微小核糖核酸對包蟲病患者免疫細胞功能的調控作用研究進展

王宇琦，達哇卓瑪，樊海寧，2，劉川川，2

1 青海大學附屬醫院肝膽胰外科，西寧 810001；2 青海省包蟲病重點實驗室；3 青海大學高原醫學研究中心

棘球蚴病俗稱包蟲病，是由棘球絳蟲的幼蟲寄生于人體或家畜等動物體內引起的人獸共患寄生蟲病，可分為囊型包蟲病（CE）和泡型包蟲病（AE）［1］。包蟲病的早期階段無明顯癥狀，直到病灶生長并擴散到全身各個器官才會表現出相應并發癥［2］。人體的免疫細胞根據功能可分為固有免疫細胞和特異性免疫細胞，固有免疫細胞包括中性粒細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等，特異性免疫細胞包括T淋巴細胞和B淋巴細胞。先天免疫可通過模式識別受體（PRRs）識別病原體相關模式分子（PAMPs），并通過宿主防御機制來調節免疫反應，當包蟲病處于感染階段時，寄生蟲能夠刺激宿主Th2型保護性免疫反應［3-4］。微小核糖核酸（miRNAs）是一類小型非編碼RNA分子，可在轉錄后以序列特異性方式，通過抑制或促進mRNA降解參與調節基因表達及相關生物學過程［5］。宿主感染棘球蚴絳蟲后，棘球絳蟲自身蛋白和miRNAs能轉移到宿主細胞中，引起多種miRNAs表達改變并參與宿主的免疫調節過程［6］。因此，miRNAs或許是棘球絳蟲與宿主相互作用的關鍵調控環節［7］。本研究對宿主感染棘球絳蟲過程中影響單核巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞的相關miRNAs進行總結，為探討miRNAs對包蟲病患者免疫功能的影響提供依據。

1 miRNAs對包蟲病患者單核巨噬細胞功能的調控作用

1.1 miR-71 miR-71能夠在感染線蟲或血吸蟲宿主的血清、血漿及淋巴液中被檢測到，且線蟲外泌體中的miR-71能夠被宿主細胞內化并釋放到宿主細胞內發揮免疫調節作用［8］。miR-71也作用于多房棘絳蟲原頭節，Nemo樣激酶基因（Nlk）是miR-71的靶點，與miR-71結合可導致其表達被抑制，表明miR-71可能影響了包蟲病的發展過程［9］。此外，AE來源的miR-71參與調節小鼠單核巨噬細胞的免疫過程［8］。一氧化氮（NO）參與調節棘球絳蟲感染后免疫抑制，同時可以抑制寄生蟲的感染，這使得NO能夠在包蟲病發病早期發揮重要作用［6］。研究顯示，與轉染陰性對照質粒的小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）相比，miR-71模擬物轉染后的RAW264.7細胞IL-10表達沒有明顯變化，但其在12 h后NO表達受到抑制［9］。此外，一些寄生蟲提取物能夠抑制單核巨噬細胞釋放NO［10］。張永娥等［11］研究顯示，在多房棘球蚴感染小鼠的過程中，miR-71是由外泌體攜帶并釋放到宿主體內，進而被單核巨噬細胞內化；miR-71過表達能下調白細胞介素（IL）-1α、IL-1β、IL-4、IL-6等細胞因子表達，并調節LPS/TLR4信號通路，從而影響單核巨噬細胞的免疫功能。

1.2 miR-4989-3p miR-4989屬于miR-277家族。通過高通量測序可以確認多房棘球絳蟲中有18種特異性miRNAs差異表達，而miR-let-7-5p、miR-10-5p、miR-71-5p和miR-4989-3p在細胞外囊泡中含量豐富［8］。DING等［8］研究顯示，在多房棘球絳蟲細胞外囊泡中miR-4989、miR-4989-3p表達高于miR-4989-5p［12］。NO是影響棘球蚴感染的關鍵因素，多房棘球絳蟲細胞外囊泡能夠抑制NO分泌［13］。在活化的單核巨噬細胞中，miR-4989-3p能夠抑制NO分泌，并且存在于多房棘球絳蟲的細胞外囊泡中。研究顯示，RAW264.7單核巨噬細胞中的miR-4989-3p能夠調節NO表達及LPS/TLR4信號通路，這提示miR-4989-3p在多房棘球絳蟲的發病中占據主要作用［14］。此外，miR-4989-3p過表達能夠升高促炎因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達，表明miR-4989-3p有激活炎癥的作用。

