桑屬植物葉綠體基因組特征比較及系統發育分析

張浩蓉 禿玉翔 李啟少 曹正英 趙文植 沈偉祥 孫正海

張浩蓉，禿玉翔，李啟少，等. 桑屬植物葉綠體基因組特征比較及系統發育分析［J］. 江蘇農業科學，2024，52（7）：34-40.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.005

=（西南林業大學園林園藝學院/國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心，云南昆明? 650224）

摘要：探究桑屬葉綠體基因組特征及該屬物種的系統發育進化關系。收集8種桑屬植物葉綠體基因序列，基于最大似然法重建桑屬植物系統發育關系，并運用生物信息學手段進行葉綠體基因組特征分析。桑樹葉綠體基因組結構為典型的四段式結構，大單拷貝區長89 952 bp，小單拷貝區長 20 149 bp，2個反向重復區長25 751 bp。共檢測到 661個SSR位點，包含480個單核苷酸位點、57個二核苷酸位點、25個三核苷酸位點、82個四核苷酸位點、16個五核苷酸位點、1個六核苷酸位點，堿基組成以A/T堿基類型為主，平均GC含量為36.2%。變異度在前3位的間隔區依次是[WTBX][STBX] psbl-trnS（GCU）-trnG（UCC）、 rps4-trnT（UGU）-trnL（UAA）、rp132-trnL（UAG）。[WTBZ][STBZ]桑屬樹種的葉綠體基因組相對較大，且序列穩定，變異主要發生在 LSC 區。相較于基因編碼區，桑屬植物的基因非編碼區更容易積累突變。桑與蒙桑具有較近的親緣關系，其次是華桑與吉隆桑。

關鍵詞：桑屬；葉綠體基因組；特征；系統發育

中圖分類號：S888.2? 文獻標志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0034-07

桑屬（Morus L.）隸屬于桑科（Moraceae），為灌木植物或喬木植物，速生且長壽。桑屬植物分布于中國、朝鮮、日本、尼泊爾、印度等國海拔700 m左右的石灰巖山地及貧瘠土地［1］，具有一定的觀賞價值［2］和重要的經濟價值［3-4］。[JP2]桑樹韌皮纖維是紙張的重要來源，桑果既可熟食亦可生食，桑葉可以用來飼養桑蠶，樹皮是提取桑色素的重要原料［5］，莖干通直而結構細密，不易變形和開裂，是一種優良木材［6］。

葉綠體是普遍存在于陸地植物中的一種半自主型細胞器，能進行光合作用［7］。自 1986 年基于地錢和香煙植物的葉綠體基因組首次進行測序和分析后［8］，學界開始探索分析葉綠體基因組的結構和特征。大多數植物的葉綠體基因組是2條鏈呈圈狀的DNA分子，另外還有線形狀、D環狀、套索狀及其他形狀［9-10］。植物種類不同，其基因組的大小也不同，但總體上為120～160 kb［11］。葉綠體基因組具有相對較低的進化速率，結構簡單，序列保守，遺傳重組率低；而且，其獨立的進化路線可以不依賴其他數據進行建樹，這為探尋植物復雜的種間親緣關系奠定了基礎［12-13］。隨著2代、3代測序技術的進步成熟和測序成本的降低，已有香花枇杷［14］、華山松［15］、杜梨［16］、蠟梅［17］、蘋果［18］、蓮［19］等許多植物的葉綠體基因組被報道，這為后期進一步對相關植物葉綠體基因組學基因功能及遺傳改良的研究奠定了基礎。目前對桑屬植物葉綠體基因組方面的研究相對較少。李巧麗對魯桑的葉綠體基因組結構及系統進化關系進行探索，發現魯桑和蒙桑的親緣關系較近［20］。武越基于 ITS 序列和4個葉綠體 DNA 片段（trnL-F、trnT-L、trnD-T、psbE-petG）分析桑屬植物系統進化關系，發現在桑屬中存在致同進化不完全現象［21］。然而他們并未對樸桑、非洲桑、雞桑等其他桑屬植物的葉綠體基因組特征和系統發育關系進行分析。

本研究基于生物信息學手段，利用桑屬植物8個種的序列進行葉綠體基因組特征分析，同時利用葉綠體基因組重建桑屬系統發育關系，解析桑屬物種間的親緣關系，旨在為后續開展桑屬物種的分子標記開發、遺傳背景分析、種質資源保護、系統發育進化等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

