轉錄組學技術在肺動脈高壓發生發展及診治中的應用進展

孟英，肖根發

1 贛南醫科大學第一臨床學院，江西贛州 341001；2 贛南醫科大學第一附屬醫院心血管內科；3 贛南醫科大學心腦血管疾病防治教育部重點實驗室

肺動脈高壓（PAH）是一種慢性進行性疾病，具有高病死率，其病理生理學改變主要是肺血管重構，該過程涉及肺血管內皮細胞（PVECs）增生、肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）過度增殖和遷移、外膜成纖維細胞增生以及細胞外基質沉積等［1］。隨著對PAH研究的深入，目前研究發現炎癥免疫反應也與PAH的發病密切相關［2］。這些病理生理學異常改變會促使肺動脈管壁增厚、管腔狹窄，進而引起肺血管阻力增加、肺動脈壓持續升高，最終導致右心室擴張、右心功能衰竭甚至死亡。右心導管檢查是診斷PAH的金標準，但其具有有創性，存在檢查風險大、患者依從性差及短時間不能重復檢查等缺點。近年來，靶向治療已應用于PAH的治療，但患者預后仍然較差。轉錄組是指特定組織或細胞在某一發育階段或功能狀態下轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA，是連接基因組遺傳信息與蛋白質組生物功能之間的紐帶。轉錄組學能夠揭示基因在特定生理或病理狀態下的表達水平和模式，從而深入了解基因在生物體內的功能和調控機制。目前，轉錄組學的研究方法主要包括基于雜交的基因芯片技術（又稱為DNA微陣列，DNA microarray）和轉錄組測序（RNA-seq）。隨著高通量測序技術的進步和成本的降低，RNA-seq逐漸取代傳統DNA microarray，廣泛應用于分子生物學研究［3］。本研究對與PAH發生發展及診治有關的轉錄組學相關研究作一綜述，為探討PAH的發病機制、診斷及治療提供依據。

1 轉錄組學技術在PAH發病中的應用

1.1 轉錄組學技術在肺動脈血管重構中的應用

1.1.1 轉錄組學技術在PVECs功能障礙中的應用 PVECs功能障礙會引起血管重構，是導致PAH發生的關鍵［4］。首先，內皮細胞（EC）位于血管最內層，直接接受血流沖擊和各種致病因素的刺激，從而誘導EC增殖能力及通透性升高，并通過分泌各種因子引起炎癥和免疫細胞募集，激活細胞凋亡抵抗［5-6］。其次，PVECs功能失調可引起上皮—間質轉化（EMT），該過程是以內皮細胞喪失功能并獲得間充質細胞表型（如平滑肌細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞樣細胞）為特點［7］。2015年，GU等［8］首次通過DNA microarray的方法比較了慢性血栓栓塞性PAH（CTEPH）患者與健康對照人群PVECs中的lncRNA、mRNA表達譜，并構建了lncRNA-mRNA共表達網絡；結果顯示，與健康對照人群相比，CTEPH患者PVECs中有185個lncRNA表達異常，其中差異最大的4個lncRNA分別是NR_036693、NR_027783、NR_033766和NR_001284，這些異常的lncRNA可能是與CTEPH發生發展相關基因的激活物或抑制物。

RODOR等［9］對SU5416/缺氧誘導的PAH小鼠和正常對照小鼠肺EC進行了單細胞轉錄組測序分析，結果發現了222個差異表達基因；同時，該研究對PVECs進行了RNA-seq分析，結果發現CD74表達上調與MHC-Ⅱ基因有關，CD74/MHC-Ⅱ復合物參與了PAH的形成過程，且CD74敲低可以影響PVECs的增殖和屏障功能，為PAH潛在候選治療藥物的開發提供了新靶點。HE等［10］對缺氧性肺動脈高壓（HPH）誘導后的小鼠肺部EC亞群進行轉錄組測序分析，結果篩選出羥基前列腺素脫氫酶（Hpgd）、Npr3和Fbln2三個關鍵基因，最終選擇Hpgd進行后續驗證；通過對人肺動脈內皮細胞（hPVECs）進行不同時間的缺氧處理發現，Hpgd表達呈時間依賴性降低。因此，臨床上可以通過監測hPVECs中Hpgd表達情況，以此反映PAH病情，并用于指導后續治療。最近研究發現，糖酵解蛋白烯醇酸酶1（ENO1）可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路參與PAH的血管重構。SHI等［11］采用RNA-seq篩選出缺氧處理后PVECs的差異表達基因，并使用ENO1抑制劑恢復了缺氧誘導的PVECs功能障礙，提示靶向抑制ENO1過表達可改善PAH的血管重構，有希望成為新的PAH治療靶點。MONTEIRO等［12］同樣通過RNA-seq發現PTBP1通過介導lncRNA_MIR503HG在EMT中發揮作用，從而參與PAH的肺血管重構。因此，PVECs功能紊亂在PAH的早期發病過程中起著至關重要的作用，深入了解PVECs在肺血管重塑中的作用對于PAH的預防、診斷及治療均具有重要意義。