1.3 miR-222-3p 多房棘球絳蟲能夠影響宿主小鼠肝臟和血清中的miRNAs表達，其中血清、單核巨噬細胞及脾臟中的miR-222-3p均表達下調［14-15］。單核巨噬細胞與多房棘球絳蟲原頭節體外共同培養時，miR-222-3p能夠持續在單核巨噬細胞中表達［16］。在轉染miR-222-3p抑制劑的單核巨噬細胞中，miR-222-3p表達降低，導致NO分泌減少，但一氧化氮合酶（iNOS）表達升高［17］。轉染miR-222-3p抑制劑后，單核巨噬細胞LPS/TLR4信號通路中有4個關鍵基因表達降低，而CD14、Toll樣受體家族4（TLRs4）和TICAM2表達均上調［18］。因此，下調miR-222-3p能夠通過調節NO分泌及LPS/TLR4信號通路來影響單核巨噬細胞的免疫功能，從而影響包蟲病的進展。

1.4 miR-155-5p miR-155-5p和miR-146a-5p是免疫反應和炎癥反應的共同調節因子，而miR-155-5p優先在免疫細胞中表達［19］。GUO等［20］將miR-155-5p模擬物轉染到感染多房棘球絳蟲小鼠的腹腔單核巨噬細胞中，結果顯示會引起單核巨噬細胞miR-155-5p、iNOS mRNA及NO表達升高，提示miR-155-5p對單核巨噬細胞具有免疫調節作用。NF-κB轉錄因子是細胞因子和趨化因子基因轉錄的主要調控因子，而轉染miR-155-5p后的單核巨噬細胞NF-κB表達升高、CD14表達降低，這表明miR-155-5p能夠通過NF-κB來調節炎癥因子的表達［20-21］。因此，miR-155-5p能夠參與單核巨噬細胞的免疫調節作用，在調節宿主對多房棘球絳蟲感染的免疫反應中發揮作用。

1.5 miR-146a-5p 在感染多房棘球絳蟲后，小鼠外周血清miR-146a-5p表達升高［22］。楊靜等［23］研究顯示，轉染miR-146a-5p模擬物的小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7中TLR4、CD14表達均升高，但是促炎因子IL-1α、IL-1β、IL-12β表達均降低，轉染后第24、36 h的NO表達升高，而轉染miR-146a-5p抑制劑的RAW264.7則出現相反的表現。因此，miR-146a-5p對小鼠單核巨噬細胞分泌的細胞因子具有免疫調節作用，可能是其影響包蟲病進展的原因之一。

2 miRNAs對包蟲病患者樹突狀細胞功能的調控作用

CE是由細粒棘球絳蟲幼蟲引起的一種嚴重寄生蟲病，細粒棘球絳蟲能夠通過免疫調節因子來逃避宿主的免疫反應，最新研究顯示免疫調節機制可能與樹突狀細胞有關［24］。細粒棘球絳蟲能夠調節樹突狀細胞成熟，并通過改變單核細胞分化，逃避宿主的免疫監控，從而促進感染［25］。樹突狀細胞能夠激活T淋巴細胞，而線蟲、多房棘球絳蟲在感染的過程中能夠誘導T淋巴細胞和樹突狀細胞的產生，從而抑制T淋巴細胞增殖和分化［15］。在宿主感染細粒棘球絳蟲的早期，宿主可通過促進樹突狀細胞的產生幫助殺死寄生蟲。細粒棘球絳蟲的分泌產物能夠誘導樹突狀細胞產生免疫耐受，從而損害宿主的免疫反應。研究顯示，在小鼠感染細粒棘球絳蟲6、9、12個月后，其肝臟組織中的樹突狀細胞比例均升高［26］。

