溫度對雞胚成纖維細胞UMNSAH/DF- 1 的影響

張雨晴，夏 晴（并列一作），喻 峰，吳 軍*

（中國科學院分子細胞科學卓越創新中心(生物化學與細胞生物學研究所)中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，上海）

細胞培養技術在生物醫學研究領域中扮演著至關重要的角色，為科學家們提供了一個可控制、可重復、且具有高度可變性的體外實驗平臺[1]。在這個背景下，雞胚成纖維細胞UMNSAH/DF-1 作為一種重要的細胞系，已在禽流感病毒和其他禽源病毒的研究中展現出其獨特的應用價值，儼然已經成為禽源病毒學研究、疫苗開發以及宿主細胞反應等領域的理想工具[2-4]。

近年來，隨著對禽流感等禽類病毒感染機制和生物學特性深入研究的需求不斷增加，UMNSAH/DF-1 細胞的使用也逐漸受到廣泛認可。但是UMNSAH/DF-1 細胞在運輸過程中容易受到外界溫度波動的影響，在溫度變化的條件下或外界溫度較低時，UMNSAH/DF-1 細胞可能會出現大量“空泡化”現象，即細胞內形成較多空泡，這可能與溫度對細胞膜的滲透性和細胞器的功能有關，通常被視為細胞發生異常或受到一些刺激時的一種響應[5-6]。

溫度對于細胞培養來說是一個關鍵的環境因素，會直接影響到細胞的生長、代謝和功能。而細胞培養的最佳溫度則是由多個因素綜合影響來決定。不同種類、不同來源的細胞對于生長的最適溫度有所不同。但一般而言，禽類動物細胞在培養過程中常在溫度為39 ℃左右的條件下表現出較好的生長特性，UMNSAH/DF-1 細胞可能也不例外。本文旨在通過系統性的實驗研究，比較不同溫度下培養對UMNSAH/DF-1 細胞生長及“空泡化”程度的影響，同時通過模擬活細胞株常溫運輸環境來探究改善UMNSAH/DF-1 細胞生長狀態及減少其胞體“空泡化“現象的方法，以期為未來疫苗研發、抗病毒治療和基礎研究提供更為可靠的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雞胚成纖維細胞UMNSAH/DF-1 來自于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（目錄號：GNO30）；DMEM 培養基、胎牛血清FBS、胰酶、雙抗購于賽默飛世爾科技公司；PBS、DMSO 購于國藥控股股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞傳代及顯微拍照

當UMNSAH/DF-1 細胞融合率達到80%以上時進行1：2 傳代處理。棄去舊培養基，加1～2 ml 的0.25%胰酶于培養瓶中，置于39 ℃培養箱中消化2～3 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加3～6 mL 完全培養基終止消化。輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出至離心管，離心（1 000 rpm，5 min）。棄去上清液，加1～3 mL 完全培養基重懸。將重懸后細胞懸液轉移至兩個新的T25 培養瓶中，補充新的完全培養基至8～10 mL/瓶，將兩瓶搖勻后UMNSAH/DF-1 細胞分別置于37℃、39 ℃二氧化碳培養箱中觀察培養。當細胞培養至第24 h、48 h、72 h、4 天時鏡下觀察細胞形態并顯微拍照。

1.2.2 細胞換液

提前將DMEM 完全培養液（含10% FBS）、PBS 置于37 ℃水浴鍋中進行預熱。從二氧化碳培養箱中取出培養瓶，顯微鏡下觀察細胞狀態。吸出舊培養基，加入2～3 mL D-PBS 緩慢清洗細胞2 遍以去除殘余培養基。加入5～8 mL 事先預熱好的DMEM 完全培養液，分別將細胞移至37 ℃與39 ℃二氧化碳培養箱中繼續觀察培養。

1.2.3 模擬活細胞株常溫運輸環境

將生長狀態良好且處于對數生長期的UMNSAH/DF-1 細胞灌滿新鮮的DMEM 完全培養液（含10%FBS）至T25 培養瓶頸部（保留微量空氣），擰緊瓶蓋且通過封口膜密封瓶口。將細胞置于室溫中（10 ℃～25 ℃）分別放置0 天、1 天、2 天、4 天后顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。將室溫放置4 天且胞體出現大量“空泡”的UMNSAH/DF-1 細胞進行1：2 傳代處理，之后將傳代后的細胞移至39 ℃二氧化碳培養箱中靜置培養。當細胞培養至第24 h、48 h 時顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

