利用10%的商用漂白液對采集和抽濾工具進行消毒，并用純凈水沖洗干凈。

1.2? ?eDNA提取

每次實驗前用DNA-off試劑（Takara公司）對實驗用具和實驗桌面進行浸泡和擦拭，3 min后用清水沖洗或濕紙巾擦拭干凈。用DNeasy Blood & Tissue Kits試劑盒（Qiagen公司）提取水樣DNA，實驗步驟按說明書進行。水樣DNA最終用200 μL TE溶液稀釋，并于-20℃條件下保存。

1.3? ?引物和探針設計

在魚類eDNA研究經常使用的線粒體分子標記中，選擇進化速度較快的Cytb基因序列（Zardoya & Meyer，1996）作為分子標記，采用通用引物（F： GRCTTGAARAACCACCGTTGT; R： CGGWTTACAAGACCGRYGCT）（Feng et al，2023）經DNA測序獲得漁具捕撈得到的20種魚Cytb基因序列。為了擴大引物和探針的應用范圍，將分布于雅魯藏布江流域上游或湖泊的尖裸鯉（Oxygymnocypris stewartii）、高原裸鯉（Gymnocypris waddelli）、蘭格湖裸鯉（Gymnocypris chui）和軟刺裸鯉（Gymnocypris dobula）（陳毅峰和曹文宣，2000；朱挺兵等，2017；劉明典等，2020）等4種魚對eDNA檢測的影響也考慮在內，從NCBI數據庫中提取它們的Cytb基因序列。利用MEGA軟件的ClustalW功能（Thompson et al，1994；Tamura et al，2013）對上述24種魚的Cytb基因序列進行線性排列，利用Primer5軟件根據以下原則設計檢測拉薩裸裂尻魚的引物和探針：（1）正反向引物序列與其他23種魚相比至少具有2個堿基的差異；（2）正反向引物及探針序列在種內保守，沒有變異；（3）擴增長度為100～200 bp；（4）其他參照常規引物和探針的設計規則（Rozen & Skaletsky，2000）。

1.4? ?引物擴增效果評估

將拉薩裸裂尻魚的基因組DNA稀釋至1 ng/μL作為模板進行ddPCR，設置53～59℃的退火溫度梯度，用于篩選最佳擴增溫度。反應體系包含2 μL DNA 模板，250 nmol/L上下游引物和150 nmol/L探針，10 μL 2× ddPCR Supermix for Probes（不含 dUTP），并用超純水將反應體系補至20 μL。用微滴生成卡將20 μL反應體系與70 μL微滴生成油（Droplet Generator Oil for Probes）在微滴生成儀中生成微滴。PCR擴增反應在密封的96孔板內進行，反應條件為：95℃預變性10 min；94℃變性30 s，退火1 min，40個循環；98℃保持10 min；4℃保持至拿出。擴增結束后放入微滴讀取儀中，用QuantaSoft軟件讀取結果。

將拉薩裸裂尻魚基因組DNA進行梯度稀釋，稀釋至10、1、0.1、0.01和0.001 ng/μL作為模板進行ddPCR實驗，檢測ddPCR的擴增效率及可檢出的濃度范圍。將捕撈得到的20種魚以及從羊卓雍措采集的高原裸鯉基因組DNA分別稀釋到1 ng/μL作為模板進行ddPCR，檢測ddPCR擴增的物種特異性。

1.5? ?eDNA的ddPCR擴增及數據處理

對每個eDNA樣品進行ddPCR擴增，每個樣品設置3個重復。反應體系和反應條件同上。用QuantaSoft 軟件讀取檢測結果，即ddPCR反應體系中目標DNA拷貝數（copies/μL），根據水樣體積和eDNA的稀釋體積計算每個水樣中拉薩裸裂尻魚Cytb基因片段的拷貝數，計算公式為：

式中：x為ddPCR反應體系中目標DNA拷貝數（copies/μL），y為水樣中目標DNA拷貝數（copies/mL）。利用SPSS軟件分析水樣中eDNA拷貝數與物種生物量和豐度之間的相關性。

2? ?結果與分析

2.1? ?引物和探針

根據種間特異性高、種內保守、擴增子長度適合的原則，在Cytb基因的編碼區914～935 bp和1 067～1 090 bp分別設計了正反向引物（SyCytb-F/R），在編碼區942～964 bp設計了探針（SyCytb-P）。引物和探針序列為：SyCytb-F，5-CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT-3；SyCytb-R， 5-TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG-3；SyCytb-P，5-FAM-ACTAACATTCCGCCCAATCACCC-MGB-3。正向引物、反向引物和探針序列與拉薩裸裂尻魚之間沒有錯配堿基，與尖裸鯉及3種裸鯉（高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉）之間的平均錯配堿基數分別為2.2、1.3和1.0個，與其他19種魚之間的平均錯配堿基數分別為6.8、6.9和3.6個（圖2）。

