基于高通量測序分析中草藥對發酵泡菜亞硝酸鹽含量的影響及機制

燕平梅 張聰聰 賈晶晶 趙虎威

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.010

引文格式：燕平梅，張聰聰，賈晶晶，等.基于高通量測序分析中草藥對發酵泡菜亞硝酸鹽含量的影響及機制[J].中國調味品，2024，49（5）：59-64.

YAN P M， ZHANG C C， JIA J J， et al.Analysis of effect and mechanism of Chinese herbal medicine on nitrite content in fermented pickles based on high-throughput sequencing[J].China Condiment，2024，49（5）：59-64.

摘要：為了探究金銀花、黃柏兩種中草藥對發酵泡菜亞硝鹽含量的影響及機制，基于高通量測序技術分析泡菜微生物群落結構，采用分光光度法分析泡菜中亞硝鹽含量。研究結果表明，分別添加5%金銀花和5%黃柏的泡菜中亞硝酸鹽含量（8.02，5.90 mg/kg）均顯著低于對照組（12.87 mg/kg）（P<0.05）。對泡菜樣品進行高通量測序，共得到202個可操作分類單元（OTU），分屬于11個門、129個屬、165個種。添加5%的金銀花和5%黃柏發酵10 d 的泡菜樣品中微生物的Chao 1指數顯著低于對照組（P<0.05）。Proteobacteria（變形菌門）是各個樣品中的優勢菌門，相對含量高達90%。不同中草藥處理的微生物在屬水平上的優勢微生物相對含量相差很大，對照組、添加金銀花的發酵泡菜組、添加黃柏的發酵泡菜組中 Pseudomonas（假單胞菌屬）的相對含量分別為52%、1%、1%；Serratia（沙雷氏菌屬）的相對含量分別為15%、0%、1%；Achromobacter（無色桿菌屬）的相對含量分別為7%、1%、0%。實驗結果表明金銀花和黃柏對發酵白菜中亞硝酸鹽形成的抑制作用是由于其抑制了腸桿菌科（Serratia、Achromobacter）和 Pseudomonas（假單胞菌屬）微生物的生長繁殖。

關鍵詞：高通量測序；發酵泡菜；中草藥；亞硝酸鹽；微生物多樣性

中圖分類號：TS255.54????? 文獻標志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）05-0059-06

Analysis of Effect and Mechanism of Chinese Herbal Medicine on Nitrite

Content in Fermented Pickles Based on High-Throughput Sequencing

YAN Ping-mei， ZHANG Cong-cong， JIA Jing-jing， ZHAO Hu-wei

（Taiyuan Normal University， Taiyuan 030619， China）

Abstract： In order to explore the effect and mechanism of two Chinese herbal medicines， namely honeysuckle and phellodendron， on nitrite content in fermented pickles， the microbial community structure of pickles is analyzed based on high-throughput sequencing technology， and spectrophotometry is used to analyze the nitrite content in pickles. The results show that the nitrite content of pickles added with 5% honeysuckle and 5% phellodendron （8.02， 5.90 mg/kg） is significantly lower than that of the control group （12.87 mg/kg） （P<0.05）. Through high-throughput sequencing of pickle samples， a total of 202 operational taxonomic units （OTU） are obtained， belonging to 11 phyla， 129 genera and 165 species. The Chao 1 index of microorganism in pickle samples added with 5% honeysuckle and 5% phellodendron fermented for 10 d is significantly lower than that of the control group （P<0.05）. Proteobacteria is the dominant phylum in each sample， with the relative content of 90%. The relative content of dominant microorganisms in genus level of microorganisms treated with different Chinese herbal medicines is quite different. The relative content of Pseudomonas in the control group， the pickle sample group added with honeysuckle and the pickle sample group added with phellodendron is? 52%， 1% 1% respectively. The relative content of Serratia is 15%， 0%， 1% respectively. The relative content of Achromobacter is 7%， 1%， 0% respectively. The experimental results show that the inhibitory effect of honeysuckle and phellodendron on the formation of nitrite in fermented Chinese? cabbage is due

收稿日期：2023-12-27

基金項目：國家自然基金委員會面上項目（40871131，31171743）;山西省自然基金面上項目（202303021211119）

作者簡介：燕平梅（1968—），女，教授，博士，研究方向：微生物生態學。

to their inhibition on the growth and reproduction of microorganisms of Enterobacteriaceae （Serratia， Achromobacter） and Pseudomonas.