小鼠骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）能夠內化細粒棘球絳蟲原頭節來源的細胞外囊泡（PSCELVs），并將miRNAs轉運到BMDCs內，而PSCELVs能夠促進BMDCs的分化和成熟從而誘導Th1型免疫反應［24］。miR-277a-3p被證實是PSC-ELVs中含量最豐富的miRNAs之一［16］。PSC-ELVs的miR-277a-3p能夠促進BMDCs釋放炎癥因子，如IL-6、IL-12、TNF-α等，同時miR-277a-3p能夠直接結合核因子κB1（NF-κB1）的3′非翻譯區（UTR），從而抑制BMDCs中NF-κB1 mRNA和蛋白表達［24］。此外，miR-277a-3p模擬物能夠上調BMDCs中的IL-6、IL-12和TNF-α mRNA表達量，降低IL-10表達，具有明顯的促炎特性［24］。因此，miR-277a-3p能夠誘導BMDCs表達炎癥因子，并影響BMDCs的分化和成熟，從而發揮治療包蟲病的作用。

3 miRNAs對包蟲病患者T淋巴細胞功能的調控作用

3.1 miR-374b-5p 細粒棘球絳蟲會引發機體發生免疫反應，主要是由于輔助性T淋巴細胞（Th細胞，主要包括Th1細胞和Th2細胞）比例失調所導致的［1］。目前研究表明，以Th1細胞為主的免疫反應大多跟棘球絳蟲有關，而占據主導地位的Th2細胞則大多與AE相關［27］。LI等［28］研究發現，miR-374b-5p過表達可導致干擾素γ（IFN-γ）、IL-2和IL-17表達升高，從而促進Th1、Th17分化。IL-10是miR-374b-5p的潛在靶基因，并與包蟲病感染相關［29］。多房棘球絳蟲通過上調免疫抑制因子（主要是IL-10和TGF-β）來調控宿主免疫反應，而低水平的IL-10會影響多房棘球絳蟲的生長［30］。此外，Th1和Th17細胞免疫應答增強與IL-10 mRNA表達降低和miR-374b-5p表達升高均有關［28］。因此，miR-374b-5p可能通過負調控IL-10表達而影響T淋巴細胞功能，從而影響包蟲病的進展。

3.2 miR-126a-5p 重組Eg.P29（rEg.P29）具有免疫保護作用，能夠誘導Th1細胞免疫應答。研究顯示，在rEg.P29免疫保護包蟲病小鼠1周后，脾CD4＋T淋巴細胞miR-126a-5p表達升高、DLK1表達降低，而Notch1信號通路活性及Th1細胞免疫應答增強，提示miR-126a-5p可能在rEg.P29免疫保護下參與了CD4＋T淋巴細胞向Th1細胞的分化過程［31］。因此，miR-126a-5p可能通過下調DLK1對Notch1介導的CD4＋T淋巴細胞向Th1的分化起到正向調節作用，或許是診斷CE的潛在血清生物標志物之一。

4 miRNAs對包蟲病患者自然殺傷細胞功能的調控作用

自然殺傷細胞在宿主抵抗病原體、介導抗腫瘤方面發揮重要作用。成熟的自然殺傷細胞能夠在不同情況下被激活，自然殺傷細胞與其他免疫細胞有著復雜的相互作用。LEONG等［32］研究發現，在自然殺傷細胞中IFN-γ的發育受到多種miRNAs調節，包括miR-181a-5p、miR-155、miR-150、miR-181和miR-29等，其中miR-181a-5p能夠抑制自然殺傷細胞在體內的發育和成熟，并且影響小鼠和人自然殺傷細胞產生IFN-γ［33］。仲順虎等［34］研究發現，在感染多房棘球小鼠的脾淋巴細胞中，miR-181a-5p表達下調，這或許能夠通過幫助自然殺傷細胞發育，來提高宿主的自身抵抗力，從而對抗包蟲病的感染。

綜上所述，在包蟲病患者的感染過程中，miR-71、miR-4989-3p、miR-222-3p、miR-155-5p、miR-146a-5p可影響單核巨噬細胞功能，miR-277a-3p能夠影響樹突狀細胞功能，miR-374b-5p、miR-126a-5p可影響T淋巴細胞功能，miR-181a-5p能夠影響自然殺傷細胞功能，上述miRNAs通過影響患者的免疫細胞及其功能而參與免疫調節。但目前還有很多miRNAs的功能和機制尚未得到證實，需要我們使用更先進的方法來確定有效的miRNAs及其功能，以便為包蟲病的早期診斷和治療提供新靶點及理論依據。