2 結果與討論

2.1 不同溫度下培養對UMNSAH/DF-1 細胞生長及“空泡化”的影響

為了比較不同的培養溫度對UMNSAH/DF-1 細胞生長狀態及“空泡化”現象的影響，我們將等量傳代的2瓶UMNSAH/DF-1 細胞（T25 培養瓶）分別置于37 ℃與39 ℃恒溫二氧化碳培養箱中觀察培養。結果發現溫度對UMNSAH/DF-1 細胞株的生理狀態和胞體“空泡”的數量具有顯著影響。相較于37 ℃，39 ℃的培養溫度更適合UMNSAH/DF-1 細胞的生長，同時也可顯著減少UMNSAH/DF-1 細胞胞體“空泡”的產生（如圖1 顯示），細胞狀態較好。

圖1 比較37 ℃與39 ℃培養時UMNSAH/DF-1 細胞的生長狀態及“空泡化”程度

2.2 探究常溫運輸對UMNSAH/DF-1 細胞生長及“空泡化”的影響

通過模擬活細胞株常溫運輸環境(溫度曲線如圖2所示)，分別將灌滿與未灌滿新鮮完全培養液的UMNSAH/DF-1 細胞置于室溫環境中（10 ℃～25 ℃）分別放置0 天、1 天、2 天、4 天后觀察UMNSAH/DF-1 細胞生長狀態及“空泡化”程度。結果顯示：當灌滿完全培養液的UMNSAH/DF-1 細胞常溫放置1～2 天時，開始出現部分未完全貼壁且透亮的圓細胞（屬正常現象），同時貼壁的UMNSAH/DF-1 細胞胞體也開始出現少量“空泡”化現象（如圖3b，3c 顯示）。常溫放置至第4 天時，UMNSAH/DF-1 胞體“空泡化”現象顯著增加（如圖3d 顯示）。而未灌滿完全培養液的UMNSAH/DF-1 細胞從第2 天開始細胞增殖顯著減少，細胞狀態相較于灌滿培養液組較差（如圖3f-3h 顯示）。

圖2 模擬活細胞株常溫運輸的環境實時溫度曲線（天）

圖3 探究常溫放置0 天、1 天、2 天、4 天時灌滿完全培養液（圖3a-3d）與未灌滿完全培養液（圖3e-3h）對MNSAH/DF-1 細胞生長狀態及“空泡化”程度的影響

2.3 探究傳代培養對UMNSAH/DF-1 細胞生長及“空泡化”的影響

當發現室溫放置4 天后的UMNSAH/DF-1 細胞胞體開始出現大量的“空泡”時，我們嘗試將該細胞進行正常傳代后置于39 ℃二氧化碳培養箱中繼續觀察培養，結果發現：UMNSAH/DF-1 細胞內的“空泡”數量又會顯著減少，且隨著細胞傳代次數的增加UMNSAH/DF-1 細胞生長狀態也逐漸恢復正常，不影響后續實驗的擴增培養（如圖4 顯示）。由此可見：將UMNSAH/DF-1 細胞置于室溫放置時間越長，胞體“空泡化”現象越顯著，嚴重時可直接影響細胞后續的生長狀態，而傳代培養對UMNSAH/DF-1 細胞出現大量“空泡化”現象后具有明顯的改善效果。

圖4 探究傳代培養對MNSAH/DF-1 細胞生長狀態及“空泡化”程度的影響

3 結論

從實驗結果來看，生長溫度下對UMNSAH/DF-1 細胞的生長狀態及“空泡化”程度的影響非常顯著。相較于37 ℃，39 ℃的培養溫度更有利于UMNSAH/DF-1 細胞的生長，同時也可顯著減少UMNSAH/DF-1 細胞胞體“空泡化”現象的發生。而通過常溫運輸UMNSAH/DF-1活細胞時，UMNSAH/DF-1 細胞在室溫環境中放置的時間越久，其胞體“空泡化”現象就會越明顯，且灌滿完全培養液后進行運輸的活細胞株狀態相較于未灌滿培養液組來說細胞生長狀態會更好。但是將產生大量“空泡”的UMNSAH/DF-1 細胞進行正常傳代培養后，其胞體“空泡”的數量又會顯著減少，且隨著細胞傳代次數的增加，UMNSAH/DF-1 細胞又會逐漸恢復至其正常的生長狀態。總之，我們的實驗結果表明：相較于37 ℃，39 ℃的生長溫度與傳代培養可顯著改善UMNSAH/DF-1 細胞生長狀態及“空泡化”程度。UMNSAH/DF-1 細胞在常溫運輸過程中也更容易受到溫度波動的影響，溫度過低時細胞胞體會產生大量的空泡。但是將收到的UMNSAH/DF-1 細胞進行正常傳代處理后細胞就會逐漸恢復至其正常狀態。