對NCBI 數據庫中所有桑屬物種的葉綠體全基因組序列進行篩選，收集已公布的桑（Morus alba）、蒙桑（M. mongolica）、吉隆桑（M. serrata）、華桑（M. cathayana）、印度桑（M. indica）、樸桑（M. celtidifolia）、非洲桑（M. mesozygia）、雞桑（M. australis）等桑屬植物 8 個種的葉綠體基因組序列用于分析。選擇在?？苾扰c桑屬植物親緣關系較近的構樹（Broussonetia papyrifera，MW465959）、無花果（Ficus carica，KY635880）作為構建系統發育樹的外類群。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體基因組序列比對 為在葉綠體基因組水平上判別桑屬植物，上傳桑屬植物8 個種的葉綠體基因組序列比對工具 mVISTA（http：//genome.lbl.gov/vista/index.shtml），運用該工具中的 LAGAN 程序進行葉綠體基因組解析［22］，該程序可以直觀地顯示整體序列的相似性和變異區，參數設置默認值［23］。

1.2.2 簡單重復序列 利用MISA perl腳本對8個桑屬物種的葉綠體基因組中的簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）進行計算。單核苷酸（mononucleotide，mono-）重復閾值設置為 10，二核苷酸（dinucleotide，di-）重復閾值設置為 5，三核苷酸（trinucleotide，tri-）重復閾值設置為 4，四核苷酸（tetranucleotide，tetra-）、五核苷酸（pentanucleotide，penta-）、六核苷酸（hexanucleotide）的重復閾值分別設置為 3、3、3［20］。

1.2.3 IR區邊界的收縮與擴張 以樸桑的葉綠體基因序列為參考，于 GeSeq 在線網站（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）注釋其余7個桑屬植物葉綠體基因序列。注釋好的葉綠體基因序列上傳到IRscope（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）在線軟件，分析葉綠體結構的四大分區［24-25］。

1.2.4 高變區篩選 基于 MAFFT 軟件對8個桑屬葉綠體基因組序列進行比對，然后使用 DnaSP v6 軟件［26］對桑屬植物葉綠體基因組序列進行核苷酸多態性（Pi值）分析。參數窗口長度設置為600 bp，每步滑行大小設置為200 bp。

1.2.5 系統發育關系 將桑屬植物 8 個種的葉綠體序列于MAFFT在線網站中比對后，以構樹、無花果為外類群，構建系統發育樹［21］。將比對后的序列矩陣使用Geneious軟件轉化成phy格式文件，然后將phy文件放入IQ-tree軟件中計算核苷酸取代模型，計算得到最優模型：TVM+F+I+G4，在IQ-tree程序中使用最大似然法重建系統發育關系［27-28］。使用UFBoot2重復1 000個bootstrap折疊近零分支［29-30］。系統發育分析結果于Figtree v1.4.3 軟件進行查看和美化［31］。當支持率大于 90% 時認為 ML 支持率較好，低于 50% 則認為是不可信數據［32］。

2 結果與分析

2.1 桑屬8個種葉綠體基因組基本信息

由表1可知，桑屬植物的葉綠體基因組具有典型的環狀 DNA 分子特征，且為保守的四分體結構，基因組總長度在 159 218～160 014 bp，其中最大的為非洲桑，最小的為印度桑。大單拷貝區（LSC）為 88 003～88 803 bp，小單拷貝區（SSC）為 19 797～ 19 870 bp，反向重復區（IR）為 25 678～25 693 bp。8種桑屬植物葉綠體基因組GC含量范圍為 36.0%～36.2%。[JP]共包含126～133個基因，除去重復的蛋白編碼基因外，其余物種蛋白編碼基因數量一致；轉錄RNA的基因數量樸桑為36個，其余均為37個；核糖體RNA基因數量穩定在8個。

2.2 桑屬植物序列差異性分析

運用mVISTA軟件比對，結果表明，桑屬葉綠體基因的變異程度較低，編碼序列大多有很高的相似性（ycf 類基因不包括在內），且大部分突變在非編碼區產生。 LSC、SSC 區的變異度明顯高于 rRNA 類基因所在的 IR 區，且基因間隔區的變異度高于基因內含子區，如psbl-trnS（GCU）-trnG（UCC）、rps4-trnT（UGU）-trnL（UAA）、rp132-trnL（UAG）等（圖1）。