Key words： high-throughput sequencing; fermented pickles; Chinese herbal medicine; nitrite; microbial diversity

發酵作為一種生物過程現被廣泛用于食物生產和保存[1]。傳統的泡菜利用蔬菜附著的微生物進行發酵[2]，泡菜的制作成本低廉、口感豐富；泡菜有助于提高食欲，促進消化，深受消費者的喜愛[3]，是發酵企業的主要產品。泡菜通過參與發酵的乳酸菌來恢復腸道菌群的平衡，通過各種可能的機制降低膽固醇水平，如同化、酶解或與其他膽鹽共沉淀[4]。

隨著科技的進步和人們認識的提高，傳統發酵食品越來越受到人們的青睞，未來的發酵食品更朝向功能化發展，傳統發酵食品的市場必將更加廣闊，最近幾年，應用于食品發酵的技術已經從手工生產發展到工業生產，以生產出高質量的標準發酵產品。此外，人們對發酵過程的生化背景知識缺乏，導致許多傳統發酵食品存在安全性問題。亞硝酸鹽是一種常見的食品添加劑，用來固定顏色、提高質地、抑制梭狀芽孢桿菌的生長。亞硝酸鹽能引起高鐵血紅蛋白癥，變成亞硝胺的重要前體物質，由叔胺和仲胺的反應產生，存在于日常生活經常攝入的各種食物中[5-6]。無論是人工添加的還是天然存在于食品中的亞硝酸鹽，都是潛在的致癌物，控制它們的濃度對維持食品的安全性至關重要。金銀花享有“國寶一枝花”的美譽，是常見的中藥之一，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽的功能[7-8]。黃柏也是一種具有良好抗菌效果的中藥材，味道較苦，偏寒性。前人研究表明，黃柏在抗炎、抗病毒、消除細菌、維持血壓等方面有顯著效果[9]。本實驗在泡菜中分別加入中草藥（金銀花和黃柏）研究其對泡菜中亞硝酸鹽含量和群落結構的影響。

近年來，新一代高通量測序技術的出現為研究發酵蔬菜微生物群落結構提供了新方法[10]。然而，泡菜發酵過程中微生物群落的演替變化以及微生物群落與亞硝酸鹽形成和降解的關系并不明確。本文應用高通量測序技術研究添加不同中草藥的發酵泡菜中細菌群落結構構成，揭示細菌群落的多樣性，探討添加不同中草藥的發酵泡菜中細菌群落和亞硝酸鹽濃度變化之間的關系，為深入研究泡菜發酵過程中微生物的功能作用奠定了基礎。進一步了解傳統發酵食品的微生物生化背景，明確傳統發酵食品的營養價值和功能性，運用現代科技手段保證其安全性，為人們提供既營養美味又安全可靠的發酵食品。

1? 材料和方法

1.1? 實驗材料

新鮮白菜、金銀花、黃柏、食用鹽、DNA提取試劑盒。

1.2? 實驗儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀? 美國Bio-Rad公司；WFJ2100型可見分光光度計? 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3? 實驗方法

1.3.1? 發酵泡菜的制作和取樣

將新鮮白菜清洗干凈，放置在潔凈工作臺上用紫外線照射數分鐘，切碎成適宜大小后放入經高溫滅菌的錐形瓶中，每瓶30 g，加入90 mL 4%的鹽水，每3個為一組，分別加入5%金銀花和5%黃柏，只加鹽水的為對照組，將所有泡菜放置在室溫（16～20 ℃）下發酵。