2.2? ?擴增效果

溫度梯度實驗結果顯示，在退火溫度的梯度范圍內，ddPCR都檢測到有效DNA拷貝數，其中，在56℃時拷貝數達到峰值，因此，將56℃作為ddPCR的最佳退火溫度。濃度梯度實驗結果顯示，在拉薩裸裂尻魚基因組DNA濃度為0.001～1 ng/μL時均可獲得有效DNA拷貝數，當模板DNA濃度為10 ng/μL時，陽性微滴數遠大于陰性微滴數，檢測結果顯示無信號（圖3-a）。DNA拷貝數與DNA濃度之間擬合標準曲線的R2為0.998。物種特異性檢測結果顯示，引物和探針具有物種特異性，僅在拉薩裸裂尻魚和高原裸鯉中獲得熒光信號，在其他19種魚中均未檢出（圖3-b）。因此，當水體中存在尖裸鯉或3種裸鯉時，都可能影響拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測結果，說明本研究的探針和引物不適用于雅魯藏布江流域的湖泊或上游等有其他近緣種（裸鯉屬和裸裂尻魚屬）分布的水體。

2.3? ?eDNA的ddPCR檢測

在陰性對照中，均未檢測出熒光信號。共在14個樣點中檢測出拉薩裸裂尻魚的eDNA，其中，在茶巴朗濕地、拉魯濕地和雅魯藏布江干流中檢測出的樣點數分別為4、4和6個（表1）。在茶巴朗濕地、拉魯濕地和雅魯藏布江干流樣點中檢測出拉薩裸裂尻魚eDNA的拷貝數分別為2.4～6.3、1.9～319.3和1.6～2.3 copies/mL。

2.4? ?eDNA檢測與捕撈結果的比較

將ddPCR檢測與捕撈結果進行比較，結果顯示，70%樣點ddPCR檢測結果與捕撈結果相同，30%樣點中未捕獲但ddPCR檢出，沒有樣點捕獲到但ddPCR未檢出的情況（圖4）。其中，在拉魯濕地各樣點中的檢測結果均相同；在大部分茶巴朗濕地樣點（4/5）及部分雅魯藏布江樣點（3/8）中未捕獲但ddPCR檢出。

總體上，eDNA拷貝數（copies/mL）與物種生物量（g）和豐度（尾）之間均無顯著相關性（表2）。但是，單獨對拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點進行分析，eDNA拷貝數與物種生物量和豐度之間均存在顯著相關性。

在拉魯濕地樣點中，eDNA拷貝數與物種生物量和豐度之間的相關系數分別為0.987（P<0.01）和0.647（P<0.05），擬合線性方程分別為：

式中：y1、y2和x分別為物種生物量和豐度及eDNA拷貝數。

在雅魯藏布江的樣點中，eDNA拷貝數與物種生物量和豐度之間的相關系數分別為0.786和0.756（P<0.05），擬合線性方程分別為：

拉魯濕地樣點的單位質量的eDNA拷貝數[copies/（mL·g）]和單位個體的eDNA拷貝數[copies/（mL·個）]顯著大于雅魯藏布江的樣點。

3? ?討論

對于單一目標物種的eDNA檢測，需要種間特異性高、種內通用性強的擴增引物，否則極易出現假陽性或者假陰性的錯誤結果（高天翔等，2018）。本研究中，拉薩裸裂尻魚的ddPCR引物序列與其他物種之間具有較多的錯配堿基數量，且在其他物種中的擴增沒有熒光信號，但尖裸鯉及3種裸鯉除外，它們的存在會影響拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測。我們對拉薩裸裂尻魚與其他23種魚的線粒體基因組DNA序列進行了比較，發現拉薩裸裂尻魚與尖裸鯉、高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉分別僅有1 240、1 241、1 239和91個差異堿基，而與其他19種魚的差異堿基數為1 551～4 640個（圖5）。基于線粒體DNA及基因組SNP標記的分析表明，裸鯉屬（Gymnocypris）和裸裂尻魚屬（Schizopygopsis）的物種在系統進化關系上不以屬名而以水域形成聚類分支（Tang et al，2019）；DNA條形碼的研究結果也表明，裸鯉屬和裸裂尻魚屬的部分物種共享操作分類單元（OTUs）（Shen et al，2019）。因此，裸鯉屬或裸裂尻魚屬內單一物種的eDNA檢測不可避免地受到裸鯉屬和裸裂尻魚屬其他魚類的影響。但是，對于本研究的樣點區域，拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測結果不受尖裸鯉或其他裸鯉的影響。首先，在所有樣點區域未采集到這些魚類樣本；其次，近期的調查研究表明，尖裸鯉僅在雅魯藏布江仁布以上江段出現（朱挺兵等，2017；劉明典等，2020），且高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉主要分布于湖泊水體中。總之，在使用本研究的ddPCR引物對自然水體的拉薩裸裂尻魚進行分子檢測時，需要考慮尖裸鯉屬、裸鯉屬或裸裂尻魚屬其他魚類的影響。