2.3 桑屬植物簡單重復序列分析

利用MISA 軟件進行簡單重復序列分析。共檢測到 661 個潛在的 SSRs，其中單核核苷酸480個、二核苷酸57個、三核苷酸25個、四核苷酸82個、五核苷酸16個、六核苷酸1個，僅在樸桑中檢測到。這些潛在的SSRs大部分為單核核苷酸，所占比例為72.62%，主要堿基為 A/T 堿基；其次是四核核苷酸，占比 12.41%，主要堿基為AAAT/ATTT；占比最少的是六核核苷酸，僅有 0.15%（表2、圖2）。

2.4 桑屬植物 IR 區邊界分析

8個桑樹 IR 區的長度在 25 678 bp（印度桑）～25 693 bp（非洲桑）之間（圖3）。位于LSC與IRb邊界處的基因為rps19，基因總長度為279 bp。在8個桑樹葉綠體基因組中，基因均位于LSC區域，且距離IRb區域的長度僅有1 bp的差異?；騳cf1橫跨 SSC/IRa 邊界，IR 區的不完整拷貝使得ycf1基因成為一個假基因（ψ）。桑屬不同種的ycf1基因一部分（5 600～5 639 bp）均延伸至 IRa 區域，基因長度基本一致。然而桑屬不同物種ycf1基因橫跨 SSC區、IRa區的長度不同，桑、蒙桑、華桑、吉隆桑、印度桑、雞桑在SSC區、IRa區的長度一致，分別為4 638、1 001 bp，余下的非洲桑、樸桑在SSC區和IRa區的長度分別為4 604、4 639 bp、996～991 bp。 [JP+2]在SSC/IRb邊界處， 8[JP]個桑屬物種葉綠體基因組的ycf1基因均橫跨SSC、IRb 區。但是樹種不同，基因在SSC、IRb 區的長度存在差異。桑、蒙桑、華桑、吉隆桑、印度桑、雞桑在 SSC、IRb 區的長度一致，分別為 80、1 002 bp，而非洲桑、樸桑在SSC和IRb區的長度分別為11、91 bp和996、991 bp。8個桑屬物種之間ycf1基因在 IRa、IRb 區域的拷貝數不同?；騮rnH與邊界SSC/IRa距離，除了非洲桑為31 bp外，其余樹種均為 22 bp。

2.5 桑屬8個種核苷酸多態性分析

DnaSP 6軟件篩選結果表明，桑屬植物的核苷酸多態性值（Pi）在 0～0.020 95之間，平均值為 0.002 753（圖4）。當Pi＞0.01 時，檢測到的3個高變區分別是psbl-trnS（GCU）-trnG（UCC）、rps4-trnT（UGU）-trnL（UAA）、rp132-trnL（UAG）；其中，高變區 psbl-trnS（GCU）-trnG（UCC）、rps4-trnT（UGU）-trnL（UAA）位于 LSC 區，而rp132-trnL（UAG）位于 SSC 區。

2.6 系統發育關系分析

如圖5所示，8個桑屬植物很好地聚為一支（BS=100），第1個分化出來為國外種非洲桑（BS=100），其次為樸桑（BS=100），其余6個桑屬物種則是在較短時間內分化成為2個亞支（BS=100）；其中桑、蒙桑、雞桑、吉隆桑、華桑聚成一支（BS=100），另一支只包含印度桑（BS=100）。桑、蒙桑、雞桑形成一個單系進化支， 吉隆桑、華桑聚成一支，互為姐妹類群（BS=93），親緣關系較近。絕大多數進化支的支持率都很高， 僅吉隆桑和華桑的進化支支持率較低（BS=60）。