發酵泡菜10 d，在經紫外線滅菌過的潔凈工作臺上用鑷子取出一定量的發酵泡菜研磨后進行亞硝酸鹽含量的測定，再取出一定量的發酵液，用于pH檢測和DNA提取。

1.3.2? 亞硝酸鹽含量和pH測定

發酵泡菜中亞硝酸鹽的測定采用鹽酸萘乙二胺法，用分光光度計測量溶液在550 nm處的吸光度值，繪制標準曲線。使用pH211型數顯pH計，待pH計呈現的數字穩定后再進行記錄。

1.3.3? DNA提取和高通量測序

實驗樣品的DNA提取按照DNA提取試劑盒給定的步驟進行。將提取的DNA樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.3.4? 數據分析

按照相似度97%對非重復序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）聚類，最后采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似度的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平上統計每個樣品的群落組成。利用Mothur軟件構建稀釋性曲線，利用 QIIME 軟件計算樣品的Chao 1豐富度指數、Shannon多樣性指數、Simpson指數等。利用Excel軟件繪制群落分布餅圖。利用R語言制作熱圖，主坐標分析圖。

2? 結果與分析

2.1? 添加中草藥的發酵泡菜中亞硝酸鹽含量和pH值

添加中草藥的發酵泡菜中亞硝酸鹽含量見表1。添加5%金銀花和5%黃柏的發酵泡菜發酵10 d時樣品中亞酸鹽含量顯著低于對照組（P<0.05）；在相同發酵時間內，添加5%金銀花的泡菜中亞硝酸鹽含量與添加5%黃柏的泡菜中亞硝酸鹽含量無顯著差異。

添加中草藥的發酵泡菜的pH值見表2。泡菜發酵10 d時，加入5%金銀花和5%黃柏的泡菜發酵液的pH值顯著低于對照組（P<0.05），在相同發酵時間內，添加5%金銀花的泡菜的pH與添加5%黃柏的泡菜的pH無顯著差異。

2.2? 不同中草藥處理的發酵泡菜中微生物稀釋曲線

本次對7個樣品進行高通量測序，共得到332 824條序列，平均序列長度為427.11 bp。OUT數為202個，包括11個門、129個屬、165個種。不同中草藥處理的發酵泡菜中微生物稀釋曲線見圖1，稀釋曲線可以根據測序數據量來反映物種的豐富度，說明測序數據量是否合理，測序深度是否可靠地表現出微生物組成[11]。

由圖1可知，稀釋曲線逐漸趨于平緩，測序數據達到飽和，能夠覆蓋本次測序中絕大部分物種，說明本次測序深度能夠反映出樣品中的細菌含量。

2.3? 微生物群落生態指數

Chao 1和Shannon指數是衡量群落中物種總數和多樣性的常用指數[12-13]。Chao 1值越大表明群落中物種的豐富度越高；而Shannon指數可以反映樣品的多樣性程度，Shannon值越大表明樣品群落多樣性越高。本次研究通過樣品測序序列計算各樣品中多樣性指數，見表3。添加5%黃柏的發酵泡菜發酵10 d時樣品中微生物的Shannon指數顯著低于添加金銀花的樣品和對照組（P<0.05）；添加5%金銀花的泡菜中微生物的Shannon指數與對照組無顯著差異（P＞0.05）。添加5%黃柏的發酵泡菜發酵10 d時樣品中微生物的辛普森指數（Simpson index）顯著高于添加金銀花和對照組（P<0.05）；添加5%金銀花的泡菜中微生物的辛普森指數（Simpson index）與對照組無顯著差異（P＞0.05）。添加5%金銀花和5%黃柏的發酵泡菜發酵10 d時樣品中微生物的Chao 1指數顯著低于對照組（P<0.05）；添加5%金銀花的泡菜中微生物的Chao 1指數與添加5%黃柏的泡菜無顯著差異（P＞0.05）。