1.1.2 轉錄組學技術在PASMCs增殖、遷移中的應用 PASMCs過度增殖和遷移所引起的肺血管重構是PAH發生的中心環節［1］。近年來有研究通過DNA microarray發現，在缺氧條件下過表達尿路上皮癌相關1基因（UCA1）與生長抑制因子家族成員5（ING5），可通過競爭人異質性細胞核核糖核蛋白Ⅰ（hnRNPⅠ）來促進原代肺動脈平滑肌細胞（HPASMCs）增殖，并抑制細胞凋亡，最終導致PAH進展［13］。一項關于lncRNA數據的研究顯示，缺氧暴露的PASMCs中lncRNA-MALAT1表達升高，并可能是受到HIF-1α的調控，敲低MALAT1可抑制PASMCs體外增殖和遷移，減輕PAH小鼠的右心室肥厚［14］。LUO等［15］通過RNA-seq檢測了正常和HPH大鼠的差異表達mRNA，結果顯示二氧化硫（SO2）通過Dkk1/Wnt信號通路抑制PASMCs的增殖和遷移，從而減輕缺氧誘導的肺小動脈重構。此外，有研究對18例IPAH患者和17例健康對照人群的肺動脈血管進行轉錄組測序，結果發現IPAH患者PASMCs和成纖維細胞中PAX相互作用蛋白1反義RNA1（PAXIP1-AS1）表達異常；PAXIP1-AS1可通過靶向調節細胞骨架蛋白paxillin表達和磷酸化，從而調節PASMCs增殖、遷移和細胞凋亡抵抗［16］。ZHENG等［17］對野百合堿（MCT）誘導的PAH大鼠進行了單細胞RNA測序，結果篩選出PVECs、PASMCs、成纖維細胞、巨噬細胞、NK細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞（Tregs）中差異表達的N6-甲基腺苷RNA甲基化（m6A）調節因子，提示m6A調節因子參與了PAH的發生發展，可能是PAH診斷和治療的生物標志物之一。LV等［18］分析了常氧和缺氧條件下PVECs、PASMCs和周圍細胞（PCs）中的lncRNA轉錄組表達譜，結果顯示在缺氧條件下lncRNA牛磺酸上調基因1（TUG1）在PASMCs、PCs中表達升高，而在PVECs中表達降低；生物信息學分析結果顯示，lncRNA-TUG1可能通過靶向調節miR-145-5p，促進PASMCs的增殖和遷移，并抑制細胞凋亡，從而加速肺血管重構。WANG等［19］研究發現，PAH患者和HPH小鼠肺血管中TUG1高表達，TUG1敲低可阻止PAH的進一步發展。環狀RNA（circRNAs）可以調節各種生物過程，包括細胞增殖過程。SUN等［20］采用RNA-seq篩選出與HPH相關的circRNA和靶基因，結果表明circ-Grm1通過RNA結合蛋白FUS蛋白抑制Grm1表達，從而促進PASMCs的增殖和遷移，參與PAH的發生發展。因此，臨床上可以通過靶向調節PASMCs中的相關基因表達來逆轉PAH的血管重構。

1.2 轉錄組學技術在肺組織炎癥免疫中的應用肺部血管周圍炎癥反應程度與肺血管重構密切相關，故炎癥細胞在PAH的發生發展過程中至關重要。XIAO等［21］采用RNA-seq分析了MCT誘導的PAH大鼠肺組織基因表達譜，結果顯示炎癥因子Svop、Ercel、Erfe、Dlk1、ccl1、ccl2、ccl20表達上調，并提出失調的炎癥/免疫和神經活性配體—受體相互作用可能參與了PAH的發生發展。AREG是編碼雙調蛋白的關鍵內皮因子，AREG/EGFR軸參與了許多炎癥疾病的發病。有研究對PAH小鼠PVECs的全轉錄組測序進行分析發現，AREG及其受體EGFR在EC中表達缺失，引起PAH中炎癥細胞募集，導致肺血管重構［22］。ZHANG等［23］通過對肺組織轉錄組的生物信息學分析顯示，miR-483靶向調節多個與PAH相關的炎癥基因，包括轉化生長因子β（TGF-β）、TGF-β受體2（TGFBR2）、β-catenin、結締組織生長因子（CTGF）、白細胞介素1β（IL-1β）和內皮素1（ET-1）等，提示miR-483可能成為治療PAH的新靶點。