3 討論

對 8 個桑屬物種進行葉綠體基因組特征分析，桑屬植物均具有典型的四分體結構，基因組大小相近，介于 159 218～160 014 bp，總長收縮擴張不超過 1 kb，與之前報道的植物葉綠體基因組序列全長低至 114 914 bp、 高至 217 942 bp［33-34］相符合； 且基因個數和基因種類也大致相同，這再次證明葉綠體基因組具有高度保守的特性［35-36］。8個桑屬植物IR區的差異整體較小，長度大多為 25 690 bp，與之前報道的絕大多數被子植物的IR/LSC范圍較為保守，其IR區毗鄰IR/LSC邊界的位置往往會存在1個[WTBX][STBX]rpl22[WTBZ][STBZ]或者[WTBX][STBX]trnH-rps19[WTBZ][STBZ]基因簇［37-38］相符合。但非洲桑的IR區長了3 bp，樸桑、印度桑分別短了4、12 bp。IR區邊界的收縮與擴張通常伴隨著植物的進化，造成葉綠體基因組間的大小差異［39-40，41］。從系統發育樹上可以看出，物種分化先后依次是非洲桑、樸桑、印度桑，但并不能得出“IR區越長，物種分化越靠前，約有可能為基部類群”的結論。物種間葉綠體基因組序列全長變化主要與IR區有關［42-43］。樸桑的IR區比桑的短4 bp，而樸桑的葉綠體基因組長度卻比桑的長了至少195 bp，IR 區長度相同的5個桑屬物種的葉綠體基因組長度也有差異。早在棗樹和鴨跖草亞綱物種中就報道了由 IR 區收縮引起的葉綠體基因組長度的類似變化［44］。蒙桑、桑的葉綠體基因組 SSC、IR區大小一致，僅在LSC區相差1 bp，推測蒙?？赡苁巧５淖兎N［45］。

對桑屬植物8個種的葉綠體基因組序列進行mVISTA 分析發現，該屬植物葉綠體全基因組序列變異較小，這與李巧麗等用4個桑屬樹種探究的結果［20］一致，說明桑屬不同物種的葉綠體基因組序列保守。核苷酸多態性分析結果與 mVISTA結果一致，在IR區的Pi值為0.004 58，其序列核苷酸的變異程度明顯低于LSC區（Pi值為0.013 33）、SSC區（Pi值為0.020 95）。這與大多數植物葉綠體基因組序列分析結果［46-47］一致，突變主要發生在LSC區、SSC區。8個桑屬樹種葉綠體基因組中Pi＞0.01，鑒定出3個可變區 psbl-trnS（GCU）-trnG（UCC）、ps4-trnT（UGU）-trnL（UAA）、rp132-trnL（UAG）。其中 trnS-trnG、rpl32-trnL 基因座曾被報道為種子植物中的高度可變區域［48-49］，這一高度可變的區域也位于LSC 區、SSC 區。此外，8個桑屬植物的葉綠體基因中共發現 661個SSRs標記。SSRs標記多分布在LSC區，主要由堿基A、T組成，與葉綠體基因組序列中SSRs主要由poly A、poly T所構成的結論［50-51］相互驗證。然對mVISTA 分析、核苷酸多態性分析、簡單重復序列分析共同得出結果突變主要發生在LSC區、SSC區之間的聯系還需要進一步研究［52］。所檢測到的重復序列可為桑屬及?？破渌参颯SRs標記的開發提供理論依據，也可為桑屬植物的分子遺傳相關研究提供候選標記。

基于桑屬葉綠體基因組，運用最大似然法，通過 IQ-tree 軟件重建發育關系。非洲桑作為基部類群最先被分化出來，與甄攀等基于ITS序列構建系統發育樹得出非洲桑是目前發現的最古老桑樹種的結論［4］相符合。桑樹種很好地形成了一個單系進化支，再次印證了Zhao等利用ITS、trnL-F序列進行系統發育分析得出的桑屬的單系起源性［53］。同為野生種的華桑、吉隆?；榻忝妙惾旱年P系，也得到文言的研究［54］支持。

4 結論

本研究對桑屬物種葉綠體基因組特征和系統發育關系進行探究。桑屬物種葉綠體基因組序列長度為159 218～160 014 bp。桑、蒙桑葉綠體基因組的SSRs標記數量相同，且主要由A/T堿基組成。共檢測到[WTBX][STBX]psbl-trnS（GCU）-trnG（UCC）、rps4-trnT（UGU）-trnL（UAA）、rp132-trnL（UAG） [WTBZ][STBZ]共3個高變區域，這些高變區域可作為桑屬植物DNA條形碼的候選片段。華桑與吉隆桑，蒙桑與桑、雞桑分別互為姐妹類群。研究結果可為進一步對桑屬植物葉綠體基因組基因的功能進行分析以及遺傳改良等提供理論參考。

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基金項目：云南省科技人才與平臺計劃（編號：202205AF150022）；西南林業大學科研預研基金。

作者簡介：張浩蓉（1998—），女，云南昆明人，碩士研究生，主要從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail：zhr23122x@163.com。

通信作者：孫正海，博士，教授，主要從事園林植物遺傳育種與分子生物學研究。E-mail：szh@swfu.edu.cn。