2.4? 不同中草藥處理的微生物相對含量

不同中草藥處理的微生物在門水平上的相對含量見圖2，在各個樣品中 Proteobacteria（變形菌門）為優勢菌門，相對含量高達90%。在不添加中草藥的對照組中，微生物主要包括8個門，其中Proteobacteria（變形菌門）的相對含量為92.95%，Actinobacteria（放線菌門）的相對含量為2.9%，Bacteroidetes（擬桿菌門）的相對含量為2.9%，Firmicutes（厚壁菌門）的相對含量為1.19%，Verrucomicrobia（疣微菌門）的相對含量為0.02%，unclassified_k_norank_d_Bacteria的相對含量為0.01%，Acidobacteria（醋桿菌門）的相對含量為0.001%；Planctomycetes（浮霉菌門）的相對含量為0.001%；添加金銀花的發酵泡菜中，微生物主要包括8個門，其中Proteobacteria（變形菌門）的相對含量為97.66%，Actinobacteria（放線菌門）的相對含量為1.89%，Bacteroidetes（擬桿菌門）的相對含量為0.01%，Firmicutes（厚壁菌門）的相對含量為0.44%，Verrucomicrobia（疣微菌門）的相對含量為0.007%，Chloroflexi（綠彎菌門）的相對含量為0.003%，Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）的相對含量為0.003%，Planctomycetes（浮霉菌門）的相對含量為0.001%，添加黃柏的發酵蔬菜中，微生物主要包括7個門，其中Proteobacteria（變形菌門）的相對含量為99.38%，Actinobacteria（放線菌門）的相對含量為0.11%，Bacteroidetes（擬桿菌門）的相對含量為0.01%，Firmicutes（厚壁菌門）的相對含量為0.49%，Chloroflexi（綠彎菌門）的相對含量為0.001%，Acidobacteria（醋桿菌門）的相對含量為0.002%，Tenericutes（軟壁菌門）的相對含量為0.003%。不同中草藥處理的發酵泡菜的優勢菌門均為Proteobacteria（變形菌門），Firmicutes（厚壁菌門）的相對含量較少。

不同中草藥處理的微生物在屬水平上的優勢微生物的相對含量見圖3～圖5。

由圖3～圖5可知，在屬水平上，不同中草藥處理的發酵泡菜中細菌多樣性差異較大。 Stenotrophomonas（寡養食單胞菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Serratia（沙雷氏菌屬）、Acinetobacter（不動桿菌屬）、Achromobacter（無色桿菌屬）、Lelliottia（河生腸桿菌）為優勢屬。不同處理的泡菜中優勢菌的相對含量相差很大，對照組、添加金銀花的發酵泡菜、添加黃柏的發酵泡菜中Stenotrophomonas（寡養食單胞菌屬）的相對含量分別為15%、25%、58%；Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）的相對含量分別為3%、51%、19%；Pseudomonas（假單胞菌屬）的相對含量分別為52%、1%、1%；Serratia（沙雷氏菌屬）的相對含量分別為15%、0%、1%；Acinetobacter（不動桿菌屬）的相對含量分別為4%、3%、3%；Achromobacter（無色桿菌屬）的相對含量分別為7%、0%、1%；Lelliottia（河生腸桿菌）的相對含量分別為5%、1%、3%。另外，對照組中檢出Raoultella（勞特菌屬）4%；添加金銀花的發酵泡菜中檢出Marinomonas（海單胞菌屬）5%;添加黃柏的發酵泡菜組中檢出Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌）4%、Ochrobactrum（蒼白桿菌屬）5%。

2.5? 不同中草藥處理微生物熱圖

不同中草藥處理的微生物多樣性熱圖見圖6，熱圖的不同顏色代表不同的豐度，圖中一個色塊代表一個樣品中一個屬的豐度，縱向是樣品的聚類情況，反映不同樣品在屬水平上群落組成的相似性，顏色差異反映群落組成的差異性。HB-2所含微生物屬最少，優勢菌群為假單胞菌屬，其他樣品均含有Weissella（魏斯氏菌屬），Leuconostoc（明串珠菌屬）是引起發酵的主要菌屬，且在含金銀花的樣品中顏色較深，豐度較大。在不添加中草藥的對照組（CK）中所含物種最豐富，細菌多樣性最高。添加中草藥后，微生物之間競爭更加激烈，一些在泡菜體系中適應能力較其他微生物弱的微生物被淘汰，適應性強的微生物在后期發揮主要作用，這可能是添加中草藥的發酵泡菜中細菌多樣性較少的原因。