1.3 轉錄組學技術在PAH導致右心功能衰竭中的應用 在PAH引起右心功能衰竭的過程中，早期心室因代償而肥厚，晚期因失代償而發生衰竭。右心功能衰竭是影響PAH預后的決定因素，盡管目前針對肺血管的治療已使PAH導致右心功能衰竭患者的癥狀有所改善，但患者生存率仍然較低［24］。研究發現，EMT通路和CTGF蛋白在PAH引起右心功能衰竭的過程中活性升高［25］。salubrinal是一種小分子，可以阻止真核翻譯起始因子2α（peIF2α）去磷酸化，從而延長細胞壽命。HE等［26］通過RNA-seq分析大鼠基因表達變化，結果顯示peIF2α去磷酸化抑制劑salubrinal可以預防和逆轉PAH導致的右心功能衰竭。上述轉錄組學相關研究有助于更好地了解PAH導致右心功能衰竭的分子機制，并為其治療提供新的靶點。

2 轉錄組學技術在PAH診治中的應用

2.1 轉錄組學技術在PAH診斷中的應用 目前臨床上常用的PAH診斷方法是超聲心動圖和右心導管檢查。既往研究發現，超聲心動圖診斷PAH的敏感度和特異度均不高，分別為90%、75%。右心導管檢查是診斷PAH的金標準，但其具有有創性，不能成為常規篩查方法。隨著越來越多的研究試圖揭示PAH的發病機制，與以往的生化指標和炎癥因子相比，轉錄組學相關生物標志物的特異性更高。WANG等［27］運用DNA microarray技術發現HPH小鼠具有23個上調的circRNA和41個下調的circRNA，其中表達上調的hsa cric-004592和hsa cric-018351有望成為PAH早期診斷的生物標志物。一項研究對359例特發性、遺傳性和藥物性相關的PAH患者和健康對照人群的全血細胞進行了RNA測序，結果篩選出了507個差異表達基因，在模型中驗證發現25個差異表達基因診斷PAH的敏感性為87%；并提出PAH的全血RNA特征與疾病嚴重程度相關，其中SMAD5表達降低可能會增加PAH的易感性，而SMAD5是TGF-β家族細胞質內重要的信號轉導分子，提示SMAD5是PAH相關藥物開發的潛在靶標［28］。PARK等［29］對PAH大鼠肺組織進行全轉錄組測序發現，68Ga-NOTA-MSA PET可以通過對巨噬細胞浸潤肺部的程度進行成像，并以此幫助診斷PAH、監測炎癥程度，有可能成為診斷PAH的新型指標。胰島素樣生長因子結合蛋白2（IGFBP2）是胰島素樣生長因子家族的重要成員，有研究采用RNAseq檢測肺PASMCs和PVECs中的IGFBP2 mRNA表達情況，結果顯示IGFBP2蛋白是由PASMCs分泌，并且在PAH肺組織中表達升高，與PAH嚴重程度和病死率密切相關，其診斷PAH的受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.76，是診斷PAH的潛在標志物之一［30］。此外，XU等［31］收集了26例CTEPH患者和35例健康志愿者的全血樣本，并提取RNA來構建文庫，結果顯示LINC00472、PIK3R6、SCN3A、TCL6診斷CTEPH的AUC分別為0.964、0.893、0.750、0.732。因此，轉錄組學可以為PAH的診斷提供有效的生物學標志物。

2.2 轉錄組學技術在PAH治療中的應用 目前，臨床上對于PAH的治療主要通過靶向藥抑制內皮素途徑、增強前列環素（PGI2）和磷酸二酯酶5抑制劑途徑來糾正內皮細胞功能障礙，從而改善癥狀和提高患者生存率［32］。同時，隨著關于PAH發病機制的轉錄組學研究不斷深入，一些新的治療靶點逐漸被發現。基質細胞衍生因子1（SDF1）是一種參與炎癥浸潤和血管生成的趨化因子，而PAH小鼠血管壁細胞（平滑肌細胞和周細胞的統稱）中的SDF1與血管肌肉化有關，靶向調節血管壁細胞中的SDF1表達有助于預防和（或）逆轉PAH病程，是PAH的新型治療靶點［33］。此外，芳香烴受體（AHR）是一種核受體/轉錄因子，可解除外源性物質，并調節各種免疫細胞的分化和功能。MASAKI等［34］研究發現，PAH中炎癥細胞浸潤以AHR依賴性的方式而發揮作用。因此，AHR在PAH的發生發展中起著至關重要的作用，可能會成為治療PAH的一個有效靶點。

綜上所述，轉錄組學能夠全面揭示基因在生物體內的功能和調控機制，不僅可以參與揭示PAH的發生發展機制，還可以為其診治提供新的特異性診斷標志物和潛在的治療靶點，對提高患者的生存質量以及改善預后具有重要作用。