大量研究表明，與網捕相比，eDNA技術在物種檢測方面具有明顯的優勢（Czeglédi et al，2021）。在本研究中，與網捕相比，基于eDNA的物種檢測同樣有優勢，2種方法在70%樣點中的檢測結果相同；在剩余30%樣點中，均是網捕未捕獲但eDNA檢出的情況，主要體現在茶巴朗濕地和雅魯藏布江的樣點。茶巴朗濕地位于拉薩河附近，雖然水源來源于拉薩河（連接拉薩河的水渠長4 km），但是采樣時未見水渠中有水，在茶巴朗濕地檢測的拉薩裸裂尻魚eDNA來源于拉薩河的可能性較小。茶巴朗濕地是西藏主要土著魚類（包括拉薩裸裂尻魚）的養殖繁育基地，而水樣采于非養殖用途的淺水池塘。在茶巴朗濕地樣點中未捕獲拉薩裸裂尻魚但水樣中檢出其eDNA，說明有2種可能：（1）樣點水體中確實有拉薩裸裂尻魚個體，但由于個體小等原因未能捕獲；（2）樣點水體中沒有拉薩裸裂尻魚個體，目標eDNA來源于臨近養殖池塘的個體。拉薩裸裂尻魚在雅魯藏布江中游干流中分布廣泛（朱挺兵等，2017），通過eDNA幾乎在所有樣點中檢測出其存在，但通過網捕僅在部分樣點采集到其個體，說明eDNA具有更高的檢出率。

大量研究表明，在實驗室條件下，物種的eDNA拷貝數與生物量或豐度之間具有顯著的相關性（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；閆卉果等，2022），但在自然水體中的研究較少。本研究中，總體上，水樣中eDNA拷貝數與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均無顯著相關性；但是，單獨對拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點進行分析，均存在顯著的相關性。研究表明，eDNA檢測易受水體理化性質影響，如溫度、pH、溶解氧、礦化度、水流速度和微生物等（Jane et al，2015；Eichmiller et al，2016；Jo et al，2019）。拉魯濕地和雅魯藏布江樣點的水體在水流速度、溫度[（13.11±1.40）℃ vs（11.48±1.56）℃， P<0.05]、溶解氧[（6.87± 0.8）mg/L vs （7.72±0.29）mg/L， P<0.05]和pH[（9.00±0.53）vs（7.75±0.11）， P<0.01]等方面具有明顯的差異，導致不同水體中拉薩裸裂尻魚eDNA的脫落和降解速度及停留時間都可能存在顯著差異，因此，不能通過eDNA來比較這2個水體中拉薩裸裂尻魚的生物量和豐度。與雅魯藏布江中游干流相比，拉魯濕地的水體流速較緩且各樣點水體理化性質差異較小，這可能是拉魯濕地樣點eDNA拷貝數與生物量之間的相關系數更大，且單位質量eDNA拷貝數更大的主要原因。

4? ?結論

本研究設計了檢測拉薩裸裂尻魚的eDNA特異性高、時效性好、擴增效率高的引物和探針，并利用ddPCR對雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地的水體進行了拉薩裸裂尻魚的檢測。與網捕相比，eDNA技術在物種檢測方面具有更高的檢出率。在拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點中，水樣中eDNA拷貝數與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均具有顯著的相關性。表明eDNA技術是魚類分布和生物量監測的有效方法。但是，eDNA檢測結果易受到近緣物種和水體理化性質的影響，是其不足之處。

志謝：感謝中國科學院水生生物研究所分析測試中心的喬志仙、柴小翠及周園園在實驗中提供的幫助，感謝熊雄副研究員提供環境數據。

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（責任編輯? ?熊美華）

收稿日期：2022-01-12? ? ? 修回日期：2023-08-29

基金項目：第二次青藏高原綜合科學考察研究項目（2019QZKK0304，2019QZKK0501），中國科學院戰略性先導科技專項（XDA2005020403）。

作者簡介：李冰，1996年生，女，碩士研究生，主要從事魚類環境DNA研究。E-mail： 15007195038@163.com

馮秀，1989年生，男，副研究員，主要從事魚類分子生態學研究。E-mail： fengxiu@ihb.ac.cn

通信作者：陳毅峰，男，研究員。E-mail： chenyf@ihb.ac.cn