3? 討論

添加不同中草藥成分對泡菜中亞硝酸鹽含量有很大影響，劉芳等[14]研究黃芪、黨參、當歸這3種中草藥的復合水煎液對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響，結果表明，不同濃度的中草藥水煎液對亞硝酸鹽都有比較明顯的削減效果。本實驗研究了加入5%金銀花和5%黃柏對發酵泡菜中亞硝酸鹽含量的影響，結果表明，在相同發酵時間內，添加不同濃度的金銀花和黃柏的泡菜中亞硝酸鹽含量都顯著低于對照組，表明金銀花和黃柏對泡菜中亞硝酸鹽含量有明顯的削減作用，此結果與劉芳等的研究結果一致。

高通量測序分析不同中草藥處理的微生物在屬水平上的優勢微生物的相對含量相差很大，對照組、添加金銀花的發酵泡菜組、添加黃柏的發酵泡菜組中 Pseudomonas（假單胞菌屬）的相對含量分別為52%、1%、1%；Serratia（沙雷氏菌屬）的相對含量分別為15%、0%、1%；Achromobacter（無色桿菌屬）的相對含量分別為7%、0%、1%。Serratia（沙雷氏菌屬）和Achromobacter（無色桿菌屬）屬于腸桿菌科。腸桿菌科和 Pseudomonas（假單胞菌屬）是蔬菜發酵初期促使亞硝酸鹽形成的主要微生物[15]。添加金銀花和黃柏的發酵泡菜中Pseudomonas（假單胞菌屬）的相對含量（1%、1%）明顯低于對照組（52%）；腸桿菌科（Serratia，0%、1%）和Achromobacter（0%、1%）的相對含量明顯低于對照組（15%、7%），表明金銀花和黃柏對發酵泡菜中亞硝酸鹽形成的抑制作用是由于其抑制了促使亞硝酸鹽形成的腸桿菌科和Pseudomonas（假單胞菌屬）微生物的生長繁殖。

通過高通量測序技術對添加不同中草藥的發酵泡菜中細菌群落結構特征進行分析，結果表明添加5%金銀花和5%黃柏的發酵泡菜發酵10 d時樣品中微生物的 Chao 1指數顯著低于對照組（P<0.05）。造成此結果的原因可能是金銀花和黃柏對多種致病菌均有一定的抑制作用。研究表明，金銀花中的綠原酸和黃酮類物質含量均較多，對病原菌有較強的抑制作用[16]，研究表明，金銀花對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等均有一定的抑制作用[17]，黃柏在抗炎、消除細菌、抗病毒、維持血壓等方面能起到特有的效果[18]，對變形桿菌、金黃色葡萄球菌以及甲型和乙型鏈球菌等均有抑制效果[19-20]，可能是金銀花和黃柏中的有效成分抑制了發酵過程中有些細菌的生長，導致細菌的豐富度減少。

通過傳統分離培養方法，一些泡菜發酵過程中的關鍵微生物種類得到解析，包括明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）等[21-24]。在本次實驗中也發現明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）的相對含量均很低。與取樣時間有關，泡菜實驗在室溫（16～20 ℃）下發酵10 d取樣時處于發酵初期。由于發酵初期除乳酸菌外的大量雜菌繁殖，影響了乳酸菌成為優勢菌。

高欣等[25]的研究表明加入大蒜可以降低亞硝酸鹽的含量，加入常見的綿白糖[26]、白酒[27]和花椒[28]等均可以降低發酵泡菜的亞硝酸鹽含量，在泡菜腌制過程中，適當地加入某一種或多種調味料，不僅可以滿足人們對風味的需求，而且能夠提高產品的安全性。中國中草藥資源豐富，食用歷史悠久，未來可結合抗菌中草藥的研究，在泡菜中添加天然中草藥，提高泡菜的安全性，同時增加泡菜的營養價值。

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